إعداد و في المختبر توصيف وكلاء التباين القائم Dendrimer للتصوير بالرنين المغناطيسي

Serhat Gündüz; Tanja Savić; Đorđe Toljić; Goran Angelovski

doi:10.3791/54776

مقالة منهجية

إعداد و في المختبر توصيف وكلاء التباين القائم Dendrimer للتصوير بالرنين المغناطيسي

DOI:

10.3791/54776

⸱

ديسمبر 4, 2016

Serhat Gündüz¹ , Tanja Savić¹ , Đorđe Toljić¹ , Goran Angelovski¹

¹MR Neuroimaging Agents, Max Planck Institute for Biological Cybernetics

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إعداد وتوصيف وكيل النقيض dendrimeric التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الذي يحمل يخلب macrocyclic أساس cyclen للتنسيق بين أيونات ممغطس الجادولينيوم. في سلسلة من التجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في المختبر، أنتج هذا العامل إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي تضخيم بالمقارنة مع التناظرية أحادى متاحة تجاريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجمعات ممغطس الجادولينيوم (III) مع اسيكليك أو يخلب macrocyclic هي عوامل التباين الأكثر شيوعا (CAS) للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). الغرض منها هو تعزيز معدل استرخاء البروتونات الماء في الأنسجة، وبالتالي زيادة تباين الصورة MR وخصوصية القياسات التصوير بالرنين المغناطيسي. الحالي عوامل التباين وافق سريريا ومنخفضة الوزن الجزيئي الجزيئات التي يتم تطهيرها بسرعة من الجسم. استخدام dendrimers كحاملات للchelators ممغطس يمكن أن تلعب دورا هاما في التنمية المستقبلية أكثر كفاءة عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي. على وجه التحديد، فإن الزيادة في تركيز المحلية من نتائج الأنواع ممغطس في أعلى النقيض إشارة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا CA أطول فترة بقاء الأنسجة المقرر أن الوزن الجزيئي المرتفع والحجم. هنا، علينا أن نبرهن إجراء مناسب لإعداد dendrimers مع monomacro الجزيئات وكلاء التصوير بالرنين المغناطيسي النقيض من ذلك على أساس بولي (amidoamine) (PAMAM)دوري DOTA من نوع chelators (DOTA - 1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetate). تم إلحاق وحدة مخلبية من خلال استغلال التفاعل من مجموعة ثيوسيانات (سي إس) نحو الجماعات سطح أمين من dendrimer PAMAM لتشكيل الجسور ثيوريا. وتنقيته المنتجات Dendrimeric وتحليلها باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي، قياس الطيف الكتلي، وتحليل العناصر. وأخيرا، تم تسجيل عالية الدقة صور الرنين المغناطيسي وتم مقارنتها التناقضات إشارة تم الحصول عليها من dendrimeric استعداد وكلاء أحادى متاحة تجاريا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هي تقنية قوية وغير المؤين التصوير المستخدمة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية والتشخيص السريري نظرا لطبيعتها موسع وممتازة جوهري على النقيض من الأنسجة الرخوة. أساليب التصوير بالرنين المغناطيسي الأكثر شيوعا الاستفادة من إشارة تم الحصول عليها من البروتونات المياه، وتوفير صور عالية الدقة ومعلومات مفصلة داخل الأنسجة على أساس الاختلافات في كثافة إشارات المياه. كثافة إشارة وخصوصية التجارب التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تحسينها باستخدام عوامل التباين (CAS). وهذه هي الأنواع ممغطس أو مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic التي تؤثر على الطولي (T ₁₎ وعرضية (تي ₂₎ مرات الاسترخاء على التوالي ^1،2.

مجمعات للالجادولينيوم اللانثينيدات أيون مع polyamino بروابط حمض كاربوكسيلية هي الأكثر شيوعا تي ₁ المصدقة. الجادولينيوم (III) تقصير الاسترخاء T ₁الوقت من البروتونات المياه، مما يزيد من النقيض إشارة في تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي ^3. ومع ذلك، الجادولينيوم الأيونية هي سامة. حجمه يقارب ذلك من الكالسيوم (II)، وأنه يؤثر بشكل خطير يشير في الخلايا بمساعدة الكالسيوم. لذلك، يتم توظيف اسيكليك وmacrocyclic يخلب لتحييد هذه السمية. وقد وضعت مختلف بروابط متعدد الأسنان حتى الآن، مما أدى الجادولينيوم (ثالثا) المجمعات مع الاستقرار الحرارية العالية وهمود الحركي ^1. تلك التي تستند إلى cyclen azamacrocycle 12 membered، ولا سيما في DOTA مشتق tetracarboxylic (1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetate) هي المجمعات الأكثر التحقيق والتطبيقية لهذه الفئة كاليفورنيا.

