باستخدام الحمض النووي الريبي لكشف التسلسل رواية لصق المتغيرات ذات الصلة لمقاومة المخدرات في في المختبر نماذج السرطان

وعلى الرغم من التقدم الكبير في علاج السرطان، ومقاومة للخلايا الخبيثة للعلاج الكيميائي، إما ذاتية أو مكتسبة عند التعرض المخدرات لفترات طويلة، هو السبب الرئيسي لفشل العلاج في مجموعة واسعة من سرطان الدم والأورام الصلبة ^1.

من أجل ترسيم الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية، في نماذج خط الخلية في المختبر يتم تطويرها من قبل مجموعة متدرجة من الخلايا السرطانية مقاومة للعوامل العلاج الكيميائي. هذا الإجراء يحاكي الأنظمة المستخدمة في المرافق الصحية، وبالتالي يسمح في عمق التحقيق في آليات مقاومة ذات الصلة. الخلايا المقاومة التي تنجو من العلاج ثم يتم تمييزها عن الخلايا الحساسة الوالدين باستخدام المقايسات بقاء الخلية / السمية الخلوية ^2. في التشكيلات المقاومة للأدوية في المختبر من خلايا أولية وقد ثبت أن تكون مرتبطة إلى حد كبير في استجابة سريرية للعلاج الكيميائي ^3.

الإنتاجية العالية cytotoتشكل المقايسات xicity طريقة ملائمة لتحديد حساسية المخدرات في المختبر. هنا، يتم تقييم الجدوى من الخلايا على سبيل المثال 3- [4،5-dimethylthiazol-2-YL] -2،5-ثنائي بروميد نتروبلو - الإنتقالي العسكري فحص ^4، والتي تقوم على تحويل التمثيل الغذائي لبعض ركائز (أي، أملاح نتروبلو) إلى منتجات الملونة، مما يعكس النشاط الميتوكوندريا من الخلايا. بدلا من ذلك، ومحتوى البروتين من الخلايا يمكن أن يكون كميا باستخدام فحص sulforhodamine ب (SRB) ^5. هنا، وعدد من خلايا قابلة للحياة يتناسب مع الكثافة الضوئية (OD) قياس في الطول الموجي المناسب في معمل، ولا حاجة ل واسعة النطاق وإجراءات عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا. ويمكن حساب تثبيط نمو الناجمة عن معينة المخدرات العلاج الكيميائي على أساس OD من الآبار التي تم علاج الخلايا مع وكيل اختبار ومقارنة مع OD من الخلايا السيطرة غير المعالجة. منحنى الاستجابة للجرعة هو obtaINED بالتآمر تركيز الدواء مقابل نسبة من خلايا قابلة للحياة النسبية للسيطرة على الخلايا. وأخيرا، يمكن الإبلاغ عن حساسية العقاقير مثل التركيز الذي يؤدي إلى 50٪ من تثبيط نمو الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة (IC _50).

وتشمل الآليات الكامنة وراء مقاومة الجراثيم للأدوية العديد من تشوهات مختلفة، مثل التغيرات التي تؤثر على التعبير الجيني من محددات النشاط المخدرات والأيض الخلوي. هذه الآفات الجزيئية، بما في ذلك الطفرات، وانحرافات في النسخي ومرحلة ما بعد النسخي وكذلك تنظيم جينية منزعجة كثيرا ما تؤثر على الجينات المسؤولة سواء في استقلاب الدواء أو موت الخلايا المبرمج ^6.

وقد تلقى البديل قبل الربط مرنا وتنظيمه معقدة في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا ككيان الرواية التي قد تملي مقاومة المخدرات من الخلايا السرطانية ^7. ما يصل الى 95٪ من الجينات البشرية وتقسم بدلا من ذلك في الخلايا الطبيعية عن طريق هذابإحكام عملية التنظيم التي تنتج العديد من الأشكال الإسوية بروتين مختلفة من نفس الجين. وغالبا ما حررت الربط البديلة في السرطان وتتميز العديد من الأورام عن طريق الربط غيرت من عدد متزايد من الجينات المسؤولة عن استقلاب الدواء (أي كيناز deoxycytidine، مخلقة folylpolyglutamate، أو البروتينات المقاومة للأدوية المتعددة) ^6،8. ومع ذلك، تحليلا شاملا لمحات الربط من خلايا مقاومة للأدوية غير متوفرة بشكل مؤلم. لذلك، لا بد من تطوير أساليب إنتاجية عالية للتحليل الربط البديلة. هذا يمكن أن يساعد في تطوير أساليب علاجية أكثر فعالية.

خلال العقد الماضي، والتطور السريع لتقنيات الجيل القادم التسلسل (خ ع) قد أثرت البحوث الطبية الحيوية مع رؤى جديدة في الآليات الجزيئية التي تحكم تنظيم التعبير الجينوم ودورها في مختلف العمليات البيولوجية ^9. RNA التسلسل (RNA وما يليها) يعد مصدرا قويا لتطبيق الفرعيةمن خ ع في مجال transcriptomics. لأنها تتيح التنميط على نطاق الجينوم (كما ونوعا) من أنماط التعبير الآلاف من الجينات في وقت واحد ومناسب تماما لتوصيف من mRNAs الترميز جديدة وطويلة الحمض النووي الريبي غير الترميز، ميرنا، سيرنا، وغيرها من الحمض النووي الريبي الصغيرة فصول (على سبيل المثال، snRNA وبيرنا) ^10،11.

