يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ارتفاع الدهون تغذية النموذج لليرقات اسماك الزرد: التغذية، يعيش التصوير، والكمي لتناول الطعام

10.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54735

⸱

أكتوبر 27, 2016

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> تبرز أسماك الزرد كنموذج قيم لمعالجة الدهون الغذائية وأمراض التمثيل الغذائي. الموصوفة هي بروتوكولات أعلاف اليرقات الغنية بالدهون ، والتصوير الحي لنظائر الدهون الفلورية الغذائية ، والقياس الكمي لتناول الطعام. يمكن تطبيق هذه التقنيات على مجموعة متنوعة من تقنيات الفحص والتصوير والفرضيات.

الملخص

تبرز أسماك الزرد كنموذج لمعالجة الدهون الغذائية وأمراض التمثيل الغذائي. يصف هذا البروتوكول كيفية إطعام يرقات الزرد وجبة غنية بالدهون ، والتي تتكون من مستحلب من الجسيمات الشحمية لصفار بيض الدجاج التي تم إنشاؤها عن طريق صوتنة صفار البيض في وسط الجنين. يتم توفير تعليمات مفصلة لفحص اليرقات لاستهلاك صفار البيض حتى لا تربك اليرقات التي تفشل في التغذية النتائج التجريبية. يمكن أن ترفع الجسيمات الشحمية صفار بيض الدجاج مع نظائر الدهون الفلورية ، بما في ذلك الأحماض الدهنية والكوليسترول ، مما يتيح التصور الجهازي وتحت الخلايا لمعالجة الدهون الغذائية. يتم وصف عدة طرق لتركيب اليرقات التي تساعد على التصوير الحي على المدى القصير والطويل مع كل من الأهداف المستقيمة والمقلوبة عند التكبير العالي والمنخفض. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم اختبار لتحديد كمية طعام اليرقات عن طريق استخراج دهون اليرقات التي تتغذى على نظائر الدهون الفلورية ، واكتشاف الدهون على لوحة كروماتوغرافيا رقيقة ، وتحديد الفلورة. أخيرا ، تتم مناقشة الجوانب الحاسمة للإجراءات ، والضوابط المهمة ، وخيارات تعديل البروتوكولات لمعالجة أسئلة تجريبية محددة ، والقيود المحتملة. يمكن تطبيق هذه التقنيات ليس فقط على الاستفسارات المركزة التي تعتمد على الفرضيات ، ولكن أيضا على مجموعة متنوعة من الشاشات وتقنيات التصوير الحي لدراسة التمثيل الغذائي للدهون والتحكم في تناول الطعام.

المقدمة

الآليات التي الأمعاء وينظم معالجة الدهون الغذائية، يتحكم الكبد معقد تركيب الدهون والبروتين الدهني التمثيل الغذائي، وكيف تعمل هذه الأجهزة مع الجهاز العصبي المركزي للسيطرة على استهلاك المواد الغذائية غير مفهومة تماما. ومن المثير للاهتمام الطبية الحيوية لتوضيح هذه الأحياء في ضوء الأوبئة الحالية من السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري، وغير الكحولية مرض الكبد الدهني. وقد وفرت دراسات في زراعة الخلايا والفئران غالبية فهمنا للعلاقات الآلية بين الدهون الغذائية والمرض، والزرد (دانيو rerio) والناشئة باعتبارها نموذجا مثاليا لتكمل هذا العمل.