ومع ذلك، GdDOTA من نوع المصدقة وانخفاض أنظمة الوزن الجزيئي، وعرض بعض العيوب مثل كفاءة التباين المنخفض وإفراز الكلى سريع. الجزيئات ومتعددي المصدقة قد يكون حلا جيدا لهذه المشاكل ^4. منذ CA biodistribuنشوئها يتحدد أساسا من حجمها، عرض المصدقة الجزيئات مرات الاحتفاظ أطول بكثير داخل الأنسجة. بنفس القدر من الأهمية، وmultivalency من هذه العوامل يؤدي إلى زيادة تركيز المحلية لجنة التحقيق أحادى MR (على سبيل المثال، مجمع GdDOTA)، وتحسين كبير في إشارة MR المكتسبة وجودة القياس.

Dendrimers هي من بين السقالات الأكثر تفضيلا لإعداد متعددي المصدقة للتصوير بالرنين المغناطيسي ^4،5. هذه الجزيئات تشعبت للغاية مع أحجام محددة جيدا عرضة لمختلف ردود الفعل اقتران على سطحها. في هذا العمل، ونحن التقرير إعداد وتنقية، وتوصيف CA dendrimeric للتصوير بالرنين المغناطيسي تتكون من الجيل 4 (G4) بولي (amidoamine) (PAMAM) dendrimer بالإضافة إلى يخلب GdDOTA مثل (DCA). وصفنا توليف مشتق DOTA على رد الفعل واقتران بها إلى dendrimer PAMAM. على complexation مع كلمة المدير العام (III)، وتوصيف الفيزيائية القياسية proceduإعادة من DCA تم تنفيذها. وأخيرا، أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي لإظهار قدرة DCA لإنتاج صور الرنين المغناطيسي مع تباين أقوى من تلك التي تم الحصول عليها من انخفاض الوزن الجزيئي المصدقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد DCA