RNA تسلسل لديه العديد من المزايا أكثر من التقنيات السابقة لتوصيف Transcriptome على (على سبيل المثال، سانجر تسلسل وميكروأرس التعبير). وهو لا يقوم على الشرح الجينوم الحاليين، أن لديها مستوى النووية المنفردة القرار ولها مجموعة ديناميكية أوسع لتقدير مستوى التعبير. لفترة وجيزة، وسير العمل التجريبي الأساسي من التجارب الحمض النووي الريبي وما يليها يتكون من نص مذيل بعديد الأدينيلات (مرنا) اختيار والتشرذم، تليها تحويلها إلى كدنا]، بناء مكتبة وأخيرا، وبالتوازي مع نطاق واسع تسلسل عميق ^12،13. بسبب الانخفاض السريع للsequencinتكاليف ز على مدى السنوات القليلة الماضية، RNA وما يليها وتحل تدريجيا محل غيرها من التقنيات، وتبذل جهودا كبيرة لتحسين بروتوكولات إعداد المكتبة. على سبيل المثال، فمن الممكن الآن الاحتفاظ بالمعلومات حبلا من النصوص مرنا عن طريق وضع علامة على كدنا] الشق الثاني مع ثلاثي deoxyuridine (dUTP)، وقبل PCR التضخيم، وهضم حبلا ملحوظ مع اليوراسيل-DNA-glycosilase (UDG). هذه العملية تعزز دقة الشرح الجينات وتقدير مستويات التعبير ^14،15.

تحليل وتفسير البيانات RNA وما يليها تتطلب حزم البرامج الحسابية المعقدة وقوية ومعالجة داخل أنابيب بيوينفورمتيك ^16،17. أولا، الخام يقرأ الخضوع لمراقبة الجودة عن طريق إزالة التحف الفنية والبيولوجية ونبذ (تقليم) تسلسل التي لا تصل متطلبات الجودة الصارمة. بعد ذلك يقرأ في كل عينة يتم تعيينها إلى الجينوم إشارة وفهرستهافي المستوى الجيني، على مستوى اكسون، أو على مستوى النص، من أجل تحديد وفرة من كل فئة. اعتمادا على التطبيق، ثم يتم احتساب البيانات المكررة من خلال النماذج الإحصائية لتحديد التعبير عن أليل معين، الربط البديلة، اندماج الجينات والنوكليوتيدات المفردة (النيوكلوتايد) ^(12). وأخيرا، التحليل التفاضلي على مستوى مختارة (أي التعبير الجيني أو الربط البديلة) يمكن استخدامها لمقارنة العينات التي تم الحصول عليها تحت ظروف مختلفة.

يصف تحليل الربط التفاضلية الاختلافات في استخدام الموقع وصلة بين اثنين من العينات. يتوفر عدد متزايد من حزم البرمجيات المخصصة لهذا الغرض على أساس النماذج الإحصائية المختلفة والعروض واجهة المستخدم ^(18). ومن بين هذه، والفرش (تحليل متعدد المتغيرات من نسخة الربط) تبرز بوصفها أداة الحسابية المتاحة بحرية ودقيقة تستند إلى إطار إحصائي النظرية الافتراضية ومصممة للكشف عن زراعية مختلفةأحداث الربط rential من أي بيانات الحمض النووي الريبي وما يليها نهاية واحدة أو المقترنة. بدءا من ملفات الانحياز (.bam)، يمكن الحصير كشف جميع أنواع رئيسية من الأحداث بديلة الربط (اكسون الطفر، بديلا 3 "لصق موقع بديل لل5" لصق موقع، الإكسونات يستبعد بعضها بعضا والاحتفاظ إنترون - أيضا انظر الشكل 1).

أولا، يحدد البرنامج يقرأ التي تدعم الحدث لصق معين، على سبيل المثال تخطي اكسون، وتصنفها إلى نوعين. "إدراج ما يلي:" (لهذا الحدث الكنسي لصق) الخريطة داخل اكسون التحقيق وتمتد تقاطعات بين أن اكسون محددة واثنين من الإكسونات المرافقة المنبع والمصب. "الطفر يقرأ" (لهذا الحدث لصق البديل) تمتد من تقاطع بين البلدين المرافقة الإكسونات. وفي وقت لاحق، والفرش إرجاع مستوى إدراج تطبيع للاحداث الكنسي والبديلة ويقارن القيم بين العينات أو شروط. في نهاية المطاف، فإنه يحسب ف قيمة الثانية معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) على افتراض أن الفرق في نسبة البديل من الجينات بين شرطين يتجاوز عتبة المعرفة من قبل مستخدم معين لكل حدث الربط ^19،34.

بعد تحليل الربط التفاضلية بالتزامن مع الحمض النووي الريبي بعدها، له ما يبرره على التحقق التجريبي واسعة النطاق من أجل تحديد المرشحين الجينات إيجابي صحيح ^(18). الكمي عكس كتب-البلمرة المتسلسل (QRT-PCR) هو الأسلوب الأكثر استخداما والأمثل في المصادقة على المرشحين الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الريبي يليها ^20. والهدف من هذه الورقة هو تقديم منهجية قوية لتحقيق المخدرات المتعلقة المقاومة ملامح الربط في الأورام الصلبة والأورام الخبيثة الدموية. نهجنا يستخدم الحمض النووي الريبي وما يليها على أساس Transcriptome على التنميط من نماذج خط الخلية المحددة من المخدرات السرطانات المقاومة في تركيبة مع طريقة QRT-PCR للتحقق من صحة الجينات المرشحة المتورطين في مقاومة المخدرات المعمول بها.