الزرد يكون الجهاز الهضمي مماثل (GI) أجهزة، التمثيل الغذائي للدهون، ونقل البروتين الدهني إلى الفقاريات العليا 1،2، تتطور بسرعة، وولين العريكة وراثيا. وضوح البصرية من الزرد اليرقات يسهل الدراسات المجراة، وparticulaميزة ص لدراسة نظام GI كما محيطها خارج الخلية (أي الصفراء، والجراثيم، والغدد الصماء الإشارات) يكاد يكون من المستحيل لنموذج خارج الحي. وفقا، مجموعة من البحوث التي تجمع بين قابلية الإستطراق الجيني والسببية للعيش التصوير من يرقات الزرد مع مجموعة متنوعة من التلاعب الغذائية (نسبة عالية من الدهون 3،4، -cholesterol 5، والوجبات الغذائية -carbohydrate 6،7)، ونماذج من مرض القلب والأوعية الدموية 8، مرض السكري 9،10، الكبد تنكس دهني 11-13، والسمنة 14-16، والناشئة لتقديم مجموعة من الأفكار التمثيل الغذائي.

جانبا أساسيا من الانتقال الزرد اليرقات في أبحاث الأيض هو تعظيم الاستفادة من التقنيات المتقدمة في الحيوانات نموذج الأخرى في الزرد وتطوير فحوصات جديدة التي تستغل نقاط القوة الفريدة من الزرد. ويعرض هذا البروتوكول التقنيات المتقدمة والأمثل لتغذية اليرقات الزرد في معهد العلوم الإندونيسيد غنية وجبة، تصور معالجة الدهون الغذائية من الجسم كله لقرار التحت خلوية، وقياس الاستهلاك الغذائي. وقد تم اختيار الدجاج وصفار البيض لتكوين وجبة غنية بالدهون لأنها تحتوي على مستويات عالية من الدهون والكوليسترول (الدهون يؤلف ~ 58٪ من صفار البيض والدجاج، منها ~ 5٪ هي نسبة الكوليسترول، و 60٪ من الدهون الثلاثية، و 35٪ من الدهون الفوسفاتية ). ويقدم الدجاج صفار البيض المزيد من الدهون من الأطعمة التقليدية التجارية الزرد micropellet (~ 15٪ نسبة الدهون) وميزة أنه تغذية موحدة مع النسب المعروفة أنواع معينة من الأحماض الدهنية، والحمية الغذائية الزرد وأفواج التغذية لم موحدة عبر مختبرات (17). وعلاوة على ذلك، النظير الدهون الفلورسنت المنصوص عليها في صفار البيض تصور النقل وتراكم الدهون الغذائية 18، والمكونات الخلوية الصور بما في ذلك قطرات الدهون من خلال العمل على حد سواء الأصباغ كما الحيوية 3 ومن خلال دمج التساهمية إلى الدهون المعقدة، والتحقيق في عملية التمثيل الغذائي من خلال رقيقة اللوني طبقة (TLC) 19 وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) (SAF بيانات غير منشورة)، وتوفير الفحص الكمي لمجموع الاستهلاك الغذائي 20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل معهد كارنيجي للعلوم المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (بروتوكول رقم 139).

1. إعداد الحيوان

  1. الحفاظ على البالغين واليرقات عند 28 درجة مئوية في ساعة 14: 10 ساعة ضوء: دورة الظلام. تغذية الكبار مرتين يوميا مع شركة شل الأرتيميا مجانا (الأرتيميا decapsulated وعدم الفقس، ابتداء من الساعة 14 DPF) وmicropellets التجارية.
  2. هي الأمثل هذه البروتوكولات لاستخدام 6-7 يرقات DPF التي جمعتها التفريخ الطبيعي للخلفية AB. بروتوكولات يمكن تعديلها ليرقات الأعمار والخلفيات الأخرى. لا توفر الغذاء خارجي قبل 6 DPF.
  3. تخدير اليرقات مع تريكين في وسائل الإعلام الجنين (EM) (4.2 مل من 4 ملغ / مل تريكين لكل 100 م مل) في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. إعداد غنية بالدهون صفار البيض تغذية

