مقالة منهجية

SILAC القائم [بروتيوميك توصيف Exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة

10.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54799

⸱

مارس 3, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن تصف طريقة البروتينات الكمي باستخدام تقنية مستقرة وصفها النظائر عن طريق الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية (SILAC) لتحليل آثار عدوى HIV-1 على proteomes exosomal المضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى الخلايا تحت مختلف الإجهاد أو الإصابة الظروف.

الملخص

Proteomics هو تحليل واسع النطاق للبروتينات. يمكن للتقنيات البروتينية ، مثل التحليل الطيفي الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) ، أن تميز آلاف البروتينات في وقت واحد. تسمح لنا هذه التقنيات القوية بالحصول على فهم منهجي للتغيرات الخلوية ، خاصة عندما تتعرض الخلايا لمحفزات مختلفة ، مثل الالتهابات والضغوط وظروف الاختبار المحددة. حتى مع التطورات الأخيرة ، فإن تحليل البروتين الخارجي يستغرق وقتا طويلا وغالبا ما ينطوي على منهجيات معقدة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تحتاج مجموعة البيانات الكبيرة الناتجة إلى تحليل قوي ومبسط حتى يتمكن الباحثون من إجراء المزيد من الدراسات النهائية. هنا ، نصف بروتوكولا قائما على SILAC لتوصيف البروتين الخارجي عند إصابة الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية -1. تعتمد الطريقة على وضع العلامات البسيطة على النظائر ، وعزل الإكسوسومات عن الخلايا ذات العلامات التفاضلية ، وتحليل قياس الطيف الكتلي. يتبع ذلك التنقيب عن البيانات التفصيلية وتحليل المعلوماتية الحيوية للنتائج البروتينية. من السهل فهم مجموعات البيانات والمرشحين الناتجة وغالبا ما تقدم ثروة من المعلومات المفيدة للتحليل النهائي. ينطبق هذا البروتوكول على الأجزاء الخلوية الأخرى ومجموعة واسعة من ظروف الاختبار.

المقدمة

العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك العدوى الفيروسية، غالبا ما ترتبط مع العمليات الخلوية المميزة التي تحدث في وحول الخلايا المتضررة. والبروتينات، وغالبا ما يتصرف مثل مؤثرات الخلوية في نهاية المطاف، توسط هذه العمليات. تحليل البروتينات في كثير من الأحيان يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن بالنسبة للبيئة المحلية من الخلايا المتضررة وتساعدنا على فهم آلية الكامنة وراء المرض والتسبب. بين مختلف تقنيات تحليل البروتين والبروتينات واعدة للغاية بشكل خاص. كما قوية، أداة واسعة النطاق، يمكن أن البروتينات توفير فهم النظامية من العمليات الخلوية، وخاصة في مجال الوظيفة وتفاعل البروتينات. تحليل بروتينات معينة يتم بساطة من خلال تطوير تقنيات وضع العلامات، والتي تسمح للمحققين لمراقبة تعبير عن المكونات الخلوية، وخاصة البروتينات، في موقع التحقيق. وعلى الرغم من تنفيذ العديد من التحليلات البروتين في الخلويوقد ثبت على نطاق وبروتيوم، الأوصاف البروتين في المقصورات التحت خلوية أن تكون مفيدة بشكل خاص 1. ويتمثل هذا جيدا في دراسات عدوى HIV-1.

Exosomes، 30-100 حويصلات غشاء نانومتر التي يفرزها مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 2، 3، مكونات حاسمة في التواصل بين الخلايا والنقل الجزيئي. تم اكتشافها سابقا للعب أدوار مهمة في HIV-1 في مهدها عملية 4، 5. من خلال الجمع بين تحليل البروتين مع تشريح وظيفي، وجدنا أن exosomes صدر من HIV-1 الخلايا المصابة وتتكون من توقيع البروتين والجزيئات ميناء تنظيمية فريدة ومختلفة من الناحية الكمية التي تؤثر الخصائص الخلوية على الخلايا الاستقبالية، بما في ذلك الخلايا الخلوية وانتشار 6 المجاورة. ووصف الأساليب في هذا البروتوكول،وهي SILAC (نظير مستقر وصفها من قبل الأحماض الأمينية في ثقافة الخلية) 7 استنادا توصيف البروتين من exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة. نهج مماثلة يمكن تطبيقها على فهم أفضل المقصورات التحت خلوية أخرى خلال التسبب عن طريق ضبط الضغط التجريبي إلى المقصورة أو جزء من الفائدة محددة وإجراء التغييرات اللازمة للإجراءات وصفها.