الصورة = "jove_content"> وتضمنت نماذج خط خلية سرطان الدم البشري المستخدم في هذه الدراسة للأطفال تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وهما الاستيرويد (GC) المقاوم subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) وCEM-C7R5 (CEM-R5) ^21،22 والميثوتريكسيت (MTX) المقاوم subline CEM / R30dm ^23. على الرغم من أن العلاجات الحالية القائمة على GCS وMTX تضع فائدة سريرية في حوالي 90٪ من الحالات، وظهور GC-المقاومة لا يزال يمثل مشكلة لم تحل بعد مع الآلية الجزيئية غير واضحة. لعزل الحيوانات المستنسخة دون مقاومة للGC، كانت خلايا CEM-WT مثقف في 1 ميكرومتر ديكساميثازون (ديكس) لمدة 2 إلى 3 أسابيع. وقد وضعت subline مقاومة للMTX CEM / R30dm خلال المدى القصير المتكررة (24 ساعة) تعرض خلايا CEM-WT إلى 30 ميكرومتر MTX بمثابة تقليد من البروتوكولات السريرية. ومن المثير للاهتمام، عرض هذا الخط الخلية أيضا عبر المقاومة إلى التنفيذ المباشر (نتائج غير منشورة) التي لم يتم فهم الآلية بشكل كامل.

وتوم الصلبةأو نموذج التحقيق في هذه الدراسة هو غدية الأقنية البنكرياس، تشتهر حران الاستثنائي للعلاج الكيميائي. تحقيقا لهذه الغاية، اخترنا خط Panc-1 الخلية ولها مقاومة للجيمسيتابين دون استنساخ Panc-1R التي حصلت عليها الحضانة مستمرة مع 1 ميكرومتر من المخدرات ^(24). نحن هنا وصف نهج لاكتشاف آليات جديدة الكامنة في المختبر مقاومة المخدرات عن طريق الجمع بين ثلاثة بروتوكولات: فحوصات السمية الخلوية اللونية لتقييم حساسية المخدرات في خلايا اللوكيميا والخلايا السرطانية من الأورام الصلبة، خط أنابيب الحمض النووي الريبي استنادا وما يليها إلى تحديد المتغيرات لصق جديدة تتعلق حساسية العقاقير / المقاومة وRT-PCR وتحليل QRT-PCR للتحقق من صحة المرشحين المحتملين.