  1. إعداد وتخزين صفار بيضة الدجاج. فصل صفار وبياض 12 بيض الدجاج. تجميع صفار، قسامة 1 مل إلى 1.5أنابيب مل، ومخزن في -80 درجة مئوية تصل إلى 1 سنة (و12 صفار جعل ~ 80 قسامات). تجميع البيض، وتخزين، واستخدام ذلك، والأعلاف الغنية بالبروتين الفقيرة الدهون.
  2. إعداد الفلورسنت التناظرية الدهون (ق) التي يمكن ان تضاف الى علف صفار البيض إذا رغبت في ذلك.
    1. تعليق شراؤها، مسحوق التناظرية الدهون الفلورسنت في الإيثانول بنسبة 100٪ أو 100٪ الكلوروفورم عند 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر (انظر التالية مذكرة مناقشة المذيبات)، قسامة في أنابيب زجاجية غير شفافة، وختم مع parafilm، وتخزينها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بسبب التبخر السريع للمذيبات العضوية لا تستخدم كميات أقل من قسامة ~ 400 ميكرولتر للتخزين على المدى الطويل.
      ملاحظة: إذا تم تعليق التناظرية الدهون في الإيثانول، كميات كبيرة من الدهون التناظرية سيتم استخدامها لأنه يجف بسرعة تحت N 2 من الكلوروفورم. إذا علقت التناظرية الدهون في الإيثانول أنه ليس من الضروري أن تكون جافة ومعلق قبل إضافتها إلى الأعلاف الحويصلية في الخطوة 2.2.4، ولكن ينبغي تركيز الإيثانول إجمالي لا يتجاوز 0.1٪ في تغذية الحويصلية لتجنب الآثار الفسيولوجية يحتمل أن تكون مربكة للإيثانول.
    2. لالنظير الأحماض الدهنية الفلورسنت: إعداد إجمالي حجم 20 مل 5٪ مستحلب صفار البيض في الأسواق الناشئة. من أن إعداد 5 مل قسامات مع تركيز النهائي من 6.4 ميكرومتر 4،4-difluoro-4-بورا-3A، 4A-diaza-ق-indacene (BODIPY C 16) ليعيش التصوير متحد البؤر وتناول الطعام فحوصات أو 1 ميكروغرام / مل BODIPY C 12 للتصوير مجهر تشريحي. تحويل المبلغ المطلوب من الدهون التناظرية الفلورسنت إلى 1.5 مل أنبوب بلاستيكي. تجفيف الدهون تحت تيار من N 2، مع الحرص على عدم تفجير الدهون من الأنبوب.
    3. على الفور، resuspend في 5 ميكرولتر 100 الإيثانول٪ من قبل pipetting تيار أسفل جانبي الأنبوب، إضافة 95 ميكرولتر EM، وتخلط جيدا.
      ملاحظة: خليط يجب أن تظهر متجانسة. إذا بقي الدهن الملونة على جانبي الأنبوب أو يظهر السائل ملتف، والدهون لا بالفاعلات تماما ويتطلب المزيد من الايثانول. حماية أنبوب جيئة وذهاباضوء م ومتجر على الجليد.
    4. لالفلورسنت الكولسترول التناظرية: إعداد تركيز النهائي من 2.4 ميكروغرام / مل الكولسترول في 5 مل 0،5-5٪ مستحلب صفار البيض للدراسات التصوير الحية. تحويل المبلغ المطلوب من الكولسترول في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل. تجفيف الدهون تحت تيار من N 2، مع الحرص على عدم تفجير الدهون من الأنبوب.
    5. على الفور، resuspend في 15 ميكرولتر من RT الإيثانول بنسبة 100٪ من قبل pipetting تيار أسفل جانبي الأنبوب وتخلط مع 85 ميكرولتر من RT 1٪ الدهنية BSA خالية من الحمض الموجود في H 2 O. تنقية حماية أنبوب من الضوء وتخزينها على الجليد.
  3. إعداد صفار البيض الحويصلية الأعلاف.
    1. إضافة قسامة إذابة صفار البيض إلى EM في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. دوامة المخفف صفار البيض الخليط لمدة 1-2 دقيقة. يجب أن تظهر الخليط أن يكون مستحلب متجانسة.
    2. يصب الخليط من خلال مصفاة شبكة غرامة لإزالة التكتلات البروتين وجمع في وجديدة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
    3. نبض SONICAالشركة المصرية للاتصالات خليط البيض مع microtip مدبب واحد الرابعة بوصة (5 مرات (5 × 1 ثانية على، 1 ثانية إيقاف) التوقف 5-10 ثانية بين كل مجموعة، كثافة الانتاج: 6 W) في RT لخلق الجسيمات الشحمية. إعدادات الطاقة Sonicator هي أداة تعتمد، وبالتالي تتطلب الأمثل لكل أداة وmicrotip.
      ملاحظة: مستمر صخرة خليط الحويصلية في RT للحفاظ على التجانس حتى الاستخدام.
  4. إضافة الدهون التناظرية الفلورسنت إلى الجسيمات الشحمية صفار البيض، إذا رغبت في ذلك. مباشرة بعد صوتنة، الماصة الدهون مستعدة في خليط الحويصلية ودوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية على أن تدرج في الجسيمات الشحمية. حماية خليط من الضوء من خلال التفاف أنبوب في احباط ومواصلة هزاز في RT.

