مقالة منهجية

التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

DOI:

10.3791/54690

⸱

ديسمبر 14, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Microbiology & Immunology, Weill Cornell Medical College, 2Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

charcoal agar resazurin assay (CARA) هي طريقة شبه كمية متوسطة الإنتاجية لتقييم نشاط عوامل الاختبار ضد البكتيريا الفطرية التي تتكاثر أو لا تتكاثر أو كليهما. يسمح CARA بالتقييم السريع للنشاط المعتمد على الوقت والتركيز ويحدد المعلمات التي يجب متابعتها بواسطة فحوصات وحدة تشكيل المستعمرة (CFU).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك حاجة ملحة لاكتشاف والتقدم مكافحة العدوى أن تقصير مدة السل (TB) العلاج. المتفطرة السلية، العامل المسبب للمرض السل، هو صهر للعلاج الكيميائي السريع ودائم بسبب وجود عصيات العارضة المقاومة للأدوية المظهرية. ج harcoal في غار ص esazurin على ssay (كارا) تم تطويره كأداة لتشخيص الجزيئات النشطة التي اكتشفها حملات التحري الإنتاجية العالية ضد تكرار وتكرار غير-م السل. إدراج الفحم المنشط في وسط أجار باكتريولوجي يساعد على التخفيف من تأثير مركب المرحل، ويلغي شرط لمرحلة ما قبل تمييع الخلايا قبل اكتشاف على كارا microplates. بعد فترة حضانة 7-10 يوم عند 37 درجة مئوية، والحد من ريسازورين التي كتبها microcolonies الفطرية تنمو على سطح الآبار صفيحة كارا يسمح شبه الكمي ASSEssment أعداد البكتيريا عن طريق التألق. وكارا يكشف ما يقرب من 2-3 سجل 10 الفرق في أرقام البكتيرية وتتوقع تركيز مبيد للجراثيم الحد الأدنى مما يؤدي إلى ≥99٪ قتل البكتيريا (MBC ≥99). وكارا يساعد على تحديد ما إذا كان جزيء نشط على عصيات التي يتم تكرار وعدم تكرار، أو كليهما. التجارب الرائدة باستخدام كارا تسهيل تحديد أي تركيز وكيل الاختبار ووقت التعرض مركب يتطلب مزيدا من التقييم من قبل مستعمرة تشكيل وحدة (كفو) المقايسات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للكارا التكهن بما اذا كان نشاطا تكرار هي جراثيم أو جراثيم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المتفطرة السلية، العامل المسبب للمرض السل، ويمكن البقاء على قيد الحياة في مضيف في حالة كامنة الذي هو صهر في القضاء على المضادات الحيوية. ويعتقد المظهرية (غير وراثية) مقاومة السل م خلال العدوى أن ذلك يعود، في جزء منه، إلى السكان من عصيات غير تكرار 1،2. الطبقة صوامد أنا التي تظهر مقاومة المخدرات المظهرية تنشأ عن طريق آليات العشوائية نادرة بين أعداد كبيرة من الخلايا الحساسة للمخدرات 3،4. يتم تقديم الدرجة الثانية صوامد عدم تكرار من قبل عوامل مناعة المضيف، بما في ذلك الضغوط الخارجية في microenvironments اجه خلال العدوى. وضعنا مؤخرا نموذجا في المختبر من الدرجة الثانية غير تكرار استمرار لتقليد الظروف التي تواجه M. السل في الضامة وحبيبية تفعيلها. نموذج متعدد الإجهاد من الدرجة الثانية استمرار يتضمن الشروط التي بطء النمو، مثل مصدر الكربون الأحماض الدهنية، ونصف تمامانمو تي، مثل حموضة خفيفة (الرقم الهيدروجيني 5.0)، نقص الأكسجة (1٪ O 2)، وأكسيد النتريك وغيرها من السلع الوسيطة النيتروجين التفاعلي 5-9. فحص على نطاق واسع استخدام هذا النموذج متعدد الإجهاد عدم تكرارها، وغيرها من الدرجة الثانية نماذج غير تكرار، قد حقق الجزيئات المتنوعة التي توجه ضد الدولة غير تكرار-5-7،9-18 النشاط. وكشف نفس الشاشات غير تكرار أيضا فئة من الجزيئات التي تمتلك النشاط ضد كل من تكرار وغير تكرار العصيات، ويطلق عليه "نشاطا المزدوجة" 7،10،12،19،20.