وبالنظر إلى التطورات الأخيرة في طرق البروتين الكمي، وهناك الكثير للاختيار من بينها عند اختيار الأسلوب الأكثر فعالية لإجراء تجربة معينة. ومن بين هذه iTRAQ القائمة على المواد الكيميائية (العلامات إسوي الضغط لتقدير النسبي والمطلق) (8) وMRM خالية من التسمية (مراقبة رد فعل متعددة) 9 التقنيات. كلتا الطريقتين هي أدوات قوية وهي خيارات جيدة لإعدادات محددة. لمختبر نموذجي يعمل أساسا مع خطوط الخلايا، ومع ذلك، وهذه الأساليب لهما relativelذ ارتفاع التكاليف وأكثر بالمقارنة مع طريقة تقوم SILAC تستغرق وقتا طويلا. SILAC هو التمثيل الغذائي القائم العلامات التقنية التي تتضمن أشكال النظائر امشع من الأحماض الأمينية من وسائل الإعلام الثقافة في البروتينات الخلوية. عادة، والتجارب SILAC تبدأ مع اثنين من سكان الخلية، على سبيل المثال، المصابة وغير المصابة. كل وصفت بشكل مختلف في بيئة النظائر محددة إلى حين التوصل إلى وضع علامات كاملة. ثم يتعرض للexosomes وصفت هذه الخلايا لاستخراج البروتين. مرة واحدة المستخرج، ويتم تحليل البروتينات exosomal المسمى باستخدام السائل اللوني جنبا إلى جنب الكتلة الطيفي 10. وأخيرا، يتعرض نتائج مطياف الكتلة والبروتينات وصفت بشكل كبير في الإحصائية والمعلوماتية الحيوية ويحلل وكذلك التحقق الكيمياء الحيوية صارم. وتشير تقاريرنا التحقيق السابقة أن الإجراءات SILAC / exosome أكثر ملاءمة للخطوط الخلايا من الخلايا الأولية، وخطوط الخلايا وعادة ما تكون فيالدولة المتكاثرة نشطة لكفاءة وضع العلامات النظائر،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خلية ثقافة وHIV-1 العدوى

ملاحظة: قبل البدء في التجارب، فمن المستحسن أن تحقق بقاء الخلايا من خلال تلطيخ التريبان الأزرق 11 وانتشارها من خلال فحص MTT 12. ومن الأهمية بمكان استخدام أعدت حديثا المتوسطة SILAC أيضا. خطوط الخلايا المختلفة يمكن استخدامها، طالما أنها في مرحلة التكاثري بنشاط، وعرضة للHIV-1 العدوى، أو حالة اختبار الاختيار. في هذا البروتوكول، استخدم خط الخلية H9 كما في المثال.

  1. البذور 2 × 10 6 خلايا H9 في كل قارورة ثقافة الخلية. تنمو مجموعة واحدة في 10 مل المسمى المتوسط 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مدال مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 ملغم / لتر 13 C 6 L-ليسين و 100 ملغم / لتر 13 C 6 15 ن 4 L-أرجينين. تنمو مجموعة أخرى في 10 مل الخالي من الملصقات المتوسط ​​1640 RPMI، مع 10٪ مدال FBS، و 100 ملغم / لتر L-ليسين و 100 ملغم / لتر أرجينين.
  2. تنمو الخلايا لمدة ستة الأضعاف وعند هذه النقطة هي عمليا صفت بروتينات الخلايا في المتوسط ​​المسمى تماما (> 99٪) مع الأحماض الأمينية الثقيلة. إضافة وسائط جديدة أو تغيير وسائل الاعلام بشكل منتظم (كل 1-3 أيام اعتمادا على نوع من الخلايا للحصول على خلايا H9، تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام). في نهاية الوسم، وزيادة حجم الثقافة (على سبيل المثال ~ 30 مل) لاستيعاب نمو المزيد من الخلايا.
    ملاحظة: تحديد الخلية بالضبط مضاعفة الوقت في بداية التجربة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق وعد الخلايا.
  3. تصيب الخلايا المسمى مع HIV-1 NL4-3 باستخدام معيار HIV-1 العدوى بروتوكول 13 لمدة 48 ساعة. احتضان الخلايا مع الكميات المناسبة من فيروس مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) في جميع أنحاء 0.3. تحقق عدوى HIV-1 عن طريق القياس الكمي P24 من supernatants الثقافة باستخدام HIV-1 P24 مستضد عدة ELISA. إجراء الفحص المناعي 14 لتأكيد الإصابة الناجح للخلايا. كيص تنمو الخلايا غير المسماة في المتوسط ​​الخالي من الملصقات دون عدوى HIV-1.
  4. حصاد supernatants من كلا الفريقين في نهاية العدوى (الخطوة 2.1).