3. تغذية النموذج

  1. إعداد اليرقات لتغذية.
    1. قبل البدء في تغذية، يرقات الشاشة لعيوب شكلية الواضحة التي قد تعوق التغذية. نقل اليرقات إلى 60 ملم × 15 ملم أطباق بتري أو 6- أو 12-جيدا جيش التحرير الشعبى الصينىقسم التدريب والامتحانات، والحد من EM إلى أدنى حد ممكن، واستبدالها مع 5 مل من محلول الحويصلية استعداد.
    2. إذا لزم الأمر، ونقل unfed اليرقات السيطرة إلى 5 مل م و / أو 5 مل 5٪ بياض البيض في الأسواق الناشئة وعلاج في نفس الوقت.
  2. صخرة بلطف اليرقات في الروك المحتضنة (29-31 درجة مئوية في 30 دورة في الدقيقة) في جميع أنحاء تغذية لتشجيع تناول الطعام مع الاستمرار في حماية من الضوء إذا النظير الدهون الفلورسنت موجودة. وإذا دعت الحاجة اليرقات أن تتعرض للضوء، والتقليل من التعرض مع غطاء زجاجي ملون حاضنة.
  3. في نهاية فترة الرضاعة، وشطف اليرقات السباحة بحرية في EM 3 مرات.
    ملاحظة: يرقات قد تبدأ المستهلكة الجسيمات الشحمية في أي نقطة خلال تغذية. إذا فمن الأهمية بمكان أن يرقات تبدأ تغذية في نفس الوقت، وشاشة لتناول الطعام (انظر 3.4) بعد 1 ساعة من التغذية والعودة اليرقات الوحيدة التي بدأت تغذية إلى مستحلب صفار البيض لاستكمال تغذية.
  4. كشف اليرقات في هذه المرحلة لتناول الطعام وعدد صغير لا يجوز عصامر (عموما ~ 0-5٪). فحص الأمعاء من اليرقات التي تم تخدير أو قليلا يبرد على كتلة معدنية على الجليد لتحديد ما إذا كانت قد غذت: سوف اليرقات التي قد استهلكت الجسيمات الشحمية لديهم الأمعاء مظلمة (الشكل 1).
  5. صورة أو عملية يرقات لتناول الطعام مباشرة. بالتناوب، مكان اليرقات في EM الطازجة واحتضان عند 28 درجة مئوية للسماح للمعالجة التمثيل الغذائي للتحدث.

