مقالة منهجية

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

DOI:

10.3791/54720

⸱

نوفمبر 8, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< فئة p = 'jove_content'>نقدم هنا طريقة لتطوير الخلايا التائية التنظيمية الخاصة بالمستضد الوظيفي (Ag) (Tregs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) للعلاج المناعي لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي في نموذج الفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض المناعة الذاتية تنشأ بسبب فقدان المناعة التسامح مع الذات. الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) هي سطاء مهمة من المناعية التسامح مع الذات. تمثل Tregs حوالي 5 - 10٪ من نضجا حيوانية خلايا CD4 + T في الفئران والبشر، مع حوالي 1-2٪ من تلك Tregs في الدم المحيطي. الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تكون متباينة في Tregs وظيفية، والتي لديها القدرة على استخدامها في العلاجات القائمة على خلية من أمراض المناعة الذاتية. هنا، فإننا نقدم وسيلة لتطوير المستضد (حج) Tregs -specific من iPSCs (أي IPSC-Tregs). وتستند هذه الطريقة على دمج عامل النسخ FoxP3 ومستقبلات الخلايا التائية حج محددة (TCR) في iPSCs ثم التمييز على خلايا OP9 انسجة التعبير عن الشق بروابط-دلتا مثل (DL) (1) وDL4. التالية في المختبر التمايز، وIPSC-Tregs التعبير عن CD4، CD8، CD3، CD25، FoxP3، وحج محددة TCR وتكون قادرة على الاستجابة لتحفيز حج.وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لعلاج خلية القاعدة من التهاب المفاصل المناعة الذاتية في نموذج الفئران. نقل بالتبني من هذه حج محددة IPSC-Tregs إلى التهاب المفاصل الناجم عن حج (AIA) الفئران -bearing لديه القدرة على تقليل التهاب المفاصل والانتفاخ ولمنع فقدان العظام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب المفاصل المناعي الذاتي هو مرض جهازي يتميز بتضخم الأنسجة الزليلية والتدمير التدريجي للغضاريف المفصلية والعظام والأربطة1. يساهم التوليد المعيب أو وظيفة Tregs في التهاب المفاصل المناعي الذاتي في الالتهاب المزمن وإصابة الأنسجة لأن Tregs تلعب دورا مهما في منع تطور الخلايا المناعية ذاتية التفاعل.

التلاعب ب Tregs هي استراتيجية مثالية لتطوير علاجات لقمع الالتهاب بطريقة تعتمد على Ag. بالنسبة للعلاج المناعي القائم على Treg ، فإن خصوصية Tregs المنقولة مهمة لعلاج المناعة الذاتيةالمستمرة 2. لإظهار النشاط القمعي ، تحتاج Tregs إلى الهجرة والاحتفاظ بها في المنطقة المنكوبة ، والتي يمكن توجيهها من خلال خصوصية TCR ل Ag في ذلك الموقع3. على الرغم من أن Tregs متعددة النسيلة قد تحتوي على مجموعة صغيرة تحتوي على خصوصية Ag هذه من TCRs الخاصة بهم ، إلا أن أعداد Tregs الخاصة ب Ag عادة ما تكون منخفضة. وبالتالي ، فإن العلاجات القائمة على الخلايا التي تستخدم Tregs متعددة النسيلة ضد اضطرابات المناعة الذاتية تتطلب عمليات نقل بالتبني لعدد كبير من Tregs4،5. نظرا لأن الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) لديها القدرة على التطور إلى أي نوع من الخلايا ، فقد تثبت PSC-Tregs الخاصة ب Ag أنها مرشحة جيدة للعلاج المناعي القائم على Treg. أظهرت الدراسات السابقة التطور الناجح للخلايا التائية المشتقة من PSC ، بما في ذلك Tregs6-8.