اكتشاف دواء مضاد للجراثيم في مرحلة الكر والرصاص ينطوي توصيف واسعة من الجزيئات مرشح أن يختار يؤدي لتوسيع ضرب، وتوصيف الصيدلانية الأولي، تحديد الهدف، وفي الدراسات المجراة فعالية الأولية. وكخطوة مبكرة، تصنف مضادات العدوى عن طريق آلية للجراثيم أو جراثيم عملها، وإذا كان للجراثيم، ثقتل البكتيريا hether هو زمني و / أو تعتمد على التركيز. مقايسة مستعمرة تشكيل وحدة (كفو) هو الكلاسيكية، والذهب الطريقة القياسية لمعالجة هذه المسائل. في مقايسة كفو، تتعرض البكتيريا إلى وكيل الاختبار، وبعد ذلك يتم إزالة قسامات، تخفيفه بشكل متسلسل، وتنتشر aliquots من التخفيفات في المتوسط ​​باكتريولوجي صلب وحضنت للسماح نمو الخلايا على قيد الحياة. وأخيرا، يتم تعداد المستعمرات البكتيرية. فحص كفو يتطلب أعدادا كبيرة من صفيحة معايرة دقيقة لتمييع الخلايا وبيتري لوحات تحتوي على أجار تعداد المستعمرات الباقين على قيد الحياة. ويعوق فحص كفو لبطء المتفطرات متزايد من قبل وقتهم بطيئة جيل (18-24 ساعة)، الأمر الذي يتطلب ما يقرب من 3 أسابيع للمستعمرات لتظهر على لوحات. وعلاوة على ذلك، مساحة حاضنة غالبا ما تكون محدودة في مجال السلامة الأحيائية على مستوى 3 مرافق متخصصة.

في حين مرهقة، المقايسات كفو هي المعيار الذهبي لتوصيف تأثير عدم تكرار وثنائية نشطة الجزيئات على mycobacterI ل. غير تكرار المقايسات تخضع لارتفاع معدلات إيجابية كاذبة تقترن إلى تكرار فحوصات لتقييم الخلوي 6-8 الجدوى العديد من. على سبيل المثال، أن المجمع قد النشاط قوية ضد تكرار السل م (أ "تكرار نشطة") قد تفشل لقتل أثناء الفحص غير تكرار، ولكن يمكن أن لا تزال تقتل بحكم المرحل من مرحلة غير تكرار لل فحص لمرحلة الانتعاش من الفحص، التي تجري في ظل الظروف التي تدعم التكرار ( "تكرار الظروف"). مركب تحمل أكثر يزيد من تعقيد تحليل الجزيئات النشطة المزدوجة، مما يجعل من الصعب التمييز بين ما إذا كان النشاط تقلد وعدم تكرار، أو المزدوجة.

لمعالجة القضايا المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير ج harcoal في غار ص esazurin على ssay (كارا) ل، تعداد شبه الكمي السريع الأنواع المتفطرات مثل M. tuberculعمليات التفتيش الموقعي، M. البقرية BCG، وم اللخنية 7 (الشكلان 1 و 2). في المحاليل في المختبر، والفحم المنشط تعزل بسرعة أكثر من الأدوية القياسية المستخدمة لعلاج السل 7. الفحم المنشط في كارا microplates يربط المركبات التي يمكن أن تحمل أكثر من صفيحة الفحص، وهذه سمة من سمات كارا يلغي شرط لتمييع متسلسل محتويات فحص جيدا قبل تعداد 7،21،22. ويقدر عدد microcolonies الفطرية على سطح أجار من كارا microplates بإضافة ريسازورين، صبغة زرقاء، الذي شكل انخفاض، resorufin، هو جزيء الوردي الذي يقاس من قبل القياس الطيفي 23 مضان. كارا microplates يتم تحضين لمدة 1-2 أيام لاللخنية م و7-10 أيام لالمتفطرات بطيئة النمو مثل السل م و م البقرية BCG. وكارا لديها مجموعة ديناميكية الضيق ~ 2-3 سجل 10 زراعية مختلفةrence في هراري. عندما تستخدم بدلا من فحص كفو، وصفيحة كارا واحد يحل محل ما يقرب من خمس لوحات 96-جيدا تستخدم لالتخفيفات المتسلسلة ولوحات أجار على غرار ثلاثي 120 المستخدمة في الطلاء. تفسير البيانات CARA يساعد على توجيه الدراسات اللاحقة التي حضانة مرات وتركيز مركب تحديد لاختبار في المقايسات أكثر شاقة أساس كفو.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد كارا Microplates