4. تصاعد اليرقات للتصوير لايف

  1. إعداد وسائل الإعلام تركيب.
    1. لمدة 3٪ السليلوز الميثيل: إضافة 0.75 ز ميثيل السليلوز إلى 25 مل من القريب الغليان EM، دوامة، الروك في RT 2-3 أيام حتى يذوب تماما، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة سنة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. سوف دورات متكررة من تجميد والذوبان في 4 درجات مئوية إزالة فقاعات الهواء. تخزين 3٪ السليلوز الميثيل على الجليد في حين تصاعد اليرقات.
    2. 1.2٪ انخفاض جبل الاغاروز: إضافة 0.3 غرام من الاسعار المنخفضة تذوب الاغاروز إلى 25 مل م وحل من خلال جلب ليغلي، وقسامة في 2 مل رubes، والحفاظ على 26-28 درجة مئوية في كتلة الحرارة. ويمكن تخزين قسامات غير المستخدمة في RT أو -20 درجة مئوية، ويغلى مرة أخرى في وقت الاستخدام. مما لا شك فيه أن الاغاروز باردا بما فيه الكفاية للتعامل مع قبل تعريض يرقات أو قد يكون الإفراط في تسخين.
  2. لانخفاض التكبير، متوسطة الإنتاجية التصوير الحي، ووضع شريحة زجاجية على الأنسجة على كتلة معدنية على الجليد وانتظر الشريحة لتبرد. ضع كمية سخية من 3٪ ميثيل السليلوز (الذي تم الحفاظ على 4 درجات مئوية على الجليد) على الشريحة، ونقل اليرقة على السليلوز الميثيل 3٪، وذلك باستخدام لعبة البوكر خط الصيد (0.41 ملم خط الصيد قطر لصقها على نهاية أنبوب الزجاج الشعرية) خلق وعد لتصريف فائض م (حتى لا تضعف أن السليلوز الميثيل) ووضع اليرقات كما تريد.
  3. على المدى القصير (<20 دقيقة)، وارتفاع التكبير التصوير الحي مع هدف انبثاق النفط تستقيم، جبل اليرقات مع ساترة الهزيل إلى الأسلوب.
    1. استخدام الغراء cyanoacrylate على أساس (Superglue) لإرفاق أأ 22 ملم × 30 ملم ساترة لأحد طرفي شريحة زجاجية. استخدام لعبة البوكر لوضع خط رفيع من 3٪ السليلوز الميثيل على الشريحة المجاورة لساترة ونقل اليرقات إلى الشريحة مع تحمل اسعة باستور الماصة. إزالة EM الزائد لذلك لن يخفف من السليلوز الميثيل.
    2. باستخدام لعبة البوكر، ضع بلطف اليرقات في السليلوز الميثيل على جنوبهم (الجانب الأيسر تصل إلى صورة أكثر من الكبد، والجانب الأيمن حتى صورة المرارة) ورؤوسهم بجانب ساترة.
    3. بقعة superglue في زوايا ساترة الثانية وبلطف وضع حافة واحدة من ساترة على ساترة شنت والآخر على الشريحة، سد اليرقات. الحرص على عدم الضغط الزائد خلال هذه الخطوة أو مع هدف خلال التصوير بحيث اليرقات تبقى يصب بأذى.
  4. على المدى الطويل، وارتفاع التكبير التصوير مع هدف الغمر تستقيم، جبل اليرقات في الاغاروز. إضافة يرقة إلى قسامة صغيرة من 1.2٪ ذوبان منخفضة الاغاروز ثم نقليرقة في كمية صغيرة من الاغاروز إلى طبق بتري.
    1. وضع بسرعة اليرقات مع لعبة البوكر قبل يتصلب الاغاروز. السماح للالاغاروز لتجف لمدة 2-3 دقيقة وتغطي الاغاروز تماما مع EM جديدة لمنعها من الجفاف.
  5. على المدى الطويل، وارتفاع التكبير التصوير مع هدف مقلوب، جبل اليرقات على طبق من الزجاج السفلي في الاغاروز.
    1. تبريد كتلة معدنية على الجليد. وضع الطبق على كتلة معدنية مفصولة الأنسجة لمنع التبريد المفرط وتجميد اليرقات. نقل اليرقة إلى الطبق وإزالة EM بواسطة فتل بمنديل ورقي.
    2. ضع قطرة من 28 درجة مئوية منخفضة ذوبان الاغاروز (1.2٪) على رأس اليرقة ووضع على الفور مع لعبة البوكر (الجانب الأيسر وصولا الى أفضل صورة الكبد، والجانب الأيمن أسفل إلى صورة المرارة). إزالة طبق من كتلة الباردة، والسماح ليجف لمدة 2-3 دقائق، وإضافة كمية كافية من EM جديدة لتغطية الاغاروز (~ 2-5 مل).