1. توصيف التشكيلات المقاومة المخدرات من خلال السمسة فحوصات

1. اللوكيميا ثقافة خط الخلية
   1. الحفاظ على الوالدين تي خلية ALL خط الخلية مدونة السلوك-CEM (CEM-WT)، وكذلك sublines المقاومة للأدوية، بما في ذلك CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3، في 25 سم ² في المتوسط 10 مل RPMI-1640 تحتوي على 2.3 ميكرومتر حمض الفوليك تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين و 100 وحدة / مل البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
   2. ثقافة الخلايا في جو مرطب عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   3. سماح نمو الخلايا لتركيزات بين 2-3 × 10 ⁶ خلية / مل.
   4. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع على تركيز الأولي من 0.3 × 10 ⁶ خلية / مل (على سبيل المثال، إذا كان تركيز الخلية 3 × 10 ⁶ خلية / مل، ونقل تعليق خلية 1 مل في قارورة جديدة تحتوي على 9 مل متوسطة جديدة). تجاهل الثقافة بعد 20 فقرات متتالية.
   البنكرياس سرطان الخلايا الخط الثقافة
   ملاحظة: الحفاظ على خط خلية سرطان البنكرياس البشري Panc-1 في 75 قوارير الثقافة سم ² في 10 مل المتوسطة DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز ولام الجلوتامين تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري و 100 وحدة / البنسلين مل G و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل . البديل المقاومة للأدوية، Panc-1R، هو مثقف في مستنبت نفسه يحتوي على 1 ميكرومتر جيمسيتابين الذائبة في الماء المعقم. يتم توفير مزيد من التفاصيل في ^{24 ساعة.}
   1. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   2. انقسام الخلايا كل 2-3 أيام في نسبة 1: 5 عندما تصل خلايا التقاء حوالي 90٪.
   3. لتقسيم الخلايا، وغسل مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إضافة 1 مل من التربسين / EDTA لكل 75 سم ² الثقافة قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   4. إضافة 9 مل المتوسطة وحصاد خلايا منفصلة في أنبوب 15 مل. البذور تعليق خلية 2 مل في حساب المشترك قارورة جديدةining 8 مل المتوسطة. تجاهل الثقافة بعد 20 فقرات متتالية.
2. MTT الفحص لخلايا اللوكيميا السرطانية
   1. إعداد مقدما الحل الإنتقالي العسكري: حل 500 ملغ من الإنتقالي العسكري formazan في 10 مل برنامج تلفزيوني ويقلب (محمية من الضوء) مع محرك مغناطيسي لحوالي 1 ساعة. تعقيم الحل مع مرشح 0.22 ميكرون. ملاحظة: يمكن تخزين الحل في 10 مل aliquots في -20 درجة مئوية. بعيدا عن الضوء المباشر بعد ذوبان الجليد.
   2. إعداد مقدما الأيزوبروبانول المحمضة: إضافة 50 مل من 2 M حمض الهيدروكلوريك إلى 2.5 لتر من الأيزوبروبانول. ملاحظة: تخزين الحل لمدة شهر واحد على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. إذا لم يتم المحمضة الأيزوبروبانول بشكل صحيح، قد تشكل رواسب مع المتوسط ​​وتؤثر سلبا على قراءات طيفية.
   3. إعداد منفصل 96-جيدا مسطحة القاع "يوم 0" (مراقبة) لوحة لضمان تقدير أكثر دقة من تثبيط النمو: أهدي 3-6 الآبار في خط الخلية، إضافة 30 ميكرولتر من النمومتوسطة، و 120 ميكرولتر من تعليق خلية (8،000 خلية) في كل بئر و 150 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى الآبار الموافق الفراغات (أي خلايا). ننطلق من خطوة 1.3.9 إلى الخطوة 1.3.13 هذا القسم لقياس الكثافة الضوئية (OD). ملاحظة: يتم توفير المزيد من التفاصيل في ^4.
   4. إعداد لوحة التجريبية 96-جيدا مسطحة القاع: أهدي 30 بئرا لتركيزات المخدرات (10 تركيزات، كل في ثلاث نسخ)، و 10 بئرا للسيطرة على الخلايا و10 بئرا للسيطرة على وسيط وبدون خلايا (الفراغات) وإعداد مجموعة التخفيف المخدرات من ديكساميثازون ( التنفيذ المباشر) باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد كمذيب.
      ملاحظة: للحصول على خلايا CEM-WT نطاق التخفيف التنفيذ المباشر ما بين 2 ميكرومتر و 0.97 نانومتر. لCEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3 خلايا نطاق التخفيف التنفيذ المباشر ما بين 640 ميكرومتر و 0.33 نانومتر.
   5. إضافة 30 ميكرولتر من كل تخفيف التنفيذ المباشر في بئر المناسب من لوحة 96-جيدا. تأكد من تضمين كل التركيز في ثلاث نسخ.
   6. إضافة 30 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى ماالصورة المقابلة للسيطرة على الخلايا و 150 ميكرولتر من متوسط ​​النمو إلى الآبار الموافق الفراغات.
   7. حصاد أضعافا مضاعفة تزايد الخلايا و resuspend في تركيز بذر الأمثل لها.
      ملاحظة: من أجل تحديد تركيز خلية البداية المثلى، فمن المستحسن لتقييم الشخصية نمو كل خلية خط خط الخلية في لوحة 96-جيدا قبل البذر الخلايا في عدة تجمعات وقياس ذلك يوميا لمدة 4 أيام على الأقل. اختيار تركيز البذر الذي يمنع فرط نمو الخلايا بعد 72 ساعة، حيث سيؤدي ذلك إلى التأثير على التجربة التي تشبع القيم OD. لCEM-WT، CEM-C5 وCEM-R5 تركيز بذر الأمثل هو 8000 خلية / جيدا، في حين أن لCEM / R30dm هو 5000 خلية / جيدا.
   8. إضافة 120 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل إما حل المخدرات التي تحتوي على بئر أو وسط النمو (الآبار المقابلة للسيطرة على الخلايا). ملء الآبار الخارجي فارغة من لوحة مع 150 ميكرولتر PBS لضمان رطوبة جيدة في لوحة واحتضان عشرلوحات ه لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ في حاضنة الثقافة الخلية.
   9. إضافة 15 ميكرولتر من الحل الإنتقالي العسكري إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 5 دقائق مع لوحة-شاكر تصل إلى حد أقصى قدره 900 الهزات / دقيقة.
   10. وضع لوحات مرة أخرى في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ في حاضنة الثقافة الخلية واحتضان لمدة 4 أخرى - 6 ساعات.
   11. إضافة 150 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المحمضة إلى كل بئر وتخلط جيدا مع ماصة الأقنية ل resuspend بدقة كل البلورات formazan. نبدأ مع آبار فارغة والتأكد من شطف النصائح جيدا قبل الشروع في صف آخر من لوحة.
   12. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقيقة.
   13. باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية، وتحديد OD في 540 و 720 نانومتر لضمان القياس الدقيق عن طريق تصحيح لOD الخلفية. ثم حفظ البيانات في ملف البيانات وتحليلها ^4.
3. تعتبر الدار الفحص لخلايا البنكرياس سرطان
   1. حل كاشف SRB في حامض الخليك 1٪ عند تركيز النهائي من 0.4٪ (ث / ت).
   2. حل حامض الخليك ثلاثي الكلور (TCA) في الماء عالى النقاء في تركيز النهائي من 50٪ (ث / ت).
   3. حل تريس (hydroxymethyl) -aminomethane في الماء عالى النقاء في تركيز النهائي من 10 ملم.
   4. إعداد منفصلة 96-جيدا مسطحة لوحة أسفل "يوم 0" الرقابة لضمان تقدير أكثر دقة من تثبيط النمو: البذور 6 آبار مع نمو الخلايا في مرحلة الأسي في 100 المتوسطة ميكرولتر في تركيز البذر المناسب وإضافة 100 متوسطة ميكرولتر فقط إلى الآبار المقابلة ل الفراغات. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لضمان الالتصاق السليم للخلايا لوحة. ثم إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة لجميع الآبار، والشروع في خطوات 1.4.8 - 1.4.16 من هذا القسم.
   5. إعداد لوحة التجريبية 96-جيدا مسطحة القاع: خلايا البذور تنمو في مرحلة الأسي في ثلاث نسخ في 96 بئرا لوحات مسطحة القاع في الكثافة المناسبة في 100 ميكرولتر من ليdium باستخدام الماصة متعدد القنوات.
      ملاحظة: من أجل تحديد تركيز خلية البداية المثلى، فمن المستحسن لتقييم الشخصية نمو كل خلية خط خط الخلية في لوحة 96-جيدا قبل البذر الخلايا في عدة تجمعات وقياس ذلك يوميا لمدة 4 أيام على الأقل. اختيار تركيز البذر الذي يمنع فرط نمو الخلايا بعد 72 ساعة، حيث سيؤدي ذلك إلى التأثير على التجربة التي تشبع القيم OD. لخلايا Panc-1 وPanc-1R، وتركيز بذر الأمثل هو 8000 خلية / جيدا.
   6. إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة والمتوسطة فقط الآبار واحتضان ليلا 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لضمان الالتصاق السليم للخلايا لوحة.
   7. إعداد مجموعة التخفيف المخدرات من جيمسيتابين بين 1 ميكرومتر و 10 نانومتر لPanc-1 و 1 ملم و 100 نانومتر لخلايا Panc-1R. إضافة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في بئر المناسب من لوحة 96-جيدا باستخدام الماصة متعدد القنوات. تأكد من أن يكون كل التركيز في ثلاث نسخ. بالإضافة الى،إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة إلى الآبار المتوسطة فقط والخلايا السيطرة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 72 ساعة.
   8. إضافة 25 ميكرولتر حل TCA البارد لالآبار باستخدام الماصة متعدد القنوات واحتضان لوحات لمدة 60 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية لتسريع وإصلاح البروتينات في الجزء السفلي من الآبار.
   9. تفريغ لوحة عن طريق إزالة لفترة وجيزة المتوسط ​​والجاف على الأنسجة.
   10. يغسل 5 مرات مع ماء الصنبور، ثم إفراغ لوحة واسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة.
   11. إضافة 50 ميكرولتر حل SRB لكل بئر باستخدام تكرار-الماصة وصمة عار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   12. تفريغ لوحة عن طريق إزالة وصمة عار SRB.
   13. تغسل 4 مرات مع حمض الخليك 1٪، ثم إفراغ لوحة واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة.
   14. إضافة 150 ميكرولتر حل تريس لكل بئر باستخدام الماصة متعدد القنوات وتخلط لمدة 3 دقائق على لوحة شاكر تصل إلى حد أقصى قدره 900 الهزات / دقيقة.
   15. قراءة الكثافة البصرية في 540 نانومتر (أو 492 نانومتر إذا رانه OD قيم مرتفعة جدا).
   16. تحليل البيانات.
4. تحليل البيانات لالإنتقالي العسكري وتعتبر الدار فحوصات
   1. حساب القيم OD من الخلايا في "يوم 0" باستخدام الصيغة التالية: OD _{يوم 0 الخلايا} = _{السيطرة} OD - متوسط _{الآبار فارغة} التطوير التنظيمي
   2. حساب النسبة المئوية من الخلايا على قيد الحياة لكل تركيز الدواء وفقا للمعادلة التالية:٪ الخلايا المعالجة = متوسط [OD _{الخلايا المعالجة} - متوسط _{الآبار فارغة} التطوير التنظيمي - _يوم OD _0] / _{[الخلايا السيطرة} OD - متوسط _{الآبار فارغة} التطوير التنظيمي - OD _Day0] * 100
   3. رسم منحنى الاستجابة للجرعة (تركيز الدواء مقابل تثبيط نمو٪).
   4. حساب تركيز الدواء الذي يمنع نمو الخلايا بنسبة 50٪ (IC ₅₀₎ باستخدام منحنى الاستجابة للجرعة.