  1. الأوتوكلاف 900 مل من ميدلبروك 7H11 أجار التي تحتوي على 0.2٪ الجلسرين و 0.4٪ الفحم المنشط في 2 L دورق مخروطي، أو بدلا من ذلك، 450 مل في دورق زجاج 1 لتر. تشمل بقضيب autoclavable كبير في قارورة أو دورق. تغطية افتتاح قارورة أو دورق بورق الألمنيوم ونعلق على الزجاج مع شريط الأوتوكلاف.
  2. بارد للمس (حوالي 55-65 درجة مئوية) على لوحة تحريك مغناطيسي وضعت في سرعة منخفضة للحفاظ على الفحم في تعليق.
  3. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة جو معقم و مطهر في غطاء السلامة الأحيائية الذي يحتوي على لوحة تحريك مغناطيسي.
  4. إزالة احباط. إضافة 100 مل ملحق OADC (ملحق OADC، عندما تستخدم بنسبة 10٪، والمحاصيل تركيز وسائل الإعلام النهائية من 0.2٪ سكر العنب، و 0.5٪ الزلال، 0.085٪ كلوريد الصوديوم، حمض الأوليك 0.0005٪، و 0.4 ملغ / مل الكاتلاز) إلى قارورة 2 لتر مخروطي ، أو 50 مل OADC إلى الدورق 1 لتر، ويستمر الخلط.
  5. إذا باستخدام قارورة مخروطي، صب حوالي 25-40 مل من 7H11-OADC-الفحم في خزان كاشف العقيمة. إذا باستخدام الدورق، فإنه ليس من الضروري استخدام خزان كاشف.
  6. ملء صفيحة 96-جيدا مع 200 ميكرولتر جيدا / من 7H11-OADC-الفحم من الخزان كاشف أو الكأس. العمل بسرعة لتجنب التصلب أجار وإدخال الفقاعات. تجنب الرش خارج متوسطة صلبة من الآبار، والتي يمكن أن تكون مصدرا للتلوث الفطرية. باستخدام ماصة الأقنية، واستخدام مجموعة واحدة من 12 مرشح نصائح لنقل 7H11-OADC-الفحم إلى 8 صفوف (ه) من لوحة 96-جيدا.
    ملاحظة: والمتوسطة يتصلب بسرعة. لتجنب انسداد نصائح ماصة، تغييرها بشكل متكرر.
  7. بدلا من ذلك، صب كارا microplates باستخدام ماصة الأقنية الإلكترونية P1000 مع نصائح مرشح للمساعدة في إعداد العديد من لوحات.
    ملاحظة: نظرا لانخفاض حجم آبار صفيحة، أجار في كارا microplates يتصلب في غضون دقائق من صب.
  8. مكان أكوام من كارا microplates في با البلاستيك الأغلاقع لتجنب الجفاف.
  9. مخزن كارا microplates في 4 درجات مئوية.

2. إعداد النسخ المتماثل وغير المتماثل MIC 90 فحوصات

  1. تطعيم السل م، م البقرية BCG أو م اللخنية في لOD 580 من ،01-،1 والتوسع في مرحلة منتصف السجل (OD 580 ~ 0.5) في ميدلبروك 7H9-ADN (ميدلبروك 7H9 تحتوي على 0.2٪ الجلسرين، 0.2٪ سكر العنب ، و 0.5٪ الزلال، و0.085٪ كلوريد الصوديوم) أو 7H9-OADC (ميدلبروك 7H9 تحتوي على 0.2٪ الجلسرين و 10٪ ملحق OADC).
  2. تنمو السل م و م البقرية BCG كما ~ 20 مل الثقافات واقفا في قوارير زراعة الخلايا وم اللخنية مع اهتزاز في البولي بروبلين مستديرة أسفل (ثقافة 4 مل) أو 50 مل أنابيب الطرد المركزي مخروطي الشكل (10-20 ثقافة مل). احتضان المتفطرات المسببة للأمراض عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O 2 و CO 2 5٪، وم اللخنية عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O 2.
  3. اقامة الحد الأدنى-المثبطةتركيز (MIC 90) التجربة على غرار تحت تكرار وعدم تكرار الظروف (الشكل 2).
    وعادة ما يعاير كلاء اختبار في مكررة أو quadruplicates للسماح اختبار 4 أو 2 المركبات، على التوالي، في 96-جيدا صفيحة: ملاحظة. على سبيل المثال، في لوحة 96-جيدا، وكيل واحد الاختبار يمكن أن يعاير في صفوف م وآخر في صفوف EH. وDMSO (مركبة) في العمودين 1 و 2 و 12، والتخفيف كيل سلسلة اختبار تمتد من العمود 3 (أقل تركيز) إلى العمود 11 (أعلى تركيز). هيئة التصنيع العسكري 90 فحوصات على غرار توظف عادة سلسلة تخفيف 2-أضعاف. وهناك العديد من النماذج غير تكرار المتاحة لالمتفطرات 14-16،18،24،25 ولأغراض التوضيح، ونحن نستخدم نموذج متعدد الإجهاد من غير تكرار 6،8،9.
    1. لفحص تكرار، توزيع 200 خلية ميكرولتر في 7H9-ADN في لOD 580 من 0.01 إلى جميع آبار واضحة القاع، عالجت زراعة الأنسجة لوحة 96-جيدا.
      2. <لى> لمقايسة غير تكرار، وغسل خلايا مرتين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.02٪ تيلوكسابول، والخلايا resuspend في المتوسط غير تكرار (0.05٪ KH 2 PO 4، 0.05٪ MgSO 4، 0.005٪ سترات الأمونيوم الحديديك ، 0.0001٪ ZnCl 2، 0.1٪ NH 4 CL، 0.5٪ BSA، 0.085٪ كلوريد الصوديوم، 0.02٪ تيلوكسابول، 0.05٪ الزبدات، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 5.0 مع 2 N هيدروكسيد الصوديوم).
      1. تمييع الخلايا إلى OD 580 من 0.1 في المتوسط غير تكرار وإضافة نانو 2 من الطازجة الأوراق المالية 1 M إلى التركيز النهائي من 0.5 ملم.
      2. توزيع 200 خلية ميكرولتر في لOD 580 من 0.1 في جميع الآبار واضح القاع، عالجت زراعة الأنسجة لوحة 96-جيدا.
        ملاحظة: إعداد التخفيفات مجمع كحلول الأسهم 100 أضعاف في DMSO. وهكذا، فإن لوحة هيئة التصنيع العسكري النموذجية اختبار تأثير جزيء بتركيز نهائي ،4-100 ميكروغرام / مل تتطلب الحلول الأسهم من ،04-10 ملغ / مل في DMSO.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من ديlutions وكيل اختبار 1 إلى صفوف AE و 2 ميكرولتر من التخفيفات وكيل اختبار 2 في صفوف EH. تخلط جيدا.
    3. إضافة 2 ميكرولتر السيطرة على السيارة (عادة DMSO) في آبار المراقبة، والأعمدة 1 و 2 و 12 (صفوف ه). تخلط جيدا.
    4. لكل تجربة، وتشمل مراقبة إيجابية واحدة على الأقل مثل ريفامبيسين ،004-1 ميكروغرام / مل (تكرار الفحص) و / أو ،08-20 ميكروغرام / مل (غير تكرار الفحص).
      ملاحظة: استخدام 6-برومو-1H-indazol-3-أمين 9 في ،1-25 ميكروغرام / مل ينصح كمركب التحكم الذي يوجد انتقائية، نانو 2 النشاط معتمد على في نموذج متعدد الإجهاد عدم تكرارها.
    5. لتكرار المقايسات، واحتضان microplates عند 37 درجة مئوية في 20٪ O 2 و 5٪ CO 2 لمدة 7 أيام (م. م. السل والسل البقرية) أو 1-48 ساعة (م. اللخنية). لنموذج متعدد الإجهاد عدم النسخ المتماثل، واحتضان microplates لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 1٪ O 2 و 5٪ CO 2 (<م> M. السل وم BCG البقرية).