2. Exosome عزل

ملاحظة: من خلال سلسلة من الخطوات تنبيذ فائق، يتم إثراء كسور exosomal من supernatants الثقافة (15). تنفيذ كافة الخطوات التالية في 4 درجات مئوية، مع الدوار نابذة فائقة السرعة التي يمكن أن تصل إلى سرعة لا يقل عن 100،000 ز س.

  1. جمع supernatants من الثقافات في 50 أنابيب مخروطية مل، وتجنب الخلايا. أجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقيقة في 300 x ج لإزالة الخلايا المتبقية.
  2. جمع supernatants في الجديدة 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقيقة في 2000 x ج لإزالة الخلايا الميتة. نقل supernatants لأنابيب الدوار متوافق التجارية التي تكون قادرة على الصمود تنبيذ فائق الناتجة عن ذلك.
  3. مما لا شك فيه لتحقيق التوازن في أنابيب نابذة فائقة السرعة. أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 10000 x ج لإزالةالحطام الخلية.
  4. جمع supernatants في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 70 دقيقة في 100000 ز س. تجاهل supernatants.
  5. Resuspend والكريات exosome الغنية في 5 مل من برنامج تلفزيوني جديد. نقل الحلول لأنابيب نابذة جديدة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 70 دقيقة في 100000 ز س.
  6. supernatants تجاهل. لتخزين exosomes على المدى الطويل، و resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتخزينها في -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخراج البروتين كما هو موضح أدناه.

3. البروتين استخراج وإعداد

  1. حل الكريات exosomal معزولة في 100-200 ميكرولتر المعهد الملكي تحلل واستخراج عازلة مع الكوكتيلات مثبط البروتياز المضافة. يتكون المخزن المؤقت من 25 ملي تريس، هيدروكلوريد، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 0.1٪ SDS (الصوديوم دوديسيل كبريتات)، في درجة الحموضة 7.6. يجب أن تحتوي على زجاجات مثبط البروتياز مجموعة متنوعة من مثبطات الأنزيم البروتيني، مثل أبروتينين، bestatin، لeupeptin، pepstatin ألف وEDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل)، التي يمكن أن تمنع مجموعة كاملة من البروتياز.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحلول المنحل لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج (4 درجة مئوية)، ونقل supernatants مسح لأنابيب microcentrifuge 1.5 مل جديدة.
  3. قياس تركيز البروتين من كل عينة من exosomes باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) أو برادفورد فحص 16.
  4. مزيج مبلغ مساو من البروتينات (2 ميكروغرام) من عينات وصفت وغير المسماة وتشغيل مزيج متساو على 4-20٪ هلام SDS-PAGE في 120 مللي أمبير / 200 فولت لمدة 30 دقيقة.
  5. هلام وصمة عار مع Coomassie الأزرق تليها destaining 17.
  6. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ممر عينة من هلام. ثم قطع الخط جل في 10-15 قطع متساوية. وضع كل قطعة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الطازجة لما مجموعه 10-15 الأنابيب.
  7. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ الأسيتونتريل، الدوامة، وتجاهل supernatants. كرر مرتين. جافمكعبات في مكثف فراغ 18، 19.
  8. ترطيب مكعبات مع 10 ملي dithiothreitol (DTT)، دوامة، لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. طاف تجاهل.
  9. تزج مكعبات هلام في 55 ملي iodoacetamide، دوامة، وتدور. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 45 دقيقة. طاف تجاهل.
  10. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3، دوامة، وتدور، وتجاهل طاف.
  11. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ الأسيتونتريل، دوامة، وتدور. كرر 3.9 و 3.10.
  12. تجفيف مكعبات في مكثف فراغ. إضافة 25 ميكرولتر التسلسل الصف التربسين المعدلة في 25 ملي NH 4 HCO 3، في احتضان 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل الحل الزائد. تزج المكعبات في 25 ملي NH 4 HCO 3 بدون التربسين، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
  13. باختصار تدور المكعبات أسفل ونقل الببتيد الناتجة إضافيةط م إلى أنبوب جديد. إضافة 30 ميكرولتر من حمض الفورميك 5٪ في 50٪ الأسيتونتريل إلى مكعبات، دوامة لمدة 30 دقيقة، وتدور. الجمع بين طاف مع استخراج. تجفيف مقتطفات الببتيد مع مكثف فراغ إلى أقل من 5 ميكرولتر.
  14. إرسال العينات إلى مرفق الأساسية مطياف الكتلة لتحليل LC-MS / MS. ويشمل تحليل البيانات MS، والتي يمكن أن تتولد من البرمجيات مفتوحة المصدر، وعادة عددا انضمام كل من البروتين التي تم تحديدها، وصفت / نسب غير المسماة وعدد من الببتيدات فريدة من نوعها التي تم تحديدها.