تناول 5. الغذاءفحص

  1. في نهاية آر الحويصلية صفار البيض يحتوي على 6.4 ميكرومتر BODIPY C 16، تجمع ما لا يقل عن 10 يرقات غسلها في أنبوب 1.5 أو 2 مل من البلاستيك، وإزالة EM، والمفاجئة التجميد. قد يتم تخزين العينات في -80 درجة مئوية محمية من الضوء لعدة أشهر.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، وجمع مكررات متعددة. ومن المهم لجمع اليرقات unfed في هذه الخطوة لتطبيع مضان الخلفية الدهون (مثالي اليرقات من نفس القابض تستخدم).
  2. إجراء تعديل بلي-داير استخراج الدهون 3،21.
    1. إضافة 100 العازلة التجانس ميكرولتر (20 ملي تريس الكلورين، 1 ملم EDTA) لعينة على الجليد (المنقى بدلا من H 2 O يمكن استخدامها). التجانس على الجليد مع sonicator microtip (5 ثانية مجموعه: 1 ثانية على 1 ثانية إيقاف). تأكد من أن اليرقات تكون متجانسة تماما. إن لم يكن، وتكرار. نقل إلى أنبوب ثقافة الزجاج القابل للتصرف مل 13 (يمكن استخدام أنابيب زجاجية أخرى).
      ملاحظة: الكلوروفورم خطرة. أداء جميع السابق الدهون لاحقاخطوات الجر في RT في غطاء الكيميائية.
    2. لكل 100 ميكرولتر من العازلة التجانس المستخدمة، إضافة 375 ميكرولتر من 1: 2 (كلوروفورم: الميثانول). دوامة 30-60 ثانية، واحتضان 10 دقيقة، إضافة 125 ميكرولتر من كلوروفورم لكل 100 عازلة التجانس ميكرولتر المستخدمة، ودوامة 30 ثانية.
    3. إضافة 125 ميكرولتر من 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 لكل 100 عازلة التجانس ميكرولتر المستخدمة، دوامة 30 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي (2000 ز س، 5 دقائق، RT، محمية من الضوء). إزالة بعناية عينات من أجهزة الطرد المركزي. وسيتم تقسيمها إلى مرحلتين: مرحلة العليا هي المائية، واجهة الحطام اليرقات، ومرحلة العضوية الدنيا (يحتوي على الدهون).
    4. مع ماصة زجاجية نظيفة جمع القاع، والمرحلة العضوية وتحويلها إلى أنبوب زجاجي 13 مل نظيفة.
      ملاحظة: احرص على تفادي المرحلة المائية والحطام اليرقات في واجهة. في حالة حدوث تلوث، كرر الخطوة الطرد المركزي ويتذكر. تجاهل، المرحلة المائية العليا. قد يكون من المفيد لإزالة والتخلص من هذاالمرحلة قبل جمع المرحلة العضوية. ويمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
    5. تجفيف المرحلة العضوية تحت فراغ (0.12 ضغط جوي) مع حماية من ضوء. عدم الاستمرار في تجفيف العينات بعد ذلك يتبخر السائل كما أنه سيقلل الذوبان في الدهون. Resuspend والدهون في 2: 1 (كلوروفورم: الميثانول) ومتجر على الجليد. حجم الأمثل للالكلوروفورم: حل الميثانول يعتمد على طريقة الكشف المستخدمة؛ تبدأ منخفضة والاستمرار في تمييع حسب الحاجة. والمبدأ التوجيهي العام هو استخدام 10 ميكرولتر لمدة 10 اليرقات المجمعة.
  3. بقعة أحجام العينة كلها في فترات متباعدة بشكل متساو على طبق من ذهب TLC توجيه والمسح الضوئي لوحة مع ماسح ليزر تستخدم بشكل روتيني للتصوير الجزيئي البيولوجي (على سبيل المثال، قارئ لوحة الفلورسنت). لالنظير الدهون الفلورسنت المدرجة في قائمة المواد التي لها ماكسيما الإثارة 500-650 ماكسيما نانومتر، والانبعاثات 510-665 نانومتر، واستخدام الليزر 488 نانومتر، ومع جمع الانبعاثات في 520 نانومتر.