هنا, نصف بروتوكولا لتطوير iPSC-Tregs الخاصة ب Ag. نصف أيضا علاجا قائما على الخلايا لالتهاب المفاصل المناعي الذاتي في نموذج الفئران باستخدام مثل هذه Tregs. وتستند هذه الطريقة على تعديل وراثيا iPSCs الفئران مع TCRs الخاصة Ag وعامل النسخ FoxP3. ثم تتمايز iPSCs هندسيا إلى Tregs الخاصة Ag على الخلايا اللحمية OP9 التي تعبر عن روابط الشق DL1, DL4, و MHC-II (I-Aب) جزيئات في وجود السيتوكينات mFlt3L و mIL-7. يمكن أن تنتج هذه iPSC-Tregs الخاصة ب Ag السيتوكينات القمعية ، مثل TGF-β و IL-10 ، عند تحفيزها باستخدام Ag ، والنقل بالتبني لمثل هذه Tregs لديه القدرة على قمع تطور AIA في نموذج الفئران. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لتطوير Tregs الخاصة بالخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية للتدخلات العلاجية المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل جامعة ولاية بنسلفانيا لجنة رعاية الحيوان الطب (IACUC بروتوكول # 45470) وتتم وفقا للمبادئ التوجيهية للجمعية لتقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوان.

زراعة الخلايا الجذعية 1.

  1. احتضان طبق 10 سم مع 10 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية (حاضنة) لمعطف لوحة.
  2. إزالة الجيلاتين من الطبق ولوحة 3 × 10 6 المشع SNL76 / 7 الخلايا واحتضان لمدة يوم واحد في 37 ° C (حاضنة) باستخدام 10٪ DMEM وسائل الاعلام (FBS 10٪ و 1٪ الستربتومايسين البنسلين).
  3. إزالة وسائل الإعلام من لوحة وiPSCs ثقافة إذابة على / 7 طبقة تغذية الخلايا SNL76 باستخدام التوجيهية وسائل الإعلام (وسائل الاعلام DMEM تحتوي على 15٪ مصل العجل الجنين، 0.1 مليمول / لتر الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 0.1 مليمول / لتر β-المركابتويثانول) 9. لى خلية الماوس IPS-MEF-NG-20D-17شمال شرق، والتي كان المستحث من الخلايا الليفية الماوس الجنينية التي كتبها ترنسفكأيشن الفيروسية الرجعية من Oct3 / 4، Sox2، Klf4، وج. Myc على، تم الحصول عليها من الدكتور شينيا ياماناكا (معهد للعلوم الطبية الحدودي، جامعة كيوتو، كيوتو، اليابان).
  4. تغيير وسائل الإعلام في يوم 3 مع وسائل الإعلام الجديدة ومراقبة المستعمرات IPSC تحت المجهر.
    ملاحظة: هذه المستعمرات صغيرة، مجموعات لامعة أو خلايا مستديرة مع ترسيم الحدود واضحة تظهر التعبير GFP تحت المجهر الفلورسنت.