3. التلقيح من كارا Microplates

  1. في نقاط الوقت الذي سيتم استخدام كارا باعتباره من القراءة، و resuspend بعناية جيدا محتويات لوحة فحص على غرار هيئة التصنيع العسكري 90 باستخدام ماصة P200 متعددة وضعت في 50-75 ميكرولتر. ماصة صعودا وهبوطا 5-10 مرات على الأقل وبلطف عباب محتويات جيدا في حركة دائرية باستخدام نصائح ماصة.
  2. نقل 10 ميكرولتر من محتويات فحص جيد للصفيحة كارا. تأكد من أن ترتيب محتويات جيدا على لوحة فحص يطابق ترتيب محتويات جيدا صفيحة كارا. تجنب الرش أثناء عمليات النقل والتأكد من رصدت 10 ميكرولتر في منتصف الآبار كارا صفيحة. تأكيد 10 ميكرولتر يمتص في صفيحة كارا.
    ملاحظة: لا توجد أية التخفيفات اللازمة قبل اكتشاف الخلايا على وكارا microplates.
  3. مداخن ربط من كارا microplates مع شريط لوحة وثم وضع في كيس من البلاستيك الأغلاق. احتضان كارا microplates عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O 2 (م. اللخنية) أو 1٪ O 2 و 5٪ CO 2 (السل م و م البقرية BCG).
  4. لالسل م و م البقرية BCG، تكرار المقايسات: احتضان لمدة 7 أيام. لالسل م و م البقرية BCG غير تكرار المقايسات، واحتضان لمدة 10 يوما؛ لاللخنية م، تكرار المقايسات، واحتضان لمدة 1-2 أيام. لاللخنية M.، المقايسات عدم تكرار، احتضان 2-3 أيام.
    ملاحظة: هناك أوقات التقديرات ويمكن تعديلها وفقا لذلك لتكرار مختلفة، غير تكرار، وظروف الإجهاد.