2. عزل الحمض النووي الريبي وإعداد مكتبة للRNA التسلسل

1. عينة كولection وعزل الحمض النووي الريبي
   1. لخلايا CEM: حصاد 10 ⁶ الخلايا مباشرة من مستنبت.
   2. لPanc-1 وPanc-1R: إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وفصل بإضافة التربسين- EDTA ويحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إضافة مستنبت وحصاد 10 ⁶ خلايا.
   3. تدور باستمرار عينات في 300 x ج لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف واستخراج مرنا الكلي باستخدام المتاحة تجاريا الأعمدة تدور غشاء السيليكا، وذلك باتباع بروتوكول الشركة المصنعة `.
   4. تحديد تركيز ونقاوة الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مطياف أشعة فوق البنفسجية فيس.
      ملاحظة: يعتبر RNA عالية النقاء إذا كانت نسبة الامتصاصية 260 نانومتر / 280 نانومتر فوق 1.8. العينات يمكن تخزينها في - 80 درجة مئوية.
   5. تقييم إجمالي سلامة الحمض النووي الريبي الكهربائي من 200 نانوغرام من العينة على 1٪ هلام الاغاروز ملطخة بروميد إيثيديوم.
      ملاحظة: الكشف عن شريطين سليمة الموافق الثدييات 28S و 18S rRNAs في حوالي الساعة2 كيلوبايت و 1 كيلوبايت في الحجم يدل على حسن الإجمالية سلامة الحمض النووي الريبي.
2. إعداد مكتبة التسلسل
   1. استخدام 2 ميكروغرام من إجمالي مرنا في كل عينة. اتبع مرنا بروتوكول إعداد المكتبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. تحديد نوعية وتركيز كل مكتبة باستخدام نظام bioanalyzer. تجمع المكتبات في عينة واحدة تصل إلى تركيز النهائي من 10 نانومول / لتر وقياسه مع bioanalyzer.
   3. استخدام نظام التسلسل الإنتاجية العالية مع واحدة مقروءة وضع 100 نقطة أساس.
      ملاحظة: قراءة طول> 80 نقطة أساس ضروري لتحديد الأشكال الإسوية النسخي.