    1. قياس مضان الإجمالي لكل بقعة مع برامج التصوير.
      ملاحظة: صحيح لتحدث بشكل طبيعي خلفية الدهون مضان من خلال طرح مضان من الاقتران، وعينات اليرقات unfed.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عندما يتغذى على الكرسي الهزاز في 29-31 درجة مئوية، فإن الغالبية العظمى من اليرقات صحية (≥95٪) تناول الطعام داخل 1 ساعة. على استهلاك مستحلب صفار البيض، وتضعف الأمعاء اليرقات في اللون. جدا الأمعاء المظلمة يمكن ملاحظتها في 2 ساعة (الشكل 1). إذا اليرقات unfed أو تفشل في إطعام، لا يزال الأمعاء واضح. اليرقات تتغذى البيض المعرض الأبيض لمعة الأمعاء منتفخة لا تلقي بظلالها في اللون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأساليب المذكورة هنا تسمح للباحثين لعلاج الزرد اليرقات مع تغذية غنية بالدهون، تصور معالجة الدهون الغذائية في اليرقات الحية، وتحديد حجم الاستهلاك الغذائي اليرقات. لضمان النجاح، ينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى العديد من الخطوات الهامة. بيض الدجاج التجارية تختلف. للحد من التقلبات المحتملة نحن أداء جميع المقايسات على البيض العضوي من الدجاج الخالية من قفص التي لم يتم المخصب لأحماض أوميغا 3 الدهنية. يمكن ملاحظة معدلات التغذية أقل في السمك الذين تقل أعمارهم عن 6 DPF مع ما تبقى من إمدادات الذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون Meng-Chieh Shen على الصور ، وجنيفر أندرسون على تقديم تعليقات مفيدة على المخطوطة ، وأعضاء مختبر Farber لمساهماتهم في تطوير هذه التقنيات. تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIDDK-NIH RO1DK093399 الجوائز (S.A.F.) و RO1GM63904 (اتحاد الجينوم الوظيفي لأسماك الزرد: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) و F32DK096786 (JPO). هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدمت مؤسسة جي هارولد وليلى ماذرز الخيرية دعما إضافيا لمختبر مؤسسة إس إيه إف ومؤسسة كارنيغي للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تريكايين (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانسولوفنات)Sigma-AldrichA5040-25Gتخدير لليرقات الزرد
بيض الدجاجN / A/ Aبيض عضوي خال من الأقفاص ، غير مخصب للأحماض الدهنية omege-3
معالج بالموجات فوق الصوتية 3000 سونيكاتورميسونيكس ، وشركةS-3000لصنع الجسيمات الشحمية من صفار البيض
الضميمة الصوتية SonaboxMisonix، Inc.432Bلصنع جسيمات شحمية صفار البيض
1/8 "طرف صغير مدببMisonix، Inc.419لصنع جسيمات شحمية صفار البيض
قوارير العنبر (4 مل ، زجاج) NationalScientific13-425تخزين الدهون. يشمل قوارير وأغطية مفتوحة وحاجز غطاء
Incu-Shaker Mini   ؛المعيار1222U12شاكر محتضن للأعلاف