2. التمايز في المختبر من حج محددة IPSC-Tregs

  1. توليد بنيات لاستخدامها في تنبيغ فيروسات من الجينات OT-II TCR الاستنساخ الفرعية وFoxP3 إلى البلازميد MIDR 10 مرتبطة مع الشق الذاتي 2A الببتيد لجعل بناء MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
  2. أداء تنبيغ فيروسات 9 من iPSCs باستخدام خلايا بلات E كخط خلية التعبئة والتغليف.
  3. في اليوم 0 والبذور OP9-DL1-DL4-IA ب خلاياتا أدنى كثافة من 10 4 خلية / سم 2 باستخدام وسائط OP-9 وسائل الإعلام (α-MEM تحتوي على 20٪ FCS و 2.2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم. بلايت 1 × 10 6 خلايا في صحن 10 سم.
  4. في اليوم 3، عندما تصبح OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب 80-90٪ متموجة، وإزالة وسائل الإعلام والبذور 0،5-1 × 10 5 iPSCs على OP9-DL1-DL4 - خلايا ألف برميل في OP-9 وسائل الإعلام.
    ملاحظة: هذا يؤسس لثقافة مشتركة من iPSCs على OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب ويعتبر اليوم 0 من التمايز 9.
  5. في يوم 5، وإزالة وسائل الاعلام من الطبق 10 سم بواسطة الشفط، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ونضح برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 8 مل أخرى من وسائل الاعلام التوجيهية للخلايا، إعادة تعليق عليها، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. نضح طاف وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام التوجيهية. احتضان هذه الخلايا إعادة علقت على الطازجة طبق 10 سموالعودة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا المغذية ب OP9-DL1-DL4-IA والحفاظ على iPSCs التفريق عائمة في وسائل الإعلام. الحفاظ على خلايا ب OP9-DL1-DL4-IA بشكل مستمر لتحقيق 80-90٪ confluency لمزيد من الثقافة المشتركة.
    2. بعد 30 دقيقة، وجمع الخلايا العائمة، تصفية لهم من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون، وعدد الخلايا مع عدادة الكريات.
  6. البذور 5 × 10 5 من iPSCs إلى الطازجة 80-90٪ متموجة من OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب في وسائل الإعلام OP9. استكمال وسائل الإعلام مع mFlt-3L بتركيز نهائي من 5 نانوغرام / مل.
  7. في يوم 8، وجمع iPSCs متباينة جزئيا عن طريق غسل لوحة مع وسائل الإعلام من الطبق نفسه باستخدام ماصة 10 مل. استخدام 5 مل أخرى من OP-9 وسائل الإعلام في الطبق لغسل بلطف خلايا شبه ملتصقة من الدقيق، pipetting لقوي حتى لا كسر أحادي الطبقة OP9 في قاع الطبق. تكرار غسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لحصاد كل نصف الإعلانيةherent تمييز الخلايا.
    1. الجمع بين كل من يغسل، وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة تعليق في 10 مل من وسائل الاعلام OP9 تحتوي على mFlt-3L (5 نانوغرام / مل)، وMIL-7 (1 نانوغرام / مل)، وتصفية من خلال 70 ميكرومتر مصفاة الخلية.
  8. نقل الخلايا إلى لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على 80 - 90٪ متموجة OP9-DL1-DL4-IA ب الخلايا، كما في الخطوة 1.1. نقل الخلايا تحصد من واحد طبق 10 سم في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا.
  9. في يوم 10، وتغير نصف وسائل الإعلام من الخلايا إلى وسائل الإعلام OP9 جديدة تستكمل مع mFlt-3L (5 نانوغرام / مل)، وMIL-7 (1 نانوغرام / مل). كرر هذه الخطوة كل يومين.
  10. كل 4-6 أيام، وهذا يتوقف على النمو، وإعادة البذور وiPSCs تمييز على لوحات مع طبقة جديدة من OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب، كما هو موضح في الخطوة 1.1.