3. الكشف عن التفاضلية الربط من تسلسل القراءات

1. محاذاة يقرأ على مرجع المجين البشري وفحص الجودة
   1. تجميع الشرح الجين (ملف .gtf) من الجدول NCBI refGene باستخدام متصفح UCSC الجدول رقم (25963 الجينات).
   2. نفذالشرح علم المواءمة شق التسلسل يقرأ لجينوم المرجعية (GRCh37) باستخدام النجوم.
   3. نوع ومؤشر الناتج الملفات المواءمة مع أدوات بيكار.
   4. أداء مراقبة الجودة بعد رسم الخرائط باستخدام RSeQC وsamtools.
2. كشف الربط الفارق بين المجموعات عينة
   1. تثبيت بيثون والإصدارات المقابلة من NumPy وSciPy. تحميل وتثبيت samtools. تحميل وتثبيت ربطة العنق وtophat،
   2. إضافة بيثون، ربطة العنق، tophat وsamtools الدلائل إلى المتغير $ PATH البيئة. تحميل بنيت قبل فهارس ربطة (hg19). تحميل rMATS النسخة 3.0.9.
      ملاحظة: يتم توفير المزيد من التفاصيل حول rMATS في ¹⁹ و ^34.
   3. كشف الأحداث الربط بديلة بمقارنة كل خط الخلية مقاومة للالتنفيذ المباشر لCEM-WT وPanc 1 إلى Panc-1R في الفرش مستقل يدير وفقا لالشكل 5A.
   4. للكشف عن أحداث الربط التفاضلية من previously تسلسل محاذاة يقرأ (ملفات .bam)، تشغيل الفرش باستخدام الأوامر من الشكل 5B عن CEM-WT مقابل CEM- C3، CEM-WT مقابل CEM-R5، CEM-WT مقابل CEM / R30dm وPanc1 إلى Panc- مقارنات 1R.
      ملاحظة: سوف MATS بإنشاء مجلد الإخراج مع اثنين من ملفات .txt مع النتائج حسب نوع الحدث الربط تحليلها (SE - اكسون الطفر، A5SS - البديل 5 "لصق موقع، A3SS - البديل 3" لصق موقع، المكسيك - الإكسونات يستبعد بعضها بعضا وRI - الاحتفاظ إنترون): ملف واحد يحتوي على النتائج على أساس التهم تقاطع فقط والملف الثاني مع النتائج على أساس التهم تقاطع ويقرأ على الهدف. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاء ملف txt إضافي لمحة نتيجة في نفس المجلد.
   5. لSE، A5SS، A3SS وRI الاستيراد لجداول البيانات وملفات .txt على أساس التهم تقاطع ويقرأ على الهدف. لMEX استيراد ملفات .txt على أساس التهم تقاطع فقط.
      ملاحظة: يتم فرز ملف الإخراج الفرش التي كتبها تصاعدي ف القيم وتحتوي على العديد من المعلمات: معرف الجينات، رمز الجين، كروموسوم وموقف حبلا، الإحداثيات الجينوم من شظايا تقسم بدلا من ذلك، تعول فضلا عن طول إدراج وتخطي أشكال لكل من العينات التي تم تحليلها، وطول إدراج وتخطي النموذج المستخدم للتطبيع، ص القيمة، ومعدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت )، ومستوى إدراج لكل عينة بناء على التهم تطبيع والنتيجة إدراج التفاضلي (متوسط ​​(IncLevel1) - المتوسط ​​(IncLevel2)).
   6. تحديد الجينات المرشحة ذات دلالة إحصائية مع روزفلت <10٪ لمزيد من التحقق من صحة (على سبيل المثال، DDX5 وPKM2).
   7. تصور الأحداث الربط البديلة مع التكاملية الجينوم عارض (IGV، https://www.broadinstitute.org/igv/)، كما ورد في الشكل (5).

4. التحقق من النتائج حسب RT-PCR وQRT-PCR فحوصات

1. التصميم التمهيدي
   ملاحظة: من أجل توفير التحقق من صحة موثوق من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خط أنابيب بيوينفورمتيك، مرنا العابرةوتتضخم cripts الناتجة عن أحداث الربط بديلة باستخدام RT-PCR وتصور من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. Cyanine صبغة خضراء مثل SYBR يستخدم الأخضر QRT-فحص PCR لتحديد لصق خاص المتغيرات نسبة إلى الجينات التدبير المنزلي. يصور الشكل 7 الاستراتيجية المطبقة لتصور اكسون 12 حالة تخطي هذا الجين DDX5 ولتحديد يتعارضان اكسون 9 واكسون 10 من الجينات PKM.
   1. لRT-PCR الفحص، التصميم التمهيدي أزواج الذي يصلب لالإكسونات التأسيسية (اكسون 10 واكسون 13) الواقعة المنبع والمصب مواقع الربط البديلة (7A الشكل).
      ملاحظة: يجب أن تغطي حجم amplicon بين 100 و 800 نقطة أساس لضمان فصل واضح للمنتجات PCR توقع على هلام الاغاروز. يجب أن تكون درجة الحرارة الصلب من الاشعال بين 55 و 65 درجة مئوية ومحتوى GC يجب أن لا تتجاوز 60٪.
   2. فحص الأخضر Cyanine (7B الشكل). تحقق تسلسل تناظر اثنين من الإكسونات يستبعد بعضها بعضا وتصميم اثنين من أزواج التمهيدي كل واحدة منها على وجه التحديد، ويكشف حصريا فقط واحد من المتغيرات لصق اثنين.
      ملاحظة: للحصول على PKM، التمهيدي العكسي anneals لاكسون 11 مشترك لكلا الخيارين، في حين أن الاشعال إلى الأمام هي متفاوتة محددة ويصلب لاكسون 9 (PKM1) أو اكسون 10 (PKM2).
   3. من أجل الكشف عن DDX5 كامل طول الجين، يصلب التمهيدي العكسي داخل اكسون تخطي (اكسون 12).
      ملاحظة: للكشف محدد من البديل DDX5 ΔEx12، التمهيدي العكسي يمتد الحدود exon11 / exon13. استخدام نفس التمهيدي إلى الأمام التي anneals لاكسون التأسيسي 10 لكل من ردود الفعل.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم amplicon بين 80 و 200 نقطة أساس.

المقايسات السمسة هو موضح في البروتوكول توفر طريقة موثوق بها وقوية لتقييم مقاومة الخلايا السرطانية إلى وكلاء العلاج الكيميائي في المختبر. عن طريق الفحص الإنتقالي العسكري، تم تحديد حساسية إلى التنفيذ المباشر في أربعة خطوط T-ALL الخلايا بما في ذلك خلايا CEM-WT الوالدين التنفيذ المباشر الحساسة، وثلاثة sublines مقاومة للالتنفيذ المباشر: CEM / R30dm، CEM-R5 وCEM-C3. كان لا بد من استخدامه نظرا إلى اختلاف كبير في حساسية بين CEM-WT (2 ميكرومتر - 0.97 نانومتر) نطاقين تركيز مختلفة، والتنفيذ المباشر خطوط الخلايا مقاومة (640 ميكرومتر - 0.33 نانومتر). وأظهر الفحص الإنتقالي العسكري بشكل واضح المقاومة التنفيذ المباشر في CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 ميكرومتر)، CEM-R5 (IC 50> 640 ميكرون) وCEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 ميكرومتر) بالمقارنة مع CEM- خلايا WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 ميكرومتر). وبالمثل أظهر فحص SRB المقاومة جيمسيتابين عالية في خط الخلية Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 ميكرومتر) مقارنة مع الوالدين الخلايا Panc 1 (IC 50 = 0.077 ± 0.03 ميكرومتر) أظهرت كما في الشكل (2).