4. تطوير كارا Microplates

  1. تطوير كارا microplates عندما فيلم للنمو البكتيري، أو أكبر، المستعمرات العيانية، مرئية على الآبار (مركبة) مراقبة سلبية.
    ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة لفترات طويلة، كارا آبار صفيحة في كثير من الأحيانتظهر الجافة ونوصي قبل ترطيب جيد محتويات مع برنامج تلفزيوني العقيمة. هذا يساعد على منع الفحم من استيعاب ريسازورين، والتي يمكن أن تؤدي إلى مضان منخفضة أو تباين جيد إلى جيد.
  2. باستخدام مجموعة واحدة من 12 P200 مع نصائح ماصة الأقنية، الاستغناء عن 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة على طول الجانب من الآبار، والسماح للبرنامج تلفزيوني لتوزيع عبر الجزء العلوي من microcolonies أجار / البكتيرية.
  3. إعداد كارا تطوير كاشف عن طريق خلط 5 ملغ ريسازورين (النهائية 0.01٪)، و 50 مل من 5٪ Tween80 في برنامج تلفزيوني. دوامة وتصفية العقيمة.
    ملاحظة: بديل كارا كاشف تطوير يمكن تحضيره بإضافة استعداد تجاريا ريسازورين حل السائل في 1: 1 (المجلد / المجلد) مع 10٪ Tween80 في برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من كاشف تطوير كارا الطازجة إلى كل بئر من صفيحة كارا باستخدام ماصة 12 قناة. لوحات الصخور ذهابا وإيابا عدة مرات للمساعدة في توزيع كاشف عبر حصيرة أجار والبكتيرية في كل بئر.
  5. وضع لوحات طنا حقيبة الأغلاق البلاستيك واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لم اللخنية و45-60 دقيقة للالسل م أو م البقرية BCG.
    ملاحظة: إذا فشلت الآبار السيطرة على السيارة لتحويل الوردي خلال الساعة الأولى، لوحات يمكن إعادة حصل والمحتضنة لفترات أطول من الوقت.
  6. قبل القراءة مضان، ووضع كارا microplates في غطاء السلامة الأحيائية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع أغطية ازالتها. عند استخدام طيفي BSL3 خارج مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، والتمسك ملصق الجودة PCR بصري على لوحة وختم بإحكام عن طريق الضغط بلطف على سطح لاصق مع منشفة ورقية ناعمة.
  7. تحديد مضان عبر أعلى قراءة مع الإثارة في 530 نانومتر، والانبعاثات في 590 نانومتر. وليس من الضروري أن فارغة لوحة.

تحليل 5. البيانات

  1. مؤامرة تركيز مثبط على المحور السيني على نطاق وسجل 10 ومضان على العمودي على مقياس خطي. استخدام مبعثرمؤامرة توظيف منحنى تناسب مثل "تسجيل المانع مقابل المنحدر استجابة متغير (4 المعلمات)". نقاط البيانات مؤامرة كما يعني ± الخطأ المعياري.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف النتائج كارا كان متوقعا في الشكل 2 وتلخيصها في الجدول 1. لتكرار الخلايا، تشغيل كارا بالتوازي مع معيار MIC 90 المقايسات، ولفحوصات غير تكرار، وتشغيل كارا بالتوازي مع هيئة التصنيع العسكري 90 فحص تكييفها أن يقترن إلى مرحلة نمو. تركيز وكيل الاختبار الذي يؤدي إلى فشل كارا مضان في الارتفاع فوق مستويات الخلفية هو كارا-MBC ≥99 (الشكل 3A). ويشير "≥99" منخفض أن كارا-MBC توفر قدر التركيز وكيل الاختبار الذي يثير ≥2 سجل 10 قتل البكتيريا (≥99٪ قتل).

السائل مرق MIC 90 الفحص غير قادر على التمييز بين جراثيم والنشاط للجراثيم وهذا التمييز لا بد من حلها عن طريق فحص كفو. بواسطةاتفاقية، العتبة التي تميز جراثيم من النشاط جراثيم لبطء النمو المتفطرات حوالي 2-3 سجل 10 قتل أكثر من 7 أيام 7،26. منذ النطاق الديناميكي للكارا هو أيضا 2-3 سجل 10 قتل، يمكن للكارا توفير تقدير من جراثيم أو نشاط للجراثيم. وكارا يحدد بسهولة بعض نشاطا تكرار مثل جراثيم بسبب فشل هذه المركبات لتقليل كارا مضان إلى مستويات الخلفية (الشكل 2). ومع ذلك، فإن بعض المركبات ذات النشاط للجراثيم ضد تكرار M. السل لها تأثير قوي في مرحلة ما بعد المضادات الحيوية، وهذا يعني أنها لا تزال تمنع إعادة نمو البكتيريا خلال مرحلة الانتعاش حتى في حالة عدم وجود مركب المرحل. هذا التأثير يمكن أن يكون من الصعب الاعتراف في مقايسة كارا. ويشتبه مركبات لممارسة تأثير ما بعد المضادات الحيوية إذا كانت عرض "نافذة ثابت"، الذي يعرف بأنه تحول> 4 أضعاف إلى بين هذا وذاك الصحيحن هيئة التصنيع العسكري وكارا المنحنيات (الشكل 3B). ويشير نافذة ثابت أن جزيء فعال ضد تكرار M. السل قد تكون جراثيم بدلا من جراثيم. في بعض الحالات، والنوافذ ثابتة واضحة إلا بعد التفتيش من العمودي موسعة لكارا مضان (الشكل 3C و 3D).