3. تقييم في المختبر Treg التمايز والنضج

  1. التغيرات المورفولوجية للiPSCs التفريق.
    1. موnitor المشارك ثقافة iPSCs مع OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب كل يوم من خلال مراقبة الخلايا الحية تحت المجهر brightfield التقليدية (20X). يوم 5، ومراقبة مستعمرات ذات الخصائص مثل الأديم المتوسط، مثل خلايا بالارض. يوم 8، ومراقبة، كتل مستديرة صغيرة من الخلايا، التي تمثل خلايا التفريق.
    2. استخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق إلى عدد الخلايا للكشف عن عدد ونسبة الخلايا الحية. حساب بقاء الخلية حيث بلغ عدد خلايا قابلة للحياة مقسوما على العدد الكلي للخلايا داخل شبكات الأربعة على عدادة الكريات. إذا أخذ خلايا تصل التريبان الأزرق، والنظر في وفاتهما أو غير قابلة للتطبيق. تسجيل عدد من الخلايا الحية التي تحصد من الثقافة.
  2. التدفق الخلوي تحليل التفريق iPSCs.
    1. في أيام 5 و 7 و 11 و 15 و 19 و 21 و 28 من شارك في الثقافة، وإزالة الخلايا مع 0.25٪ التربسين كما في الخطوة 25.
    2. قبل تلطيخ السطح مع مختلف الأجسام المضادة تألقي مترافق، incubatه 1 × 10 6 الخلايا مع 100 ميكرولتر من التيسير 2.4G2 مانع المخفف في برنامج تلفزيوني (تركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لمنع ملزم من الأجسام المضادة لمستقبلات التيسير على سطح الخلية.
    3. في أيام 5 و 7 و 11 و 15 و 19 و 21، و 28، استخدم 1 × 10 6 خلايا لالتدفق الخلوي مع مختلف الأجسام المضادة تألقي مترافق للكشف عن علامات سطح الخلية، بما في ذلك CD3، TCRβ، CD4، CD8، CD25، وCTLA4.
    4. بعد كتلة التيسير، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وصمة عار مع مختلف الأجسام المضادة تألقي مترافق لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم قم بإجراء تحليل تدفق cytometric مع لون 15 تدفق عداد الكريات. استخدام 0.200 ميكروغرام من الأجسام المضادة في 10 6 خلايا مخففة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    5. في يوم 28، وتحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي 11 و البوابة على CD4 + CD8 + الخلايا باستخدام CD4 و CD8-تألقي مترافق تلطيخ. تحليل للتعبير عن TCRVα2، TCRVβ5، CD25، CTLA-4، وFoxP3 (الشكل 1). لFoxP3 تلطيخ، إصلاح الخلايا وpermealize منهم ثم قم بإجراء تلوين الأجسام المضادة 11.
  3. في التحفيز مستضد المختبر من iPSCs.
    1. في يوم 28 من شارك في الثقافة، الحصاد IPSC-Tregs من الثقافات من خلال جمع الخلايا العائمة. يعرض للتريبسين بقية الخلايا مع 0.25٪ التربسين (كما في الخطوة 2.5) وإعادة تعليق الخلايا في 8 مل من وسائل الاعلام التوجيهية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج في درجة حرارة الغرفة، نضح في وسائل الإعلام، ومرة ​​أخرى إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام.
      1. احتضان إعادة علقت خلايا في طبق جديد 10 سم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وجمع الخلايا العائمة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة.
    2. احتضان 3 × 10 6 splenocytes من الطحال من C57BL / 6 Rag1 - / - الفئران مع 5 ميكرومتر الببتيد ألبومين البيض في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام (OVA 323-339) في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 96 لوحة جيدا 11.