BODIPY FL C16  ثيرمو فيشر ScientificD3821التناظرية الدهنية الفلورية. (4،4-ثنائي فلورو-5،7-ثنائي ميثيل-4-بورا-3 أ ، 4 أ-ديازا-إس-إنداسين-3-حمض هيكساديكانويك)
BODIPY FL C12  ثيرمو فيشر ScientificD3822التناظرية الدهنية الفلورية ؛ (4،4-ثنائي فلورو-5،7-ثنائي ميثيل-4-بورا-3 أ ، 4 أ-ديازا-إس-إنداسين-3-حمض الدوديكانويك)
بوديبي فلوريدا C5   ؛ثيرمو فيشر ScientificD3834التناظرية الدهنية الفلورية ؛ (4،4-ثنائي فلورو-5،7-ثنائي ميثيل-4-بورا-3 أ ، 4 أ-ديازا-إس-إنداسين-3-حمض البنتانويك)
BODIPY FL C5Thermo Fisher ScientificD2183التناظرية الدهنية الفلورية ؛ (4،4-ثنائي فلورو-5،7-ثنائي ميثيل-4-بورا-3 أ ، 4 أ-ديازا-إس-إنداسين-3-حمض البروبيونيك)
TopFluor cholesterol أفانتي بولر ليبيدز810255تناظرية دهون الفلورسنت ؛ 23- (ثنائي بيروميثينيبورون ثنائي فلوريد) -24-نوركوليسترول
خالية من الأحماض الدهنية BSASigma-AldrichA0281-1Gلذوبان الكوليسترول TopFluor
وسائط تركيب ميثيل السليلوزSigma-AldrichM0387لتصوير اليرقات الحية ؛ 75 × 25 × 1 مم
وسائط تركيب منخفضة الذوبانThermo Fisher ScientificBP165-25التركيب لليرقات الحية التصوير; 22 × 30
شرائح مجهر VWR VWR 16004-422يرقات متصاعدة للتصوير
المباشر Coverslips غطاء زجاجي12-544Aيرقات متصاعدة للتصوير الحي
Super GlueLoctiteLOC01-30379يرقات متصاعدة للتصوير المباشر
FluoroDish (طبق سفلي زجاجي) WorldPrecision Instruments، Inc.   ؛FD35-100يرقات متصاعدة للتصوير الحي ؛ طبق 35 مم ، زجاج 23 مم ، سمك زجاج 0.17 مم ؛  
مجهر متحد البؤرLeica MicrosytemsSP-2 ، SP-5مجهر للتصوير الحي عالي التكبير
مجهرنيكونSM21500للتصوير الحي منخفض التكبير
أنابيب ثقافة الزجاج   ؛Kimble73500-13100استخراج الدهون. (13 × 100 مم ؛ 13 مل)
Savant SpeedVac Plus ThermoQuestSC210Aاستخراج الدهون
موجه لوحات TLC WhatmanScientificWC4855-821فحص تناول الطعام ؛ LK5D هلام السيليكا 150 أمبير ، 20 × 20 سم ، 250 ميكرومتر سميكة ؛
TLC المتوقفةAnaltech، Inc.66911فحص تناول الطعام ؛ الاستبدال المباشر للوحات Whatman Scientific TLC
Typhoon 9410 Variable Mode ImagerGE Healthcare9410قارئ الألواح الفلورية لمقايسة تناول الطعام
برنامج ImageQuant29000605Healthcareلمقايسة تناول الطعام
5 3/4 ' تجويف واسع ، ماصات باستور البورسليكات التي يمكن التخلص منها   ؛    كيمبل63A53WTنقل اليرقات
N شركة وسائط لوحات تحليل GE

المراجع

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485(2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21(2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474(2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استقلاب الدهوننظائر الدهون الفلوريةليبوزومات صفار البيضكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقةالتكميم الفلوريمعالجة الدهون الغذائية
ارتفاع الدهون تغذية النموذج لليرقات اسماك الزرد: التغذية، يعيش التصوير، والكمي لتناول الطعام
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.