عادة ما يتم رسم كارا وهيئة التصنيع العسكري 90 البيانات معا (الشكل 4). وأظهرت بيانات تمثيلية للجزيئات replicating- وغير تكرار نشطة اختبارها من قبل هيئة التصنيع العسكري 90 وكارا في الشكل (4). هناك 4 فئات النشاط الرئيسية للجزيئات: 1) تكرار للجراثيم (أثبتت مع الإيزونيازيد، الشكل 4A)؛ 2) تكرار جراثيم (أثبتت مع ينزوليد، الشكل 4B)؛ 3) غير تكرار للجراثيم (أثبتت مع أوكسي فينبوتازون، الشكل 4C)؛ و، 4) مندوبlicating النشطة (جراثيم أو جراثيم) وعدم تكرار جراثيم (أثبتت مع PA-824، الشكل 4D). الأهم من ذلك، أرقام 4A و 4B إثبات أنه في حين أن الإيزونيازيد وينزوليد يبدو أن لديها نشاط ضد البكتيريا غير تكرار من قبل هيئة التصنيع العسكري 90 فحص، تقترح كارا أنها غير نشط في ظل ظروف غير تكرار اختبار. لاختبار فائدة كارا في توقع تأثير زمنيا والتركيز التي تعتمد على جزيء، وتكرار م اللخنية تعرضت إلى زيادة تركيزات ريفامبيسين (أرقام 5A - د)، وفي أوقات مختلفة بين 1-24 ساعة، تم رصد قسامات على لوحات كارا. وأشارت هذه البيانات إلى أن ريفامبيسين بذل لها تأثير في وقت مبكر من 1 ساعة (الشكل 5A)، عرض زيادة النشاط مبيد للجراثيم بين 3 و 24 ساعة (الأرقام 5B-د)، وقتلت ≥2-3 سجل 10 في ~ 10 ميكروغرام / مل من 24 ساعات (الشكل 5D). تجربة مماثلة اختبارا quadruplicates من السيطرة على السيارة و9 تركيز الدواء، وفي 4 لحظات زمنية، ستكون باهظة من قبل الفحص المعياري بناء كفو.

وهكذا، فإن كارا لها دور في اكتشاف المخدرات باعتبارها متوسطة الإنتاجية، وآلية سريعة لتحديد الشخصية النشاط في الجزيء. توقعات كارا ينبغي تقييمها بدقة باستخدام فحص كفو القياسية. إضافة 0.4٪ من الفحم المنشط لوحات بيتري لتحليل كفو قد تساعد في تحسين علاقة لبيانات كارا، ويمكن أن يؤدي في التهم كفو أكثر دقة، فإن حجم التصحيح يجري عادة يتناسب مع قوة من المجمع 21،22.

figure-results-1
الشكل 1: كارا هو أداة تنبؤية في اكتشاف الأدوية. يلخص هذا المخطط فائدة كارا باعتبارهامرحلة وسيطة بين فحص المخدرات (فحص نقطة واحدة، الانتقاء، والمقايسات الاستجابة للجرعة) وفحوصات تستغرق وقتا طويلا ضرب لمن الرصاص (المقايسات كفو وتحديد الهدف). [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: رسم تخطيطي للمقايسة مرق MIC 90 و كارا مع النتائج المتوقعة. يتم عرض كل من هيئة التصنيع العسكري 90 وكارا النتائج لمدة 8 الأنشطة الممكنة. ولهيئة التصنيع العسكري 90 بئرا صفيحة الترميز اللون الأبيض (أي نمو) والبني (النمو)، وكارا microplates أسود (لا مضان) وردي (مضان resorufin). بيانات افتراضية. [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل (3): متخصصة حيث كارا والتعاريف. تركيز مبيد للجراثيم الحد الأدنى من جزيء مما أدى إلى مستويات خلفية كارا مضان هو كارا-MBC ≥99 (أ). في ظل ظروف تكرار، تحول ≥4 أضعاف من كارا-MBC ≥99 إلى اليمين من هيئة التصنيع العسكري 90 غالبا ما يشير إلى نشاط الجراثيم ويسمى "نافذة ثابت" (ب). لجزيئات مع وجود تأثير قوي في مرحلة ما بعد المضادات الحيوية، قد تكون النوافذ ثابتة من الصعب مراقبة (ج) وتتطلبتوسيع العمودي (كارا مضان) لتصور (د). بيانات افتراضية. [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: توضيحي MIC 90 و كارا النتائج للمركبات مختارة. وأظهرت بيانات لهيئة التصنيع العسكري 90 (الحمراء)، وكارا (الأزرق) ل(أ) الإيزونيازيد (INH) و (ب) ينزوليد، (ج) أوكسي فينبوتازون، و (د) PA-824. تعرضت البرية من نوع M. السل H37Rv إلى المركبات لمدة 7 أيام في ظل ظروف تكرار القياسية أو نموذج متعدد الإجهاد من غير تكرار 7-9. أجريت هيئة التصنيع العسكري 90 المقايسات وكارا كما هو مبين في الشكل 2. [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5: Dose- والنشاط تعتمد على الوقت من الريفامبيسين. تعرض غير المسببة للأمراض، التي تشهد نموا سريعا م اللخنية إلى زيادة تركيزات ريفامبيسين في ظل ظروف وقسامات تكرار أخذت عينات لكارا في 1 (أ) و 3 (ب) و 6 (ج) و 24 (د) ساعة. [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7]كوم / ملفات / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الجدول 1: ملخص النتائج المتوقعة في الشكل 2. [مقتبس بإذن من الذهب وآخرون، مضادات الميكروبات وكلاء والعلاج الكيميائي، 2015 7] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير كارا أصلا لتخفيف عنق الزجاجة في التقدم عدم تكرار أو جزيئات ثنائية نشطة 7. يخدم كارا كخطوة وسيطة بين تأكيدا تركيز الاستجابة الزيارات الفرز الأولية وفحوصات كفو (الشكل 1). منذ لوحة كارا واحدة يمكن أن تحل محل العديد من صفيحة معايرة دقيقة اللازمة لإعداد التخفيفات المسلسل، ولوحات بيتري التي تحتوي على أجار تستخدم لتعداد البكتيريا على قيد الحياة، يوفر كارا وسيلة بسيطة لتقييم بسرعة النشاط جزيء واختبار متغيرات متعددة في آن واحد، بما في ذلك تركيز مركب والوقت من التعرض لهذا المركب.