    3. مزيج Tregs مع OVA 323-339 -pulsed splenocytes في نسبة 1: 4 (استخدام 0.75 × 10 6 Tregs). احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 40 ساعة. في ساعة 4 الماضية، إضافة 4 ميكرولتر من المخفف Brefeldin وفي الثقافة (1،000x التركيز الفعلي، مخففة في وسائل الإعلام ثقافة 1X).
    4. حصاد الخلايا مع 0.25٪ التربسين (كما في الخطوة 2.5)، ويغسل مع 10٪ نان 3 و 0.5 M حل EDTA (FACS العازلة)، كتلة مع 100 ميكرولتر من المخفف (تركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل) التيسير مانع 2.4G2، وصمة عار لعلامات سطح، CD4، CD8، TCRVα2، وTCRVβ5 كما في الخطوات 3.2.3-3.2.4.
    5. إصلاح الخلايا مع حل بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني وpermeabilize مع 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization 1X بعد تلطيخ سطح الخلية. تنبيه! امتصاص العرق هو الحساسية المسببة للسرطان، والسموم في الجسم.
    6. وصمة عار على الخلايا مع تألقي مترافق TGF-β و IL-10 لمدة 20 دقيقة في الظلام. استخدام 0.200 ميكروغرام من الأجسام المضادة / 10 6 خلايا مخففإد في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كشف إنتاج الخلايا من TGF-β و IL-10 مع 15 لونا تدفق عداد الكريات (الشكل 2).
    7. غسل الخلايا ثلاث مرات مع العازلة FACS الباردة مسبق لتحليل تدفق cytometric 11.
  4. في استمرار المجراة من حج محددة IPSC-Tregs.
    1. بعد 8 أيام من الثقافة المشتركة على OP9-DL1-DL4-IA خلايا ب، نقل التوجيهية المستمدة قبل Tregs (Thy1.2) كما في الخطوة 3.3.1 إلى خاصتك 1.1 الفئران مسانج (4-6 أسابيع من العمر) عن طريق ذيل حقن الوريد دون تخدير. قبل إجراء حقن الوريد الذيل، وتمدد الوريد الذيل باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لمدة 5 دقائق. بعد اتساع الوريد الذيل، ضع الماوس في رادع وadoptively نقل 3 × 10 6 خلايا معلق في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق حقن عن طريق الوريد الذيل.
    2. بعد ستة أسابيع من نقل Treg، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. تأكد من أن ميلم لا يتنفس. فتح التجويف البريتوني عن طريق قطع الجلد الخارجي للالبريتوني باستخدام مقص وملقط وسحب مرة أخرى لفضح الجلد الداخلي المبطن للتجويف البريتوني بلطف. عزل الطحال والغدد الليمفاوية الطرفية للحقن خاصتك 1.1 الفئران مسانج.
    3. جمع الخلايا من العقد الليمفاوية والطحال وباستخدام كسر الميكانيكية لتسفر عن تعليق خلية واحدة. احتضان الخلايا مع 5 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 5 دقائق على RT لليز خلايا الدم الحمراء. جمع وغسل المتبقية splenocytes أو الخلايا الليمفاوية مع 10 مل من العازلة FACS الباردة.
    4. بعد غسل، وعلاج الخلايا التي تحتوي على 2.4G2 مانع التيسير عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة كما في الخطوة 3.2.2 وصمة عار مع 100 ميكرولتر من المخفف مكافحة خاصتك 1.2 الأجسام المضادة تألقي مترافق.
    5. غسل الخلايا مع 10 مل من FACS العازلة، والشروع في تحليل تدفق cytometric 11.