تركيب وحدة أحادى 4 ^6.
1. توليف 4- (4-nitrophenyl) -2- (ثلاثي 4،7،10-tris---butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10-tetraazacyclododec-1-YL) زبدي حمض ثلاثي -butyl استر (2).
  1. حل (ثلاثي 4،7-bis- -butoxycarbonylmethyl-1،4،7،10-tetraaza-cyclododec-1-YL) -acetic ثلاثي حمض -butyl استر 1 (1.00 جم، 1.94 ملمول) في N، N -dimethylformamide ( DMF، 5 مل)، إضافة كربونات البوتاسيوم (0.67 جم، 4.86 ملمول، 2.5 يعادل.) ويحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
    وقد أعد Macrocycle 1 من cyclen وثالثي -butyl bromoacetate وفقا للإجراءات التي تم نشرها مسبقا ^7: ملاحظة.
  2. إضافة ثالثي -butyl-2-برومو-4- (4-nitrophenyl) butanoate (0.87 جم، 2.53 ملمول، 1.3 يعادل.) portionwise أكثر من 1 ساعة. تواصل اثارة الخليط تحت رانه ظروف التفاعل نفسها للساعة 18 التالية.
    ملاحظة: -butyl-2-برومو-4- ثالثي أعد (4 nitrophenyl) butanoate من 4- (4-nitrophenyl) حمض -butyric، كلوريد الثيونيل، والبروم وفقا للإجراءات التي تم نشرها مسبقا ^8.
  3. إزالة DMF عن طريق لمبة لمبة-تقطير فراغي في 40-60 درجة مئوية ^9.
  4. تنقية المخلفات التي اللوني العمود (هلام السيليكا، 7٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان) للحصول على المنتج (2)، البني غير متبلور الصلبة (1.09 ز، 72٪) ^10.
2. توليف 4- (4-aminophenyl) -2- (ثلاثي 4،7،10-tris---butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10-tetraazacyclododec-1-YL) زبدي حمض ثلاثي -butyl استر (3).
  1. حل نترات البنزين المشتق 2 (1.00 جم، 1.28 ملمول) في الإيثانول (10 مل)، و7 N محلول الأمونيا في الميثانول (150 ميكرولتر). إضافة البلاديوم على الكربون المنشط كمحفز (PD / C، 150 ملغ، 15٪ بالوزن) إلى solutiعلى.
  2. يهز خليط غير متجانس لمدة 16 ساعة في ظل جو الهيدروجين (2.5 بار) في الجهاز hydrogenator بار.
  3. إعداد كعكة من الأرض دياتومي عن طريق إيقافه في الإيثانول وتصفية تعليق من خلال قمع الزجاج المحجر. صب تعليق من 1.1.2.2 على كعكة مستعدة لإزالة محفز المشتريات / C عن طريق الترشيح.
  4. إزالة المذيب عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية) للحصول على مركب (3) والبني غير متبلور الصلبة (0.91 ز، 95٪).
3. توليف 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4،7،10-tris- ثالثي -butoxycarbonylmethyl 1،4،7،10- tetraazacyclododec-1-YL) زبدي ثلاثي حمض -butyl استر (4).
  1. إضافة thiophosgene (0.124 مل، 1.58 ملمول، 1.3 يعادل.) إلى خليط من 3 (0.91 جم، 1.22 ملمول) وثلاثي الإيثيلامين (0.685 مل، 4.87 مليمول، 4 يعادل.) في ثنائي كلورو ميثان (15 مل).
  2. يحرك بقوة ميل رد فعلxture مع محرك مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة.
  3. إزالة المذيب عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية)، ومن ثم تنقية الناتج الخام بواسطة اللوني العمود (هلام السيليكا، 5٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان) للحصول على المنتج 4 كما البني الفاتح غير متبلور الصلبة (0.51 ز، 53٪).
تجميع للDCA dendrimer.
1. تجميع للdendrimer 5.
  1. خذ dendrimer G4-PAMAM (667 ملغ، 10٪ محلول dendrimer في الميثانول، 4.67 مكرومول)، يتبخر الميثانول عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (الماء درجة حرارة الحمام ~ 40 درجة مئوية)، وتذوب بقايا في DMF (4 مل) .
