نحن هنا وصف بروتوكول يهدف إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic نماذج الوالدين والمقاومة في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها، وأنشأ طريقة تقوم QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تبقى مقاومة المخدرات مشكلة رئيسية في علاج السرطان لكلا الأورام الخبيثة الدموية والأورام الصلبة. يمكن أن يكون سبب المقاومة الذاتية أو التي حصل عليها مجموعة من الآليات، بما في ذلك زيادة القضاء على المخدرات، وانخفاض امتصاص الدواء، تعطيل المخدرات والتعديلات أهداف المخدرات. وأظهرت بيانات حديثة أن بخلاف المعروفة الجيني (الطفرة، والتضخيم) وجينية (hypermethylation الحمض النووي، هيستون في مرحلة ما بعد متعدية التعديل) التعديلات، وآليات المقاومة للعقاقير ويمكن أيضا أن ينظم الانحرافات الربط. هذا هو المجال المتنامي بسرعة التحقيق التي تستحق الاهتمام في المستقبل من أجل تخطيط مناهج علاجية أكثر فعالية. ويهدف البروتوكول وصفها في هذه الورقة إلى التعرف على تأثير الربط الشاذة على مقاومة الأدوية في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتحليل الشخصية transcriptomic من عدة نماذج في المختبر من خلال الحمض النووي الريبي يليها وإقامةإد QRT-PCR الأسلوب القائم على التحقق من صحة الجينات المرشحة. على وجه الخصوص، قمنا بتقييم الربط التفاضلية من DDX5 وPKM النصوص. تم التحقق من صحة الربط الشاذة الكشف عنها بواسطة أداة الحسابية الحصير في خلايا اللوكيميا، وتبين أن يتم التعبير عن مختلف المتغيرات DDX5 لصق في الخلايا المقاومة مقابل الدية. في هذه الخلايا، ونحن أيضا لاحظ أعلى PKM2 / نسبة PKM1، الذي لم يتم الكشف في Panc-1 نظيره مقاومة للجيمسيتابين مقارنة الأبوية خلايا Panc-1، مما يشير إلى آلية مختلفة من المخدرات المقاومة الناجمة عن التعرض جيمسيتابين.
المقدمة
وعلى الرغم من التقدم الكبير في علاج السرطان، ومقاومة للخلايا الخبيثة للعلاج الكيميائي، إما ذاتية أو مكتسبة عند التعرض المخدرات لفترات طويلة، هو السبب الرئيسي لفشل العلاج في مجموعة واسعة من سرطان الدم والأورام الصلبة 1.
من أجل ترسيم الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية، في نماذج خط الخلية في المختبر يتم تطويرها من قبل مجموعة متدرجة من الخلايا السرطانية مقاومة للعوامل العلاج الكيميائي. هذا الإجراء يحاكي الأنظمة المستخدمة في المرافق الصحية، وبالتالي يسمح في عمق التحقيق في آليات مقاومة ذات الصلة. الخلايا المقاومة التي تنجو من ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توصيف التشكيلات المقاومة المخدرات من خلال السمسة فحوصات
- اللوكيميا ثقافة خط الخلية
- الحفاظ على الوالدين تي خلية ALL خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وكذلك sublines المقاومة للأدوية، بما في ذلك CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3، في 25 سم 2 في المتوسط 10 مل RPMI-1640 تحتوي على 2.3 ميكرومتر حمض الفوليك تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين و 100 وحدة / مل البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
المقايسات السمسة هو موضح في البروتوكول توفر طريقة موثوق بها وقوية لتقييم مقاومة الخلايا السرطانية إلى وكلاء العلاج الكيميائي في المختبر. عن طريق الفحص الإنتقالي العسكري، تم تحديد حساسية إلى التنفيذ المباشر في أربعة خطوط T-ALL الخلايا بما في ذلك خلايا CEM-WT الوالدين التنفيذ المباشر الحساسة، وثلاثة sublines مقاومة للالتنفيذ المباشر: CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3. كان لا بد من استخدامه نظرا إلى اختلاف كبير في حساسية بين CEM-WT (2 ميكرومتر - 0........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا وصف نهجا جديدا يجمع بين تقنيات فحص السمية الخلوية راسخة وقوية transcriptomic أساس خ ع و تحليلات لتحديد الأحداث الربط التفاضلية فيما يتعلق المقاومة للأدوية. المقايسات طيفية وطرق الإنتاجية العالية مريحة وقوية لتقييم حساسية المخدرات في المختبر في نماذج السرطان وتمثل الخيار الأول للعديد من المختبرات أداء الفحوص السمية الخلوية. وقد وصفت استكشاف الأخطاء وإصلاحها وكذلك الاختلافات المحتملة لهذه الطريقة على نطاق واسع في أماكن أخرى 4،5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يكرموا البروفيسور جي جيه ماكجواير والبروفيسور آر كوفلر والدكتور ك. كوينت لتوفير خطوط الخلايا المقاومة المستخدمة في هذا العمل. تأسست الدراسة من خلال منح من مؤسسة مركز السرطان أمستردام (CCA) (إلى JC و EG و RS) ، ومؤسسة KiKa (منحة خالية من سرطان الأطفال ل AW) ، ومكاتب المحاماة لبيتر جي أنجيلوس جرانت من مؤسسة البحوث التطبيقية لورم الظهارة المتوسطة (إلى VEG و EG) ، و Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) ، و Istituto Toscano Tumori (ITT) ، و Regione Toscana Bando FAS Salute (إلى EG).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سلفورهودامين ب | سيجما ألدريتش | 230162 | |
| حمض ثلاثي كلورو أسيتيك | سيجما ألدريتش | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز | لونزا ، بازل ، سويسرا | 12-604F | |
| RPMI-1640 | جيبكو ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 11875093 | |
| مصل الأبقار والعجل الجنيني | Greiner Bio-One ، Frickenhausen ، ألمانيا | 758093 | |
| البنسلين G ستربتومايسين كبريتات | جيبكو ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15140122 | |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينوميثان | سيجما ألدريتش | 252859 | |
| MTT فورمازان | سيجما ألدريتش | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec ، Heerhugowaard ، هولندا | UV-Vis مقياس الطيف الضوئي للوحة 96 بئر | |
| Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر | Greiner / Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin / EDTA Solution 100 مل | لونزا ، بازل ، سويسرا | CC-5012 | |
| قوارير ثقافة الخلايا CELLSTAR 25 سم 2< / sup> | Greiner Bio-One ، فريكنهاوزن ، ألمانيا | 82051-074 | |
| قوارير زراعة الخلايا CELLSTAR 75 سم 3< / sup | >Greiner Bio-One ، فريكنهاوزن ، ألمانيا | 82050-856 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (كلوريد الصوديوم 0.9٪) | B.Braun Melsungen AG ، ألمانيا | 362 3140 |
المراجع
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