4. ويسترن التنشيف التأكيد

ملاحظة: النشاف الغربي من المستحسن للتحقق من النتائج مطياف الكتلة.

  1. اتبع بروتوكولات النشاف الغربي القياسية والتأكد من أن كميات متساوية من البروتين من كل مجموعة يتم تحميلها. استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات من الفائدة (على سبيل المثال A5 annexin، اللاكتات نازعة سلسلة B) التي تم تحديدها من قبل MS. الكشف عن النشاف الغربية، جنبا إلى جنب مع تحليل سياسي كثافةالصورة، يمكن التأكيد على أن MS تحديد البروتين وتقدير صحيحة.

5. تحليل البيانات [بروتيوميك

ملاحظة: تقييم جودة البيانات، المعالجة البيانات، وحساب وتحديد المرشحين كبير البروتين تتم بشكل منفصل لكل MS تكرار. وبمجرد الانتهاء من التحليلات أعلاه، تتم مقارنة البيانات التي تم تحليلها من مكررات والجمع بين 6 و 20 و 21.

  1. تقييم جودة البيانات MS.
    1. أولا، log2 تحويل SILAC-MS المسمى / نسب غير المسماة البروتينات كميا في برنامج جدول بيانات.
    2. في الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية، مجموعة نسب إلى 40-100 صناديق نسبة ومؤامرة على عدد من النسب في بن لتوليد الرسم البياني. والتوزيع الطبيعي من الرسم البياني يشير إلى نوعية جيدة من البيانات MS 6. القيام بهذه الخطوة ليكرر كل MS.
  2. لزيادة الثقة والدقة في نسب الببتيد MS، والنظر في إزالة البروتينات التي لديها أقل من عقدين من الببتيدات كميا.
  3. لتحديد المرشحين البروتين أعلى المصب بشكل كبير وأسفل التنظيم، اتبع الخطوات التالية لحساب أهمية عتبات 22.
    1. في الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية، توليد الانحدار غير الخطي أو منحنى يصلح لتوزيع البيانات تردد. هذه الخطوة ينتج القيم التي يمكن استخدامها لحساب القيم قطع. حساب القيم قطع كما المتوسط ​​± 1.96 σ 95٪ حدود الثقة أو 2.56 σ 99٪ حدود الثقة.
      ملاحظة: تفاصيل محددة لاحتساب انقطاع ويمكن الاطلاع على إيموت وآخرون. 22.
    2. اختيار المرشحين البروتين الذي نسب إما أكبر من 1.96 (أو 2.56) الانحرافات المعيارية فوق المتوسط ​​(إلى حد كبير على مدى أعرب) أو أقل من 1.96 (أو 2.56) الانحرافات المعيارية أقل من المتوسط ​​(نقص كبير في سردتها).
  4. مقارنة مكررات من المرشحين كبيرا المحددة أعلاه لتحقيق الاتساق. تأكد من أنها تلبي المعايير التالية لتمرير هذه الخطوة الاختيار النهائي: يجب أن يتم تحديد المرشحين باستمرار في جميع مكررات. ومكررات مرشح يجب أن تكون متسقة في اتجاهها التنظيم (يفضل أن لا يقل عن 2 من 3 مكررات المرشح يجب أن يكون إما بزيادة التنظيم أو لأسفل التنظيم).
  5. وضع اللمسات الأخيرة بيانات للمرشحين الذين يستوفون المعايير المذكورة أعلاه عن طريق دمج البيانات مكررات بهم ".