  2. إضافة ثلاثي الإيثيلامين (0.105 مل، 0.75 مليمول، 160 يعادل.)، يحرك المزيج لمدة 45 دقيقة في 60 درجة مئوية، وإضافة ثيوسيانات 4 (354 ملغ، 0.45 ملمول، 1.5 يعادل. النسبي للفئات سطح الأمينية من dendrimer) portionwise اوفهص 1 ساعة.
  3. يحرك خليط التفاعل مع محرك مغناطيسي في 45 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  4. إزالة المذيب عن طريق لمبة لمبة-تقطير فراغي في 40-60 درجة مئوية.
  5. تنقية المخلفات التي اللوني الحجم استبعاد استخدام دهون هلام الترشيح المتوسطة والميثانول كما شاطف. حزمة العمود، تنتفخ وسائل الاعلام الترشيح في الميثانول لا يقل عن 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة (> 4 مل من الميثانول لكل 1 غرام من مسحوق) من دون تطبيق الضغط. أداء فصل الجاذبية من خلال جمع 1 مل الكسور.
  6. تحليل الكسور التي تم جمعها مع اللوني طبقة رقيقة (TLC). تطوير لوحة TLC في 15٪ الميثانول / ثنائي كلورو ميثان (فقط يتم اشتقاق معظم بقعة القطبية تقع على خط قاعدة من المنتج dendrimeric). تتبخر الكسور التي تم جمعها عن طريق التقطير لطيف على المبخر الدوار (درجة حرارة حمام ماء ~ 40 درجة مئوية) للحصول على المنتج 5 (270 ملغ، 91٪).
2. تجميع للdendrimer
3. حل خالب محمية dendrimeric 5 (270 ملغ، 4.23 مكرومول) في حمض الفورميك (5 مل) ويحرك الخليط على 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. تتبخر حمض الفورميك عن طريق التقطير على المبخر الدوار (~ ضغط 15 مللي بار ودرجة حرارة حمام ماء ~ 40 درجة مئوية) وتجميد تجفيف المنتج لإعطاء 6 (ضغط ~ 0.2 مللي بار) ^9.
تجميع للعامل تباين dendrimeric (DCA)
1. حل خالب dendrimeric 6 (4.35 مكرومول) في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
2. حل GdCl ₃ · 6H ₂ O (113 ملغ، 304 مكرومول) في الماء (1 مل)، وإضافته قطرة قطرة في حل خالب 6 على مدى 4 ساعات. الحفاظ على درجة الحموضة في 7.0 مع مائي محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.05 م) عن طريق قياس درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني.
3. يحرك الخليط مع محرك مغناطيسي في تي الغرفةemperature لمدة 24 ساعة.
4. إضافة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA، 158 ملغ، 426 مكرومول) إلى portionwise حل أكثر من 4 ساعة لإزالة الفائض من كلمة المدير العام (III) مع الحفاظ على درجة الحموضة في 7.0 مع مائي محلول هيدروكسيد الصوديوم (0.05 م). يحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
5. أداء الحجم الاستبعاد اللوني لإزالة غالبية GdEDTA ويزيد من EDTA. استخدام ماء المتوسطة هلام الترشيح تورم في الماء لتعبئة العمود. تقليل الخليط إلى حجم مناسب وتحميل العمود. أزل عمود مع الماء منزوع الأيونات دون الضغط.
6. الطرد المركزي العينة باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي 3 كيلو دالتون لمدة 30 دقيقة في الطرد المركزي قوة 1800 x ج لإزالة مخلفات GdEDTA وEDTA. كرر هذه الخطوة (حوالي خمس مرات) حتى يظهر الترشيح غياب EDTA وGdEDTA. نقل العينة إلى قارورة، تتبخر، ومن ثم تجميد الجافة المذيب للحصول على المنتج من البيض مثل DCA النهائي (186 ملغ، 71٪).
  ملاحظة: تحقق غياب EDTA وGdEDTA بواسطة ESI-MS.
7. تأكيد غياب كلمة المدير العام (III) كما أيون مجانا باستخدام اختبار زايلينول البرتقال. حل الترشيح (0.5 مل) في حل العازلة خلات (درجة الحموضة 5.8). إضافة بضع قطرات من محلول زايلينول البرتقال وتتبع تغير اللون (الأصفر أو اللون البنفسجي يدل على غياب أو وجود لحرية ش ج (III) الأيونات في الحل، على التوالي) ^11.