بعد تأكيد المقاومة للأدوية في جميع خطوط الخلايا في الاعتبار، أننا تقدمنا ​​إلى جانب العزلة مرنا، وإعداد مكتبة والحمض النووي الريبي التسلسل. استخراج مجموع مرنا باستخدام الأعمدة تدور غشاء السيليكا هو الخيار المفضل عبر أساليب أخرى لأنه يتجنب الفينول والبروتين التلوث ويوفر نقاء عالية من العينة مع 260 نانومتر / 280 نسبة نانومتر الامتصاصية أعلى بكثير من 1.8. هذا هو شرط حاسم لتطبيقات المصب معقدة مثل تسلسل عميق. الطريقة المستخدمة للتحقق من سلامة عينات الحمض النووي الريبي التي كتبها الاغاروز 1٪ هو مناسبة خاصة لخلايا معزولة حديثا (الشكل 3). وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن المتغيرات لصق بديلة أعرب aberrantly في خطوط الخلايا مقاومة للأدوية، نختار selectio إيجابين مرنا مذيل بعديد الأدينيلات لإعداد مكتبة التسلسل، وذلك باستخدام عدة مرنا الذين تقطعت بهم السبل. وصفت Electropherograms المكتبات واحدة وتجمع في الشكل (4)، والتي تبين أن متوسط حجم جزء من حوالي 300 سنة مضت، بما يتفق مع متطلبات نظام التسلسل. وبعد ذلك التسلسل المكتبات التي تعد باستخدام رقاقة واحدة مع وضع القراءة 100 نقطة أساس. اختيار التسلسل يقرأ من 100 نقطة أساس ضروري للكشف عن الربط البديلة من خلال خطوط أنابيب بيوينفورمتيك المصب.

بعد خطوات المعالجة الأولية ومراقبة الجودة، ويقرأ نظيفة الانحياز إلى الجينوم البشري (hg19) تعرضوا للالتفاضلية تحليل الربط باستخدام الفرش. في هذا التحليل يمكننا إجراء مقارنات بين حساسة خط الخلية الوالدين المخدرات وكل من المخدرات في sublines مقاومة بشكل منفصل (أي، CEM WT مقابل CEM / R30dm، CEM WT مقابل CEM-C3، الخ). تعتمد MATS على نموذج إحصائي مرن ودقيقتستخدم لكشف الربط الفرق بين العينات. باستخدام خيارات التحليل الافتراضي وقيمة روزفلت <10٪ كحد قطع (كما هو مبين في الشكل 5B)، تمكنا من تحديد 38 ± 12 مرشحا الجينات كبير تقسم تفاضلي في المقارنة التي أمر بها نوع من الحدث الربط البديلة، مع معظم الزيارات تصنف على أنها تخطي اكسون. يوضح الشكل (6) إخراج تحليل نموذجي للمقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R.

ركزنا مزيد من دراستنا على اثنين من الأنواع الأكثر شيوعا من الأحداث الربط البديلة: اكسون الطفر والأحداث اكسون تبادلية مع مرشح ممثل واحد لكل فئة موضح أدناه. تم الكشف عن DDX5 (DEAD مربع هيليكاز 5) من خلال تحليل الحصير كما دلالة إحصائية في المقارنة CEM-WT مقابل CEM-C3 و CEM-R5، ولكن لم تكن كبيرة في المقارنة CEM-WT مقابل CEM / R30dm. ونظرا لدور المفترض في سرطان الدم 25،26، نحناختيار هذا المرشح لمزيد من التحقق من الصحة. يوصى بدرجة كبيرة لتصور البيانات RNA وما يليها في الجينوم مثل متصفح أداة. يوفر IGV واجهة تنوعا وسهلة الاستعمال لهذا الغرض، كما هو مبين في الشكل (7) لDDX5 مرشح الجينات. PKM (البيروفات كيناز العضلات ايزوزيم) هو حدث اكسون يتعارضان ذات دلالة إحصائية في المقارنة CEM-WT مقابل كل sublines التنفيذ المباشر مقاومة، ولكن ليس في المقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R. ونظرا لأهمية هذا الإنزيم في الأورام الصلبة الأيض 27،28 والدور المتنامي للاستقلاب الخلية في مقاومة القشرية السكرية في 29 T-ALL، نختار هذا المرشح لمزيد من التحقق من صحة باستخدام RT-PCR.

يجب أن تتم التصميم التمهيدي مع الحذر الشديد من أجل تضخيم amplicon الصحيح، وخصوصا عندما الاشعال يصلب لاكسون-اكسون الحدود (في حالة التمهيدي العكسي كشف DDX5 ΔEx12 البديل) أو عندما ريا يصلب لبعضها البعض الإكسونات حصرية مع ارتفاع تسلسل تناظر (اكسون 9 و 10 من اكسون PKM). ويبين الشكل 8 استراتيجية التصميم التمهيدي، بينما يظهر الرقم 9 نتائج من RT-PCR لمرشح DDX5 الجينات. تم الكشف عن DDX5 ΔEx12 في عينة CEM-WT وCEM / R30dm ولكن ليس في CEM-C3 و CEM-R5، مؤكدة بذلك البيانات الفرش بطريقة النوعي. Cyanine الأخضر QRT-فحص PCR الكمي بدقة مستويات التعبير مرنا من DDX5 ولصق PKM المتغيرات، كما هو مبين في الشكل 10 والرقم 11، على التوالي.