6. المعلوماتية الحيوية والتحقق وتوصيف

ملاحظة: العروض المقدمة المعلومات الجينومية وبيوينفورمتيك ثروة من المعلومات عن بروتين تقريبا. استخراج البيانات وتحليل المعلومات البيولوجية على تلك المعلومات يمكن أن تساعد في الحصول على قدر كبير من التبصر في الممتلكات وظائف للمرشحين كبير. هذه اإلجراءاتSS عادة ما تكون ضرورية لتصميم التجارب الرطب مختبر المصب المناسبة.

  1. باستخدام أعدادهم بنك الجينات الانضمام أو معرفات يونيبروت، بحث المرشحين ضد قواعد البيانات exosome الحالية (Exocarta 23، Evpedia 24) للتحقق من أن البروتينات مرشح تم العثور سابقا في exosome. هذه الخطوة يضيف طبقة من الثقة أن المرشحين هي في الواقع في exosomes.
    1. http://www.exocarta.org/ الوصول، انقر فوق "استعلام" وإدخال إما الجين أو البروتين عدد اسم / الانضمام. صفحة ملخص ستظهر وسيتم عرض الأدلة في exosome، بشرط إذا كان هناك أي.
  2. بحث المرشحين ضد HIV-1 والبروتين البشري التفاعل قاعدة البيانات 25. بدلا من ذلك، ابحث في قواعد البيانات المحددة التي يمكن أن توفر معلومات حول تفاعل البروتينات مرشح وحالة الاختبار.
    1. الوصول إلى قاعدة بيانات في www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVالتفاعلات. على الدخول "اسم النطاق البروتين، أدخل أسماء المرشحين أو أرقام الانضمام، وانقر البحث. يمكن للنتائج البحث توفر نظرة ثاقبة للتفاعلات بين المرشحين بروتين HIV-1 و، واقتراح أي من المرشحين قد يكون حقا HIV-1 المرتبطة بها.
  3. استيراد بنك الجينات أرقام الانضمام أو يونيبروت معرفات للمرشحين في برامج التحليل GO (مثل FunRich، والإثراء الوظيفي أداة تحليل 26) وتشغيل البرنامج.
    1. تحميل البرنامج في http://www.funrich.org/. بعد التثبيت، افتح البرنامج، تحت تحليل التخصيب، انقر فوق "إضافة مجموعة البيانات"، وتحميل قائمة من البروتين / الجينات. بعد ذلك، حدد نوع التخطيط لتصور تحليل GO.
      سيتم إظهارها GO تحليل النتائج في شكل الرسوم البيانية الدائرية: ملاحظة. هذه الخطوة تساعدنا على اكتساب المعرفة العالمية المرتبطة المرشحين في مجالات عملية بيولوجية (BP)، المكون الخلوية (CC)، والبيولوجيا الجزيئية وظيفة (MF).
  4. وصول ديفيد في http://david.ncifcrf.gov/ 27، انقر فوق "أداة الشرح وظيفية" على موقعها على الانترنت. أدخل قائمة المرشحين، حدد "معرف" من الجينات مثل "معرف يونيبروت"، حدد "قائمة جين" والبحث. شروط المخصب GO، القيم ص، وغيرها من المعالم يمكن العثور عليها عن طريق النقر على "الشرح ملخص نتائج" صفحة تحت فئة "Gene_Ontology".
  5. للتحقيق في التفاعلات المحتملة للمرشحين مع بروتينات أخرى، استخدم الوصول إليها علنا قاعدة بيانات STRING 28 إلى توضيح البروتين البروتين التفاعلات المحتملة والمسارات البيوكيميائية الممكنة.
    ملاحظة: أبدأ تحليل وشرح وظيفية (القسم 6،3-6،4) يمكن أيضا أن يقوم باستخدام أحدث البرامج STRING.
    1. الوصول إلى قاعدة بيانات في http://string-db.org/. إدخال معرف البروتين أو تسلسل في الصورة المعينةمربع earch واختيار الأنواع الصحيحة للتحليل. انقر على "بحث". فإن النتائج تعطي معلومات عن كل الجمعيات المباشرة (المادية) وغير المباشرة (وظيفية). سيتم عرض أفضل عشر مباريات المعروف للمرشح exosomal وينبغي النظر فيها لاختيار مرشح كبيرة.