2. في المختبر توصيف Dendrimeric المنتجات

تقدير عدد DOTA وحدات macrocyclic بالإضافة إلى dendrimer PAMAM (تحميل من dendrimer مع macrocycles مثل DOTA)
1. تقدير مع ¹ H NMR (NMR - النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي).
  ملاحظة: هذا الإجراء هو ممكن على dendrimers 5 و 6، ولكن ليس على DCA.
  1. تسجيل الطيف ¹ H NMR ^12.
  2. دمج المنطقة العطرية والمنطقتين منفصلة الأليفاتية (1. إشارات من dendrimer الأليفاتية والبروتونات macrocyclic؛ 2. إشارات من المجموعات ر -Bu) أو مجرد منطقة دهنية لdendrimers 5 و 6 على التوالي.
    ملاحظة: لا توجد أية إشارة منفصلة في المنطقة الأليفاتية نشأت من المجموعات ر -Bu في dendrimer 6 منذ أن تم تحلل.
  3. استخدام المعادلة. 1 أو المعادلة. 2 لتقدير عدد الوحدات macrocyclic (ن)، حيث R = نسبة من التكاملات (الأليفاتية / العطرية في المعادلة 1 أو الأليفاتية-dendrimer / aliphatic- تي بو في المعادلة 2)، H _dend = عدد البروتونات في dendrimer، H _هارون = عدد البروتونات العطرية، H _ر _بو = عدد البروتونات في مجموعات ر -Bu، وH _ماك = عدد البروتونات في macrocycle واحد.
    ملاحظة: إما المعادلة. 1 أو المعادلة. 2 يمكن استخدامها FOdendrimer 5 ص، بينما المعادلة فقط. 1 يمكن استخدامها لdendrimer 6. منذ البروتونات تبديل (على الأمينات، الاميدات، thioureas، أو carboxylates) وعادة ما يجري استبدالها الديوتيريوم، كانوا لا يفترض في الحسابات. هنا، H _dend استخدمت = 1128 (لمدة 5) أو 1000 (لمدة 6)، H _هارون = 4، وH _ماك = 27.
    (1)
    (2)
2. تقدير من تحليل العناصر باستخدام نسبة النيتروجين إلى الكبريت.
  1. إجراء تحليل العناصر على عينة dendrimeric الصلبة (DCA في هذا العمل).
  2. استخدام المعادلة. 3 لتقدير عدد الوحدات macrocyclic (ن)، حيث R = نسبة يحددها٪ N و٪ S، N _dend أو S _dend = عددالنيتروجين أو ذرات الكبريت في dendrimer، وN _ماك أو S _ماك = عدد من النيتروجين أو الكبريت الذرات في وحدة macrocyclic واحد.
    ملاحظة: يتم الحصول على عامل 2.29 من النسبة في الكتل الذرية من الكبريت والنيتروجين. في هذا العمل، واستخدمت N _dend = 250، S _dend = 2، ن _ماك = 5، و S _ماك = 1.
    (3)
3. تقدير مع مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران (MALDI-TOF).
  1. إجراء تحليل MALDI-TOF MS ^13.
  2. حساب عدد الوحدات macrocyclic (ن) وفقا لالمعادلة. 4، حيث M _ض = الكتلة لاحظ (م / ض)، ض = تهمة الأنواع، M _dend = كتلة الجزء dendrimeric، وM _ماك = كتلة وحدة macrocyclic واحد.
    لاالشركة المصرية للاتصالات: M _dend = 14306 وM _ماك = 719 استخدمت في هذا العمل.
    (4)
تحديد تركيز DCA ([DCA]): السائبة قياس القابلية المغناطيسية (BMS)
1. حل DCA (5-10 ملغ) في الماء (360 ميكرولتر) في أنبوب قارورة بلاستيكية ([DCA] ~ 5-10 ملم).
  ملاحظة: [DCA] ينبغي أن يكون في حدود 5-10 ملم لتجنب التداخل المحتمل من الأصداء BuOH تي في تركيزات عينة> 15 ملم، مع صدى المياه في δ = 4.7 جزء في المليون.
2. إضافة 60 ميكرولتر من D ₂ O: تي خليط BuOH (2: 1 ت / ت) إلى محلول مائي من دائرة الطيران المدني وخلط المحلول الناتج (420 ميكرولتر) باستخدام خلاط دوامة.
3. نقل 400 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي الخارجي، ووضع أنبوب إدراج NMR متحد المحور مع BuOH تي: H ₂ O خليط (10:90 ت / ت) في أنبوب العينة.