في مقايسة كفو، بالإضافة إلى التخفيفات التسلسلية التي غالبا ما تتراوح ما يصل إلى 10 6 أضعاف، لوحة أجار عادة يخفف جزيئات من قبل ~ 800 أضعاف إضافية (10 ميكرولتر على 8 مل في طبق بيتري على غرار الثلاثية). لدينا على مرحلتين، متعدد الإجهاد فحص فحص للمركبات نشطة على غير متماثل م توberculosis لديه عامل المرحل من 5 أضعاف، وهذا هو، هدية مركب في مرحلة غير تكرار للفحص موجود في خمس تركيز الأصلي في (تكرار) مرحلة من مراحل الفحص 6-9 ثمرة. ويخفف من آثارها كارا تحمل أكثر الآثار من خلال عزل جزيئات صغيرة مع الفحم المنشط. معظم الأدوية السل والمرشحين السريري ربط الفحم المنشط بسرعة وبشكل كامل، مع استثناء من أمينوغليكوزيد الستربتومايسين 7. إدراج الفحم المنشط في لوحات أجار لفحوصات كفو منع تثبيط نمو البكتيريا، أو قتل البكتيريا، من خلال المرحل TMC207 وPA-824 7،21،22. وبالتالي، بحكم دمج الفحم المنشط في آغار باكتريولوجي، وكارا لا تعتمد على التخفيفات المسلسل من الخلايا وكيل الاختبار.

وكارا يمكن أن تساعد في التنبؤ تأثير جراثيم أو جراثيم تكرار الأصول وتأثير مبيد للجراثيم الأصول غير تكرار. في زيستخدم eneral، وكارا بالتوازي مع هيئة التصنيع العسكري القياسية 90 المقايسات. القوة التنبؤية لكارا يأتي من مقارنة MIC 90 والنتائج كارا (الشكل 2 والجدول 1). عندما تستخدم لدراسة العوامل المضادة للالفطرية، يمكن للكارا التنبؤ بدقة النشاط الذي تكرار للجراثيم (الشكل 4A)، تكرار للجراثيم (الشكل 4B)، غير تكرار للجراثيم (الشكل 4C)، أو ثنائي النشط (الشكل 4D). كما يسمح كارا تقييم بسيط من النشاط في المجمع عبر كل جرعة والوقت. المقايسات كفو وحدها تتطلب الكثير من الجهد والمادية لتقييم نشاط مركب على مجموعة واسعة من الجرعات والأوقات، ولكن المهمة يصبح التحكم فيها عندما تضيق النتائج كارا مجموعة من الشروط لتلك التي في مركب نشط بشكل واضح (الشكل 5 ).

في حين أن كارا له فائدة في دراسة العمل منالمعهد القومي للاتصالات العدوى على المتفطرات، وفحص والقيود. وكارا لديها مجموعة ديناميكية الضيق (2-3 سجل 10) وقد لا يكون مناسبا للظروف في أي واحد تتوقع قد لا يكون هناك أكثر من 2-3 سجل 10 قتل البكتيريا. وتتطلب التوقعات كارا مزيد من الدراسة باستخدام أسلوب أكثر صرامة ودقيقة لتعداد أرقام البكتيرية، مثل فحص كفو. تأثير ما بعد المضادات الحيوية لبعض مضادات العدوى، مثل نظام تقييم الأداء، ويمكن أن يربك كارا كأداة التنبؤية للتمييز بين المركبات مع جراثيم والنشاط للجراثيم ضد تكرار السل م 7.