4. في فيفو النضج وقمع التهاب المفاصل المناعي الذاتي

  1. توليد بنيات كما في الخطوة 2.1.
  2. أداء تنبيغ فيروسات 9 كما في الخطوة 2.2.
  3. في المفاضلة المجراة وتحريض التهاب المفاصل في فئران.
    1. التفريق OT-II TCR /-transduced FoxP3 iPSCs (OT-II-FoxP3 / iPSCs)، iPSCs-transduced FoxP3، وعن dsRed iPSCs transduced على الخلايا ب انسجة OP9-DL1-DL4-IA في وجود السيتوكينات mFlt-3L و MIL-7 لمدة 8 أيام كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،6.
    2. Trypisinize جميع الأنواع الثلاثة من الخلايا من لوحة 10 سم وإعادة تعليق الخلايا من كل لوحة 10 سم في 10 مل من وسائل الإعلام الجديدة. إضافة الخلايا إلى 10 سم جديدة لوحة والعودة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة، وجمع العائمة الخلايا.
    3. تمر الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون لإزالة مجموعات الخلايا والعد باستخدام عدادة الكريات. ضبط الخلايا إلى تركيز 1.5 × 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني الباردة وتصفية مرة أخرى إذا لزم الأمر. تبقي الخلايا على الجليد حتى نقل خلية بالتبني في الفئران.
    4. ضخ 200 ميكرولتر من تعليق خلية (3 × 10 6 خلايا) إلى ثلاث مجموعات مختلفة من 4 - القديمة أسابيع 6 الإناث C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد الذيل كما هو موضح في 3.4.1
    5. في يوم 10 بعد نقل الخلايا، حقن الفئران مع 100 ميكروغرام من الإصدارين مستحلب في مساعد فرويند كاملة في قاعدة الذيل باستخدام حقنة 1 مل.
    6. في يوم 17، تخدير الفئران باستخدام المرذاذ الأيزوفلورين (وفقا لمبادئ توجيهية IACUC). الاستفادة من 4-5٪ الأيزوفلورين لتحريض و1-2٪ للصيانة. حمل التهاب المفاصل عن طريق الحقن داخل المفصل من 20 ميكروغرام الإصدارين في 10 ميكرولتر PBS في الركبة اليسرى المشتركة ومن 20 ميكروغرام الإصدارين و 100 ميكروغرام OVA كله في 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني في حق مفصل الركبة. يمكن وضعها في الغذاء وgelpack في الطابق الفراش بعد أن وضعت التهاب المفاصل. سوف يتم التخلص الفئران: حالة الجسم نتيجة (BCS) من 2/5 أو المحتضر، دنف الشديد و / أو الاستلقاء المستمر (فترة 24 ساعة)، وشدة درجة 4. في النتيجة4، حمامي وتورم شديد تشمل الكاحل والقدم وأرقام، أو قسوط من أطرافهم.
  4. توصيف iPSCs OT-II TCR /-transduced FoxP3.
    1. استخدام المجهر الفلورسنت (20X) لتصور الخلايا عن dsRed + GFP + الحية غير المثبتة.
    2. دراسة التكامل الجينات والتعبير من قبل كل من لطخة غربية والتدفق الخلوي 11.
  5. تطوير Treg والنضج.
    1. في الأسابيع 2 و 4 و 6 بعد نقل الخلايا، الموت ببطء الفئران. للقتل الرحيم، في كل قفص استخدام 1-2 لتر من CO 2 في المرحلة الأولى. وبمجرد أن الحيوان قد فقد وعيه، وزيادة معدل تدفق CO 2 4 - 5 لترات / دقيقة. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق. عزل الطحال واستنزاف الغدد الليمفاوية عن طريق قطع الجلد الخارجي للالبريتوني باستخدام مقص وملقط وسحب مرة أخرى لفضح الجلد الداخلي المبطن للتجويف البريتوني بلطف.
    2. جمع واحدة تعليق خلية ومدمج الطحال والغدد الليمفاوية التي كتبها عطل ميكانيكي باستخدام مصفاة الخلية وحقنة 1 مل في 1٪ وسائل الاعلام التوجيهية. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي يحتوي على وسائل الاعلام في 400 غ لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل من تحلل العازلة ACK إلى ليز خلايا الدم الحمراء. إعادة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق بيليه خلية وغسل splenocytes المتبقية أو الخلايا الليمفاوية مع العازلة FACS الباردة. اتبع الخطوات 3.4.4 - 3.4.5، والشروع في تحليل تدفق cytometric.
  6. تلطيخ الخلايا.
    1. في يوم 50 بعد التحدي، عزل الطحال واستنزاف الغدد الليمفاوية من الفئران (كما في الخطوة 4.5.1) بعد euthanization من CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم.
    2. جمع تعليق خلية واحدة من الطحال والغدد الليمفاوية التي كتبها عطل ميكانيكي باستخدام مصفاة الخلية وحقنة 1 مل. احتضان splenocytes في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع 5 مل من تحلل العازلة ACK إلى ليز خلايا الدم الحمراء. جمع وغسل ليالي المتبقيةplenocytes أو الخلايا الليمفاوية مع العازلة FACS الباردة. اتبع الخطوات 3.2.3 - 3.2.4، ولكن وصمة عار مع علامات سطح CD4، CD8، CD25، وTCRVβ5.