4. سجلوNMR الطيف ¹ H وقياس التحول تردد بين إشارات الرنين المستمدة من تي BuOH في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي الداخلية والخارجية (المرجع) ^12.
5. استخدام المعادلة. 5 لتحديد [DCA]، حيث T = درجة الحرارة المطلقة، Δχ = التحول المسجلة ميكرون _{ممثل المؤسسة} = لحظة فعالة المغناطيسية لأيون انثانيد (μ _{ممثل المؤسسة} = 7.94 لكلمة المدير العام (III) ^14، وق = أ تعتمد ثابت على شكل العينة ومكانتها في المجال المغناطيسي (0، 1/3، 1/6 وفي حالة وجود المجال، اسطوانة موازية ل، واسطوانة عمودي على المجال المغناطيسي، على التوالي).
  ملاحظة: القيمة المحسوبة التي تم الحصول عليها ل[DCA] يجب تصحيح لتركيز الأصلي بسبب إضافة D ₂ O: تي حل BuOH (60 ميكرولتر).
  (5)
ضوء الديناميةنثر (DLS) القياسات.
1. يعد حل DCA تصفيتها (0.2 ميكرون بوليتيترافلوريثيليني مرشح / PTFE، 0.75 ملم في كلمة المدير العام (III)) في 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) العازلة (25 مم، ودرجة الحموضة 7.4) وتحويلها إلى كفيت لقياس DLS.
2. ضع كفيت في الجهاز دائرة الأراضي والمساحة وتعيين المعلمات التالية: 5 التكرار من 15 بالاشعة (1 مسح = 12 ثانية، معامل الانكسار = 1.345، وامتصاص = 1٪) دون تأخير في بين المسح الضوئي ومع موازنة درجة الحرارة قبل 30 ثانية لتسجيل .
3. تصدير البيانات التي حصل عليها والحصول على الرسم البياني حجم التوزيع عن طريق التآمر السكان (٪) بوصفها وظيفة من حجم (قطر الهيدروديناميكية).
قياس relaxivities طولية وعرضية.
ملاحظة: إجراء مماثل تم بالفعل وصف باستخدام الاسترخاء الوقت محلل ^15؛ تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مطياف 300 ميغاهيرتز مع Topspinالبرمجيات.
1. إعداد مجموعة من الحلول DCA في H ₂ O: D ₂ O (500 ميكرولتر و 10٪ D ₂ O في H ₂ O، [DCA] = 2.0، 2.5، 3.0، 3.5، 4.0، 4.5، و 5.0 ملم، [HEPES ] = 25 مم) من العينة الأسهم DCA (انظر القسم 2.2).
2. نقل 450 ميكرولتر من الحل في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ووضعه في الصك.
3. تحسين المعلمات الاستحواذ (90 درجة مدة النبضة الإثارة (P1)، وإشعاع التردد الإزاحة (O ₁₎₎ ثم قم بإجراء تي ₁ و تي ₂ التجارب باستخدام الانتعاش قلب (الأشعة تحت الحمراء)، والسيارات، بورسيل-Meiboom-جيل (CPMG ) تسلسل النبض، على التوالي.
4. تقرير مرات تي ₁ و تي ₂ الاسترخاء.
  1. حدد سجلت القياس، عملية الطيف 2D في البعد F2، وتنفيذ أعمال التصحيح المرحلة التفاعلي.
  2. حدد شريحة المناسبة (الذروة مع الحد الأقصى لكثافة) في تحليل / T ₂ نافذة الاسترخاء، ودمج ذلك، وتصدير المنطقة إلى وحدة الاسترخاء.
  3. حدد الوظيفة المناسبة المناسب (invrec أو uxnmrt2 للتجارب الأشعة تحت الحمراء وCPMG، على التوالي) للحصول على تي ₁ أو تي ₂ مرات الاسترخاء.
5. كرر الخطوات 2.4.4.2-2.4.4.4 لجميع الحلول المتبقية [DCA].
6. حساب معدلات الاسترخاء (R ₁ و R ₂₎ من الحصول تي ₁ القيم (ص _1،2 = 1 / T _1،2).
7. مؤامرة R ₁ و R ₂ (ثانية ^-1) كدالة للتركيز كلمة المدير العام (III) مم.
8. تحديد relaxivities طولية وعرضية، ص ₁ و ص ₂ (ملي ^-1 ثانية ^-1)، من المنحدر من خط تركيبها، على النحو المحدد من قبل المعادلة. 6، حيث R _{ط، طب التوليد} = والطولي (ط = 1) أو عرضية (ط = 2) معدل الاسترخاء diamagnetic منالمياه في حالة عدم وجود الأنواع ممغطس و[كلمة المدير العام] = تركيز كلمة المدير العام (III) المستخدمة في التجربة.
  (6)