      ملاحظة: هناك قدر كبير من المعلومات المرتبطة المرشحين يمكن تحليلها باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه. يمكن اختيار المرشحين الأبرز لمزيد من التحليل الجزيئي والكيمياء الحيوية المصب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1A هو مخطط يحدد SILAC وضع العلامات الإجراء 21. من أجل تنقية exosomes، لا بد من نسج عينات أسفل عن طريق الطرد المركزي. ويبين الشكل 1B خطوات تنقية exosome بواسطة تنبيذ فائق التسلسلي 21. مرة واحدة تنقيته، وexosomes تخضع لتحليل البروتين التجريبي على النحو المبين في الإجراء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الإجراءات الموضحة في هذه الورقة، أثبتنا تطبيق تقنية SILAC لدراسة تأثير الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 1 على بروتيوم exosomal المضيف. في البداية، الخلايا المصابة غير المصابة وHIV-1 هي تفاضلي المسمى النظير. ثم يتم تنقيته من exosomes المسمى تفاضلي قبل تنفيذ استخراج البروتين. بعد ذلك، يتم توظيف السائل اللوني، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة لتحليل بروتيوم exosomal. وأخيرا، يتعرض ينتج عن ذلك من بيانات مطياف الكتلة والبروتينات المرشحة المحتملة لالإحصائية والمعلوماتية الحيوية يحلل قبل ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل الملحق الأذربيجانية إلى عمر / تافتس / براون CFAR، P30AI042853-13S1، المعاهد الوطنية للصحة P20GM103421، P01AA019072، R01HD072693، وK24HD080539 إلى BR. وأيد هذا العمل أيضا من قبل صندوق عمر الطيار البحوث (# 701- 5857)، رود ايلاند مؤسسة أبحاث الطبية غرانت (# 20133969)، والمعاهد الوطنية للصحة كوبر أوري / RIH الطيار منحة بحثية (P20GM104317) لML. نشكر جيمس Myall وVY دانغ للمساعدة في إعداد المخطوط والشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خط الخلية H9ATCCHTB-176
Trypan BlueThermo Fisher15250061
مجموعة فحص MTTThermo FisherV13154
مصل بقري الجنين المخلل (FBS) ThermoFisher26400044
SILAC Protein Quantitation Kit & ndash ؛ RPMI 1640Thermo Fisher89982إصدار DMEM (89983)
L-Arginine-HCl ، 13< / sup>C6< / sub> ، 15< / sup>N4< / sub> ل SILACThermo Fisher88434
L-Lysine-2HCl ، 13< / sup>C6< / sub> ل SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3برنامج كاشف الإيدز NIH2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kitPerkinElmerNEK050001KT
أجهزة طرد مركزي مبردة فائقةالسرعة Eppendorf22628045
طرد مركزي فائقة مبردةBeckman Coulter363118يجب أن تكون قادرة على الوصول إلى 100,000 × g
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةThermo Fisher14-432-22
أنابيب الطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر326823
SW 32 Ti الدواربيكمان كولتر369694
RIPA عازلةThermo Fisher89900
كوكتيلات مثبطات البروتيازThermo Fisher  ؛ 78430
ThermoMixer Eppendorf5384000020
مجموعة فحص البروتين BCA  Thermo Fisher23250
مقياس الطيفBiorad1702525
SDS PAGE جهاز جلThermo FisherEI0001
Novex 4-20٪ Tris-Glycine Mini GelsNovexXV04200PK20
Gel تلطيخ الكاشفSigma AldrichG1041
تسلسل الصف المعدل TrypsinPromegaV5111
مكثف SpeedVacThermo FisherSPD131DDA
الجسم المضاد للملحق البشري A5Abcamab14196
الجسم المضاد لنازعة هيدروجين اللاكتات البشرية سلسلة BAbcamab53292
الرسوم البيانية والبرمجيات الإحصائيةSystat   ؛SigmaPlot أو GraphPad Prism
مجموعة برامج البروتينات الكميةمعهد ماكس بلانك للكيمياء الحيويةMaxquant & nbsp ؛
البرامج وقواعد البياناتالبائعينالمختلفون الرجوع إلى النص الرئيسي للحصول على التفاصيل
أجهزة الضوئي

المراجع

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SILAC HIV 1 LC MS MS SDS PAGE GO STRING

مقالات ذات صلة