    3. الشروع في إصلاح خلايا لتلطيخ الخلايا كما هو موضح في 3.3.5 - 3.3.7 وتحليل إنتاج الخلايا خلوى (TGF-β و IL-10) من Tregs المستمدة التوجيهية وبوابة على الخلايا الحية CD4 + CD25 +.
  7. تسلل Tregs حج محددة في الركبتين وقمع التهاب المفاصل.
    1. الخطوات التالية (4.3 - 4.3.6) في أيام 7-14 بعد التهاب المفاصل الاستقراء، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم (وفقا لمبادئ توجيهية IACUC). إزالة الشعر من الركبتين مع المقص الكهربائي واستئصال الركبتين قبل إجراء العمليات الجراحية.
    2. إزالة الجلد من الأرجل عن طريق شق في الساق الخلفية مع مقص حادة في نهاية وقطع الجلد في الفخذ وصولا الى الكاحل. قشر بلطف الجلد فوق الساق والقدم لفضح العضلات. إزالةعضلة من المحطة بعناية دون الإضرار مفصل الركبة.
      1. قطع الساق الخلفية فقط فوق الحوض مفصل الورك / وقطع الساق باستخدام مقص حاد تشريح.
    3. إصلاح الركبتين في 4٪ من الفورمالين لمدة 48 ساعة. يزيل الكلس الركبتين باستخدام 2.5 M حمض الفورميك. شطف ثلاث مرات في الزيلين لمدة 3 دقائق، وشطف مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪، وشطف مرتين في 95٪ من الإيثانول، شطف مرتين في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة، ويزيل الكلس في 1 ملم EDTA. علاج عند درجة حرارة الغليان الفرعية (90 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    4. تبريد الأنسجة الثابتة لمدة 30 دقيقة. شطفه مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 4 دقائق وتضمين ذلك في البارافين. يذوى الأنسجة من خلال سلسلة من الحمامات الايثانول لتهجير المياه، ومن ثم التسلل منها مع الشمع. ثم تضمين الأنسجة تسلل إلى كتل الشمع. تنفيذ كل باجتزاء الرأسي والأفقي للتلطيخ. إعداد 4 ميكرون المقاطع مع مشراح انزلاق.
    5. أداء مناعي تلطيخ على أقسام بعد إجراءات موحدة من deparaffinization والإماهة يستخدم الزيلين والايثانول 12.
    6. منع النشاط البيروكسيداز الذاتية عن طريق غمر الشريحة في كمية كافية من 3٪ من محلول بيروكسيد الهيدروجين لمدة 3 دقائق بعد استرجاع حج. الشرائح كتلة لغير محددة ملزمة في 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب لمدة 60 دقيقة.
    7. أقسام وصمة عار مع 200 ميكرولتر من-تألقي مترافق TCRVβ5 الضد المخفف 1: 100 في عرقلة الحل. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 75 - غرفة ترطيب 100٪، ويغسل 5 مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
    8. مباين الشرائح لتلطيخ النووي مع كاشف antifade تحتوي على دابي. إضافة ما يقرب من 300 ميكرولتر من دابي حل تلطيخ المخفف (300 نانومتر في برنامج تلفزيوني 1X) إلى ساترة، والتأكد من أن يتم تغطية ساترة بأكملها. تخزين الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية حتى التحليل تحت المجهر فلوري (الشكل 3).
  8. التهاب المفاصل قمع مقايسة
    1. قياس تورم الركبتين من الفئران قبل تحريض التهاب المفاصل باستخدام الفرجار الطلب مقياس لإنشاء خط الأساس.
    2. اتبع الخطوات (4.3 - 4.3.6) لتحريض التهاب المفاصل ونقل Treg. قياس الركبتين الماوس الاتصال الهاتفي مع عيار نقل الفرجار بعد Treg.
    3. حساب الزيادة في المئة في قطر الركبة: نسبة الزيادة = (قطر الركبة يوم 1 - قطر الركبة يوم 0) / قطر الركبة يوم 0.
  9. قياس الدمار المشترك وتسلل خلية التهابات في الركبتين من الأنسجة (الشكل 4).
    1. في يوم 7 بعد التهاب المفاصل التعريفي، والموت ببطء الفئران كما هو موضح سابقا واستئصال الركبتين قبل إجراء العمليات الجراحية. راجع الخطوة 4.7.1 - 4.7.2.
    2. إصلاح الركبتين في 4٪ فورمالين، يزيل الكلس في EDTA، وتضمينها في البارافين. راجع الخطوة 4.7.3
    3. إزالة ركبتيه، إصلاح في 10٪ من الفورمالين، وكلس في Formical-4. تضمين الأنسجة في البارافين، قسم في 4 ميكرون، وصمة عار مع hematoxylفي ويوزين (H & E) أو سفرانين يا تلطيخ (كما في الخطوة 4.7.7) ومراقبة تحت المجهر.
    4. استخدام H & E تلطيخ لتقييم تآكل العظام مع نظام التهديف شبه كمي (0: لا تقرحات؛ 4: تقرحات الموسعة وتدمير العظام). استخدام سفرانين يا تلطيخ لتقييم فقدان بروتيوغليكان ويسجل مع نظام التهديف شبه كمي (0: عدم فقدان بروتيوغليكان؛ 3: فقدان كامل للتلطيخ لبروتيوغليكان).
      1. استخدام نظام شبه الكمية هدفا ليسجل تسلل التهابات الخلايا على الشرائح H & E الملون (0: لا يوجد تسلل خلية؛ 4: كثرت تسلل خلية). تقييم الدرجات من خلال دراسة ركبتيه بطريقة أعمى.