شكل 1: التمثيل التخطيطي من الربط الفعاليات البديلة. التمثيل التخطيطي من الأنماط الممكنة من الربط بديلة من الجين. مربعات والإكسونات المنفصلة التي يمكن تضمينها بشكل مستقل أو استبعادها من السيدNA نسخة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نتائج السمسة فحوصات. (أ) فحص MTT لخطوط الخلايا اللوكيميا يظهر مستويات عالية من المقاومة ديكساميثازون في CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98)، CEM-R5 (IC 50> 640 ميكرون) وCEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 ميكرومتر ) بالمقارنة مع الوالدين CEM-WT (IC 50 = 0.028 ± 0.003 ميكرومتر). المقايسات (ب) تعتبر الدار للخطوط الخلايا السرطانية في البنكرياس تكشف عن مستويات عالية من المقاومة جيمسيتابين في Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0.01 ميكرومتر) بالمقارنة مع الوالدين Panc 1 (IC 50 = 77.22 ± 2.76 نانومتر). تقرير الرسوم البيانية متوسط ​​نمو الخلايا٪ ± SEM من ثلاثة INDEPتجارب endent. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): تقييم جودة RNA باستخدام هلام الاغاروز. تم تشغيل مائتي نانوغرام من إجمالي مرنا في 1٪ agarose هلام ملطخة بروميد إيثيديوم. وجود عصابات سليمة الموافق 18S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الأنواع و28S وعدم وجود لطخات على أوزان جزيئية منخفضة تدل على الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4): <قوية> آثار Bioanalyzer المكتبات التسلسل. (A) Electropherograms المكتبات التسلسل تظهر قمم في حوالي 300 سنة مضت، مما يدل على نوعية جيدة. عينة 1-6 = CEM-WT، CEM-C3، CEM-R5، CEM / R30dm، Panc-1 وPanc-1R. (ب) رحلاني من العينات المجمعة (FU، الإسفار وحدات).

الشكل (5): الكشف عن التفاضلية الربط مع الفرش. (A) مقارنات المجموعة و (ب) النصوص المستخدمة لتشغيل الفرش. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6): <eم> MATS قائمة الإخراج. الرقم يصور الانتاج نموذجية من تحليل الفرش في برنامج مع جداول البيانات: هنا يتم الإبلاغ عن المرشحين تقسم تفاضلي في المقارنة Panc-1 مقابل Panc-1R للأحداث اكسون تخطي (روزفلت <10٪). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7: تصور التفاضلية الربط من DDX5 المرشح الجينات من خلال متصفح IGV الجينوم. الملفات مع الانحياز يقرأ (.bam) المقابلة لخلايا اللوكيميا تم تحميلها على المتصفح IGV الجينوم وتصور باستخدام قطع الساشيمي (العدد الأدنى تقاطع قيمة = 10 لتصور الأحداث الربط كبيرة). وتتمثل التهم لصق تقاطع طريق ربط الخطوط وعدد المقابلة لRNA وما يليها يقرأ تغطي الإكسونات. CEM-WT وCEM / R30dm تظهر تخطي التهم تمتد اكسون 11 إلى 13 اكسون مقارنة CEM-C3 و CEM-R5 التي لا تظهر أي اكسون 12 الطفر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8: التصميم التمهيدي لRT-PCR وCyanine الخضراء QRT-PCR. (A) RT-PCR: أزواج التمهيدي الكشف عن الربط التفاضلية من DDX5 يصلب لالإكسونات التأسيسية (اكسون 10 واكسون 13) الواقعة المنبع والمصب من الإكسونات تقسم بدلا من ذلك. (ب) QRT-فحص PCR: لتقدير نسبي النصوص الناتجة عن أحداث اكسون تخطي مقارنة النصوص الكنسي، التمهيدي العكسي anneals سواء داخل اكسون تخطي (البديل البديل) أوإلى حدود exon11 / exon13 (الكنسي البديل) من الجين DDX5. لتقدير الإكسونات يستبعد بعضها بعضا، التمهيدي العكسي anneals لاكسون 11 مشتركا لكل من الأشكال الإسوية، في حين أن التمهيدي يصلب الأمام إما إلى اكسون 9 (PKM1) أو اكسون 10 (PKM2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9: RT-PCR التحقق من DDX5 التفاضلية الربط. يظهر agarose هلام 1٪ الربط التفاضلية من الجين DDX5 في خلايا اللوكيميا. يتم تضخيمه جزء الموافق DDX5 amplicon كامل طول (650 بي بي) في جميع العينات في حين يتم تضخيمه DDX5 ΔEx12 (430 بي بي) البديل في CEM-WT وCEM / R30dm العينات وحجم يتوافق مع اكسون 12 الطفر. لم يتم الكشف عن هذا في الخلايا CEM-C3 و CEM-R5، وردعتستخرجه تحليل الفرش. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10: مستويات التعبير مرنا من DDX5 لصق المتغيرات في خلايا CEM. (A) QRT-فحص PCR. يعني مستويات التعبير النسبية والخطأ المعياري للمتوسط ​​(REL ± SEM) من تجربتين مستقلة. (ب) نسبة REL (± SEM) من المتغيرات لصق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: مرنا مستوى التعبيرالصورة من PKM لصق المتغيرات في CEM وPanc-1 الخلايا. (A) QRT-فحص PCR. يعني مستويات التعبير النسبية والخطأ المعياري للمتوسط ​​(REL ± SEM) من تجربتين مستقلة ونسبة REL من المتغيرات لصق لخلايا CEM. (ب) QRT-فحص PCR. يعني REL ± SEM من تجربتين مستقلة ونسبة REL (± SEM) من المتغيرات لصق لPanc-1 الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.