3. في المختبر التصوير بالرنين المغناطيسي. مقارنة بين DCA وGdDOTA

إعداد الأشباح أنبوب
1. تحضير المحاليل المائية من DCA (4 × 350 ميكرولتر) وGdDOTA (4 × 350 ميكرولتر)، وكذلك عينات من المياه (4 × 350 ميكرولتر) لمجموعتين من التجارب حيث يتم حساب تركيز عوامل التباين: (3.1.1.1) في كلمة المدير العام (III) أو (3.1.1.2) في الجزيء.
  1. إعداد عينتين DCA واثنين من GdDOTA عينات مع تركيزات 0.5 و 1.0 مم في كلمة المدير العام (III)، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، وإعداد اثنين من عينات المياه (مثل أنابيب السيطرة).
  2. إعداد عينتين DCA (2.5 و 5.0 مم في كلمة المدير العام (III) أو 0.05 و 0.1 ملم في جزيء dendrimeric)، عينتين GdDOTA (0.25، 0.5 ملم) واثنين من عينات المياه (كنترولأنابيب لتر).
    ملاحظة: يجب أن يتم إعداد DCA وGdDOTA تركيزات المناسبة عن طريق تمييع عينات الأسهم منهما مع تركيزات تحدد من خلال طريقة BMS (انظر القسم 2.2) مع العازلة HEPES (7.4 درجة الحموضة). من أجل تبسيط العمليات الحسابية، وكان من المفترض ن = 50 لمتوسط عدد الوحدات macrocyclic في جزيء dendrimer. ولذلك، فإن نسبة DCA: كانت GdDOTA 1: 5، وتحسب على أساس لكل جزيء.
2. وضع العينات في 300 أنابيب قنينة بلاستيكية ميكرولتر، وتجنب وجود فقاعات الهواء في الحل.
  ملاحظة: حجم الأنابيب قنينة بلاستيكية يعتمد على نوع وحجم ملف الترددات الراديوية المستخدمة (هنا، وتعطى مثالا مع لفائف وحدة التخزين).
3. إدراج العينات داخل حقنة (60 مل الحجم)، وملء مع 1 ملم GdDOTA حل، ووضعه في الماسح الضوئي.
  وضعت العينات في محلول مائي من GdDOTA لتجنب آثار الحساسية (الاختلافات في مجال الصورة المغناطيسي ملاحظة:trength التي تحدث بالقرب من الواجهات بين المواد قابلية مغناطيسية مختلفة).
الأمثل المعلمة والتصوير.
1. استخدام الفحص التشريحي (كالايزر / Tripilot) لوضع الحقنة مع العينات في مركز التساوي من المغناطيس.
2. اضغط على إشارة المرور (مسح تعديل) لإجراء تعديلات على الملئ (تعديل التجانس المجال المغناطيسي) من حجم كامل، التردد المركزي (O _1)، وكسب المتلقي (RG)، وكسب الإرسال (TX0 وTX1).
3. لتي ₁ -weighted (T _1W) والتصوير، وحدد طريقة سريعة منخفضة زاوية اطلاق النار (عاجل جدا).
4. اختيار شريحة الاكليلية للعينات وضعت عموديا (حقنة أفقيا) في الماسح الضوئي باستخدام المسح الضوئي كالايزر.
5. استخدام المعادلة. 7 لتعظيم الاستفادة من (CNR) الاستحواذ على النقيض إلى الضجيج المعلمات ^16، حيث α = زاوية الوجه، TE = وقت الصدى، TR =الوقت التكرار، وتي _1، _A، T _{1، B} = تي ₁ مرات من العينة ألف (تي _1، _A) والعينة الثانية (تي _{1، B)} والتي يجب أن يكون الحد الأقصى لجنة المصالحة الوطنية (نفس صالحة ل T ₂ مرات: T _{2، A} و T _{2، B).}
  يجب تعيين تي ₁ و تي ₂ الاسترخاء مرات لالقيم التي تم الحصول عليها من قياسات (القسم 2.4) relaxivities طولية وعرضية، في حين أن الشركة المصرية للاتصالات، ينبغي الحصول TR، وα من الحساب الأمثل لجنة المصالحة الوطنية: ملاحظة.
  (7)
6. الحصول على صورة باستخدام المعلمات التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة (3.2.5).
7. حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR).
  1. تحميل المكتسبة تي _1W صورة (مسح) في صورة العرض والتجهيزالنافذة، وانقر على تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI).
  2. اختيار العائد على الاستثمار دائري واستدراجه في موقف عينة والخلفية. وفي وقت لاحق، انقر على الشاشة للحصول على متوسط السعة إشارة (S _إشارة) والانحراف المعياري للخلفية _{(الضوضاء} S).
  3. كرر الخطوة 3.2.7.2 لDCA، GdDOTA، وعينات من المياه.
  4. حساب SNR باستخدام الصيغة: SNR = S _إشارة / S _{الضوضاء.}
8. وبعد إجراء تعديل طفيف، نفذ T ₂ -weighted (T _2W) التصوير باستخدام سرعة اقتناء مع طريقة تعزيز الاسترخاء (نادر). لتعظيم الاستفادة من المعلمات الاستحواذ لجنة المصالحة الوطنية، واستخدام المعادلة. 8.
  (8)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد DCA يتكون من مرحلتين: 1) التوليف من أحادى DOTA من نوع خالب (الشكل 1) و 2) اقتران خالب مع dendrimer G4 PAMAM ثم إعداد وكلمة المدير العام dendrimeric (III) معقد (الشكل 2) . في المرحلة الأولى، تم إعداد DOTA من نوع خالب القائم على cyclen تحتوي على أربعة الأحماض الكربوكسيلية ومجموعة متعامدة مناسبة لمزيد من التعديلات الاصطناعية. إعداد بدأ من 1 (DO3A- ثالثي -butyl استر)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد وكيل التصوير بالرنين المغناطيسي النقيض dendrimeric يتطلب الاختيار المناسب للوحدة أحادى (أي خالب للكلمة المدير العام (III)). أنها تقلل من سمية هذه أيون ممغطس، وحتى الآن، ومجموعة متنوعة واسعة من اسيكليك وchelators macrocyclic تخدم هذا الغرض ^1-3. ومن بين هؤلاء، macrocyclic chelators DOTA من نوع تمتلك أعلى الاستقرار الحرارية وهمود الحركي، وبالتالي، هي الخيار الأكثر تفضيلا لإعداد التصوير بالرنين المغناطيسي خامل عوامل التباين ^1،18. وعلاوة على ذلك، فه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم الاعتراف بامتنان بالدعم المالي لجمعية ماكس بلانك ، ووزارة التعليم الوطني التركية (زمالة الدكتوراه إلى SG) ، وخدمة التبادل الأكاديمي الألمانية (DAAD ، زمالة الدكتوراه إلى TS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Cyclen	CheMatech	C002