5. قياس فقدان العظام في الركبتين مع نظام (الدقيقة CT) التصوير المقطعي الصغيرة عالية الدقة

  1. في يوم 10 وظيفة-التهاب المفاصل التعريفي، وتخدير الفئران مع 2٪ الأيزوفلورين والاستعداد للتصوير.
  2. موقف هيئة التصنيع العسكريه مع الركبتين تواجه صعودا في الغرفة.
  3. استخدام عالية الدقة نظام الصغرى CT للحصول على في التصوير المجراة من بنية العظم حول الركبتين من الفئران.
  4. القيام بمسح الدقيقة CT بطول 2.2 مم، بما في ذلك المفاصل الماوس الركبة مع المعلمات التالية: 10.5 حجم ميكرون فوكسل في 55 كيلو فولت، 145 أمبير 200 مللي ثانية الوقت التكامل، 211 الصور.
  5. استيراد الصور الصغيرة المقطعية وصور طائرة التقاط أمامي بعد مزيد من معالجة الصور (حجم التقديم والتحول) (الشكل 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو موضح هنا، في يوم 28، وأعرب حج محددة Tregs كبير CD3 وحج محددة TCR، وهما علامات الخلايا التائية. أعرب السكان CD3 + TCRVβ5 + CD4. معظم CD3 + TCRVβ5 + CD4 + خلايا أعرب أيضا CD25، CD127، وCTLA-4، التي يتم التعبير عنها عادة عند مستويات مرتفعة في طبيعيا البندان T (nTregs) وخلايا T معربا عن FoxP3 ectopically. التعبير FoxP3 في الخلايا المشتقة التوجيهية قد استمر حتى بعد فترة طويلة الأجل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، خطوة حاسمة هي التمايز في المختبر من / FoxP3 iPSCs-transduced الجينات TCR. في المختبر الشق يشير تحرض التطور نحو الخلية النسب تي. للتمييز iPSCs في CD4 + FoxP3 + Tregs، استخدمنا OP9-DL1 / DL4 / IA خلايا ب، التي صريحة للغاية MHC II (IA ب) الجزيئات. معظم iPSCs التمايز إلى خلايا CD4 +. ومع ذلك، وبعد التعبير TCR السطح، تفقد العديد من الخلايا ما قبل-T متباينة القدرة على التفريق ويموت في نهاية المطا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا المشروع، في جزء منه، في إطار المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01AI121180، R21AI109239 وK18CA151798)، والجمعية الأمريكية للسكري (1-16-IBS-281)، ووزارة الصحة ولاية بنسلفانيا (صناديق تسوية التبغ) ل JS

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C57BL / 6j الفئرانمختبر جاكسون664
B6.129S7 Rag1tm1Mom / JJackson Laboratory2216
الأجسام المضادة المضادة ل CD3 (2C11)BD Pharmingen553058
المضاد ل CD28 (37.51) الجسم المضادBD Pharmingen553295
الأجسام المضادةBiolegend100417
Anti-CD8 ( 53 & ndash ؛ 6.7) الأجسام المضادةBiolegend100714
الأجسام المضادة Biolegend101912
Anti-TCR- & beta ؛ (H57597) الجسم المضادBiolegend109220
Anti-IL10Biolegend505010
Anti-TGF & beta ؛Biolegend141402
DMEMInvitrogenABCD1234
& alpha ؛ -MEMInvitrogenA10490-01
FBSHycloneSH3007.01
Brefeldin ASigmaB7651
PolybreneSigma107689
GenejammerIntegrated Science204130
ACK Lysis BufferLonza10-548E
mFlt-3Lpeprotech250-31L
mIL-7peprotech217-17
الجيلاتينSigmaG9391
ParaformaldehydeSigmaP6148-500Gتحذير: مسببات الحساسية ، مسرطنة ،
النفاذية السامة عازلةBiolegend421002
mBSASigmaA7906
Ova albuminAvantor0440-01
CFADifco2017014
Tailveiner RetrainerBraintree ScientificRTV 150-STD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
  2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
  3. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
  4. van Herwijnen, M. J., et al. Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).
  5. Wright, G. P., et al. Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).
  6. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  7. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105, 1431-1439 (2005).
  8. Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells. Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).
  9. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. J Vis Exp. , e3986(2012).
  10. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).
  11. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).
  12. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. , (2007).
  13. Lu, L., et al. Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).
  14. Wu, C., et al. Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells. Immunity. 41, 270-282 (2014).
  15. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).
  16. Ramos, C. A., et al. An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies. Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).
  17. Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development. Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).
  18. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).
  19. Kim, Y. C., et al. Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses. Blood. 125, 1107-1115 (2015).
  20. Himburg, H. A., et al. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat Med. 16, 475-482 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Stem Cell derived TregsAntigen specific TregsiPSC DifferentiationOP9 Stromal CellsFoxP3 ExpressionTCR TransductionAdoptive TransferAutoimmune ArthritisJoint InflammationBone Loss

مقالات ذات صلة