هناك نوعان من التوصيات لتحسين نوعية كارا. أولا، لا بد من صب كارا بسرعة microplates قبل يتصلب أجار، مع الحفاظ على دقة الحجمي وتجنب الرش خارج microwells. بغض النظر عن عدد من لوحات المطلوبة، فإننا ننصح جعل 0،5-1 دفعات L المتوسطة للمساعدة في الحفاظ على مedium في شكل سائل لمدة من الوقت اللازم لتصب لوحات. تغيير نصائح في كثير من الأحيان في حين ملء microplates مع متوسط ​​يتجنب استخدام نصائح انسداد جزئي. ثانيا، لا بد من تقليل التباين مصطنعة في مضان بين مكررات. microcolonies الفطرية، ولا سيما بالنسبة للالمتفطرات المسببة للأمراض مثل السل م، وغالبا ما تنمو بطريقة متقطعة. على سبيل المثال، microcolonies المتزايد على سطح أجار قد تختلف في الحجم والشكل والطول، أو قد تمتد حتى الجدران الداخلية من آبار صفيحة. وأحد التحديات هو لتغطية جميع العصيات بشكل موحد مع كاشف النامية. عقبة أخرى هي أنه بعد الحضانة لفترات طويلة عند 37 درجة مئوية، ومتوسط ​​باكتريولوجي الصلب وكارا microplates قد تصبح جافة وعرضة للامتصاص كاشف النامية. منذ الفحم المنشط يمكن ربط ريسازورين وإرواء مضان 7، قد يكون هناك تباين جيد إلى جيد بسبب الآبار الجافة استيعاب ريسازورين تطوير الحل وcharcoa تفعيلهال تبريد ريسازورين مضان. قبل ترطيب سطح جميع الآبار كارا صفيحة مع برنامج تلفزيوني على الفور قبل أن يضيف الكاشف تطوير يخفف كل من هذه المشاكل - وكاشف تطوير الوصول إلى جميع المستعمرات المتفطرات على قدم المساواة، ويبقى ريسازورين بأمان فوق الفحم المنشط. قد يكون كارا التطبيقات في تحديد وتوصيف الظواهر من المسوخ المتفطرات، أو في المتوسطة الإنتاجية المقايسات اكتشاف المخدرات الأنواع البكتيرية الأخرى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد تضارب المصالح في الكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لكريستين بيرنز هوانغ لخبراء الاستعراض للمخطوطة وجيه ديفيد وارن (كلية وايل كورنيل الطبية) للحصول على المساعدة الكيمياء مع تطوير كارا. وأيد هذا العمل من قبل برنامج مسرع لأدوية السل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، وآبي وهاوارد برنامج ميلشتاين P. في الطب بالحركة، ووحدة بحوث السل المعاهد الوطنية للصحة (U19 AI111143). ويدعم قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة من قبل مؤسسة ويليام راندولف هيرست. وأيد SSK من المعاهد الوطنية للصحة منحة K08AI108799.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ميدلبروك 7H9بيكتون ديكنسون271310
ميدلبروك 7H11بيكتون ديكنسون298810
ميدلبروك OADCبيكتون ديكنسون212351
BSA ، صدمة حراريةروش3118958001
الفحم المنشطSigmaC5510
PBS و Dulbecco's Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> FreeLife Technologies / Invitrogen14190-144
tween 80SigmaP8074
tyloxapolSigmaT8761
نتريت الصوديومSigma2252
rifampicinSigmaR3501
6-bromo-1H-indazol-3-amineألفا إيسارH34095
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة    سيجماP0662
كبريتات المغنيسيوم ، سباعي الهيدرات   ؛سيجماM1880
سترات الأمونيوم الحديديكية سيجماF5879
كبريتات الزنك ، سباعي الهيدراتسيجماZ0251
كلوريد الأمونيوم   ؛سيجماA9434
حمض الزبدة, سائلسيجماB103500
مسحوق ريزازورينسيجماR7017
كلوريد الصوديوم  جي تي بيكر4058-01 
محلول ريزازورين محضر ملصقات InvitrogenDAL1100
PCRDenvilleB1212-5
الطيفالأجهزة الجزيئيةM5
96 جيدا ، زراعة الأنسجة المعالجة بألواح دقيقةCorning3595
كاشف خزاناتVWR & nbsp ؛89094-678
أكياس بلاستيكية قابلة لإعادة الإغلاقVWR 395-94602
14 مل أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع Corning  ؛352059
50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطيCorning352070
75 سم 2< / sup> قارورة ثقافة الخليةCorning431464U
ثقافة الأنسجة الشفافة ذات القاع المسطح المعالجة 96 بئر صفيحةدقيقة Costar3595
Prism 6 ل OS XGraphPadhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
أجهزة الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

99

مقالات ذات صلة