tert-بوتيل بروموأسيتات	ألفا إيسار	A14917
< م > ن ، ن < م > - ثنائي ميثيل فورماميد	فلوكا	40248
كربونات البوتاسيوم	سيجما ألدريتش	209619
4- (4-نيتروفينيل) حمض البوتريك	ألدريتش	335339
كلوريد الثيونيل ؛	Acros Organics	382662500	ملاحظة: مادة أكالة. سامة إذا تم استنشاقها
Bromine	Acros Organics	402841000	ملاحظة: تسبب حروقا شديدة في الجلد ، قاتلة إذا تم استنشاقها ؛
ثنائي إيثيل الأثير	أي مصدر
كبريتات الصوديوم	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert< / em>-Butyl 2،2،2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	ملاحظة: مادة قابلة للاشتعال. مهيج للجلد والعينين
البورون ثلاثي فلوريد إيثرات	Acros Organics	174560250	48٪ BF_{3< / sub>. ملاحظة: مادة قابلة للاشتعال. يسبب حروق الجلد, قاتل إذا تم استنشاقه}
بيكربونات الصوديوم	Acros العضوية	424270010
أسيتات الإيثيل	أي مصدر		لكروماتوغرافيا
العمودn< em>-هكسان	أي مصدر		لكروماتوغرافيا العمود
لمبة إلى لمبة (Kugelrohr) جهاز تقطير	ب ü تشي		نوع الموديل: فرن زجاجي B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
الميثانول	أي مصدر		لكروماتوغرافيا العمود
ثنائي كلورو الميثان & nbsp ؛	أي مصدر		لكروماتوغرافيا العمود
الإيثانول	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N محلول في الميثانول
	البلاديوم Aldrich	643181	15٪ جهاز الهدرجة الرطب
PARR PARR	Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
قمع زجاجي متكلس	أي مصدر
ثيوفوسجين	ألدريتش	115150	ملاحظة: مهيج للجلد. سام إذا تم استنشاقه
ثلاثي إيثيل أمين	ألفا إيسار	A12646
ثنائي كلورو ميثان ؛	Acros Organics	348460010	Extra Dry
النمام المغناطيسي	أي مصدر
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10٪ بالوزن محلول في MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
لوحات كروماتوغرافيا رقيقة	الطبقة Merck Millipore	1.05554.0001
حمض الفورميك	VWR للكيماويات	20318.297
Lophylizer	أي مصدر
جادولينيوم (III) كلوريد سداسي هيدرات	ألدريتش	G7532
هيدروكسيد الصوديوم	Acros Organics	134070010
مقياس الأس الهيدروجيني	أي مصدر
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ملح ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات	Aldrich	E5134
مطياف الكتلة (ESI)	رشيق		فخ SL 1100 ؛
الأسيتات المخزن	لأي مصدر		درجة الحموضة 5.8
زيلينول برتقال	ألدريتش	52097	20 & M في عازلة الأسيتات
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي	Merck Millipore	UFC900324	غشاء Ultracel-3 (MWCO 3000) جهاز
طرد	مركزي أي مصدر
مطياف الرنين المغناطيسي النووي ؛	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		الإصدار 2.1
أداة تحليل الاحتراق	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyzer
MALDI-ToF MS أداة	الأنظمة الحيوية		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert< / em>-Butyl الكحول	Carl Roth GmbH	AE16.1
خلاط دوامة	أي مصدر
أنابيب Norell NMR	Deutero GmbH	507-HP-7
الأنبوب	المحوري NMRDeutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS أداة	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 & mu ؛ م مرشح PTFE	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
قوارير الأنبوب البلاستيكي	أي مصدر
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي	Bruker		BioSpec 70/30 USR المغناطيس (7 طن). ملاحظة: المخاطر المحتملة المتعلقة بالمجالات المغناطيسية العالية
لفائف التردد اللاسلكي	Bruker		ملف حجم التردد المزدوج (RF RES 300 1H / 19F 075/040 LIN / LIN TR)
Paravision (البرنامج)	Bruker		الإصدار 5.1

أيون المؤقت التطبيقية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844(2011).
Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PAMAM DOTA T1 T2

إعداد و في المختبر توصيف وكلاء التباين القائم Dendrimer للتصوير بالرنين المغناطيسي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة