مقالة منهجية

منهج في استخراج أصباغ من الحبار Doryteuthis pealeii

DOI:

10.3791/54803

⸱

نوفمبر 9, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of New Hampshire, 2Materials Science Program, University of New Hampshire

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول لاستخراج الصبغات من حبيبات ذات البنية النانومترية في Doryteuthis pealeii chromatophores الحبار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تخضع رأسيات الأرجل لتغييرات سريعة وقابلة للتكيف في تلوين الجلد لأغراض الاستشعار والتواصل والدفاع والتكاثر. يتم دعم هذه القدرات جزئيا من خلال التمدد المساحي وتراجع الأعضاء المصطبغة المعروفة باسم الكروماتوفور. في حين أنه من المعروف أن الكروماتوفورات تحتوي على شبكة مربوطة من الحبيبات المصطبغة ، إلا أن خصائص وظيفتها الهيكلية لم يتم تفصيلها بالكامل. نصف طريقة لعزل الحبيبات ذات البنية النانوية في كروماتوفورات الحبار Doryteuthis pealeii ونوضح كيف يمكن استخراج الأصباغ المرتبطة بها في المذيبات الحمضية. لتحقيق ذلك ، يتم أولا عزل طبقة الكروماتوفور التي تحتوي على طبقة جلدية يدويا باستخدام تشريح سطحي ، وتتم إزالة حبيبات الصباغ باستخدام دورات الصوتنة والطرد المركزي والغسيل. ثم يتم استخراج الأصباغ المحصورة داخل الحبيبات المنقاة عن طريق محاليل الميثانول الحمضية ، مما يترك الهياكل النانوية بأقطار أصغر خالية من اللون المرئي. ينتج عن إجراء الاستخراج هذا إنتاجية بنسبة 58٪ من الأصباغ القابلة للذوبان المعزولة من الحبيبات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحديد تكوين أصباغ الكروماتوفور واستخدامها لتوفير نظرة ثاقبة لآلية التلوين التكيفي في رأسيات الأرجل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رأسيات الأرجل مثل الحبار، الحبار، والأخطبوط لديها القدرة على تغيير مظهرها لتمويه والإشارات بشكل حيوي. 1-6 ويدعم هذه القدرة في جزء من التوسع المساحي الانتقائي للأجهزة الصباغية المعروفة باسم chromatophores. 4،7-9 Chromatophores هي المحركات الغازية التي تحتوي على شبكة من حبيبات الصباغ ذات البنية النانومترية محصورة ضمن كييس cytoelastic أن يرتكز شعاعيا من الألياف العضلية. 1،3 وودفعتها أنها، chromatophores توسع بنسبة 500٪ في مساحة عرضها توزيع الحبيبات في جميع أنحاء الجهاز. 3،7 ، 10،11 عندما يتم منسقة هذا العمل على مدى عدد من chromatophores، يتم تغيير تلوين الشامل للحيوان. في حين أنه من المعروف أن حبيبات الصباغ تساهم في هذا التغيير اللون، لا يزال تكوينها غير معروف. نحن تصف الإجراء لعزل وتنقية أصباغ صبغية التي يمكن تكييفها للدراسات التركيبية في المستقبل.

SS = "jove_content"> عزلة حبيبات الصباغ ينطوي على استخراج متعددة الخطوات، التجانس، وإجراء تنقية. تحصد 3،12 صبغية تحتوي على الأنسجة من خلال استئصال حذرا من الرخويات. ثم يتم استخدام عملية الهضم والتجانس لفصل الأنسجة المحيطة بها، وفصل خلايا صبغية. حبيبات ذات البنية النانومترية ثم يتم معزولة وتنقيته من chromatophores المتبقية باستخدام صوتنة المتكررة والطرد المركزي. على تنقية، يتم استخراج الصبغات من حبيبات في العملية التي يتم تكييفها من استخراج اللون مرئية من أجنحة فراشة باستخدام حلول الميثانول الحمضية. وتستخدم 13 الضوئي المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والقياس الطيفي للتأكد من أن الصبغات صبغية يتم استخراج بنجاح باستخدام هذه العملية.

يصف هذا الأسلوب عزلة حبيبات صبغية الذي يستخدم لاستكشاف المساهمات الجزيئية لجoloration في رأسيات الأرجل. 12 الاستخراج جزيء صغير من الحيوانات كلها وغالبا ما يكون عملية طويلة وشاقة. والهدف هنا هو إطلاع الباحثين في المستقبل من نظام فعال وسطحي لشراء أصباغ من حبيبات ذات البنية النانومترية في رأسيات الأرجل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدراسات على الحيوانات اللافقارية التي أجريت في هذه الوثيقة لا تنظم في الولايات المتحدة؛ لذا يتعين على اللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي أي سلطة لإعادة النظر في هذه البروتوكولات. بدلا من هذه التي لا تندرج تحت اختصاص التنظيم في الولايات المتحدة، والكتاب نعلن هنا أن أجريت هذه الدراسات مع جهد صادق نحو الاستخدام الأخلاقي، والرعاية، والعلاج من هذه الحيوانات، والتقليل من عدد من الأفراد وهذه الجهود تتفق مع إعلان بازل والمجلس الدولي لمختبر علم الحيوان (ICLAS) المبادئ التوجيهية الأخلاقية.

1. Doryteuthis pealeii (د pealeii) تشريح

  1. شراء قطع رأس الحبار د. pealeii من وزارة الموارد البحرية في المختبر البيولوجي البحري في وودز هول، MA أو من أي سوق الأسماك الطازجة. لا تستخدم العينات التي تم منزوع أو تغييرها في وقت سابق من أجل تطبيق هذا الإجراء. على وجه التحديد، وصفاءيجب أن يكون لا يزال طبقة tophore سليمة على عينة.
    1. إذا لم يتم استخدام الحيوانات فورا، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. محاولة لكسر جمود العينات، ووضعها في الماء درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة قبل تشريح.
  2. باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ على التوالي مقص تشريح غرامة نقطة، وقطع على طول الجانب الخلفي من الحيوان. تبدأ في قاعدة عباءة بطني، وينتهي عند منطقة الزعانف.
  3. إزالة كافة الأعضاء الداخلية (المعدة، الخيشومية، غدة الحبر، والأعضاء التناسلية والقلب النظامية، والقلب العضدية) التي رفعها مع تشريح ملقط وقطع أنسجتهم الضام باستخدام مقص تشريح. تجاهل أجهزة في كيس العينة.
  4. استخدام تشريح T-دبابيس لدبوس عباءة (الجانب زعنفة متابعة) في معيار 11-1 / 2 "س 7-1 / 2" س 1-1 / 2 "الألومنيوم تشريح عموم تحتوي على لوحة تشريح مرنة. يغرق في الأنسجة 250 مل من مياه البحر التي تم تصفيتها من خلال نظام الترشيح فراغ البوليسترين القابل للتصرفتحتوي على 0.2 ميكرومتر أحجام المسام.
  5. بعناية إزالة طبقة البشرة الجلد (لون معتم) مع ملقط تشريح، والحفاظ على صبغية تحتوي على طبقة الجلد سليمة. وبمجرد إزالة طبقة البشرة، تخلص منه في كيس العينة.
  6. تشريح صغيرة (1 سم × 1 سم) أجزاء من طبقة صبغية مع ملقط ومقص تشريح. جمع العينات في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة (ملء نصف واحد من كل أنبوب فارغ مع تشريح الأنسجة).
  7. إضافة 500 ميكرولتر من مياه البحر التي تمت تصفيتها إلى الأنسجة التي تحتوي على أنابيب. العينات يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

2. عزل صبغية صبغات حبيبات

  1. الأنسجة الهضم
    1. إعداد غراء / كولاجيناز
      1. تزن من 30 ملغ من كولاجيناز و 5 ملغ من غراء باستخدام 4 "× 4" النيتروجين انخفاض وزن الورق. نقل هذه إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البولي بروبيلين مع غطاء المسمار.
      2. قياس 10 مل من deionizإد المياه باستخدام ماصة تخرج. مباشرة إضافة إلى قارورة تحتوي على غراء / كولاجيناز. دوامة على أعلى الإعداد حتى حل واضح.
    2. إزالة الأنسجة خارج الخلية
      1. أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها من الخطوة 1.7 لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية.
      2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء / كولاجيناز إلى الأنسجة باستخدام P1000 حجم متغير قناة واحدة micropipette. دوامة كل عينة لمدة 1-2 دقائق على أعلى الإعداد.
      3. يصوتن العينات لمدة 5 دقائق على تردد 40 كيلوهرتز إلى فصل الخلايا من الأنسجة المحيطة بها.
      4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية.
      5. أجهزة الطرد المركزي الأنسجة صبغية التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 14000 ز س. تجاهل الطبقة العليا من مياه البحر في دلو النفايات البلاستيكية. أكرر مرة أخرى.
      6. يدويا إزالة أي ثانية الأنسجة كبير المتبقيةستعقد التي لم تهضم في هذه العملية مع ملقط قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  2. عزل صبغات حبيبات
    1. إعداد التجانس العازلة
      1. تزن 2.38 غرام من (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES، 100 مم)، 0.095 غرام من كلوريد المغنيسيوم (10 ملم)، 0.856 غرام من البوتاسيوم اسبارتاتي (50 ملم)، و0.015 غرام من dithiothreitol (1 ملم). نقل إلى وعاء البوليسترين 150 مل مع غطاء المسمار. إضافة واحد تجاري لوحي مصغر مثبط البروتياز.
      2. قياس 100 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام الاسطوانة. مباشرة إضافة إلى الحاوية التي تحتوي على أملاح التجانس. دوامة حتى حل واضح.
    2. تجانس حبيبات الصباغ
      1. أجهزة الطرد المركزي كل عينة من الخطوة 2.1 في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. وينبغي أن تكون هذه العينة باطلة من النسيج خارج الخلية.
      2. إضافة 500 &# 181؛ ل العازلة التجانس لكل أنبوب ودوامة لمدة 1-2 دقائق لكل منهما لمزيج دقيق العينات. يصوتن العينات لمدة 30 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز) وتابع مع 5 دقائق من الطرد المركزي في 14000 ز س.
      3. تجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية، وكرر الخطوة السابقة 2-3 مرات لضمان الهضم الكامل للكييس صبغية والبروتين الحبال. وينبغي أن يتضمن الحل المتبقية طاف أصفر فاتح وبيليه أحمر اللون تحتوي على حبيبات الصباغ معزولة.

3. صبغات استخراج

  1. إعداد الميثانول حمضي (حمض الهيدروكلوريك-MeOH)
    1. بعناية إضافة 25 ميكرولتر من تتركز (36،5 حتي 38٪ (ث / ث)) حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى 5 مل من الميثانول (MeOH). تخزين حل حمض الهيدروكلوريك-MeOH في سقف المسمار عينة زجاج القارورة. دوامة بلطف لمزج موحد الحل.
      ملاحظة: أكثر حمضية الحل، سيتم استخراج المزيد من الصباغ خلال فاياستخراج RST.
  2. استخراج الصباغ
    1. الطرد المركزي تعليق الصباغ الحبيبية (من 2.2.2) لمدة 5 دقائق في 14000 x ج وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول حمض الهيدروكلوريك-MeOH ودوامة كل عينة ل~ 3-4 دقيقة. يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة (~ 40 كيلو هرتز)، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 14000 ز س.
    3. باستخدام ماصة نقل، وجمع طاف في 1 درهم قارورة المسمار أعلى الزجاج. وينبغي أن يكون طاف الأحمر الداكن اللون.
    4. كرر 3.2.2 استخراج الخطوة حتى يتم استخراج أي لون آخر (~ 4-5 يغسل).
      ملاحظة: كل استخراج تسفر ~ 1.5 مل من الصباغ. بيليه عديم اللون المتبقي هو الصباغ استخراج حبيبات. ملاحظة: كل من حبيبات عديم اللون وأصباغ المستخرج يمكن تخزين في الماء عند 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

4. توصيف طوال عملية استخراج

  1. مسح شركةectron المجهر
    1. صورة حبيبات (غير المتفاعل من الخطوة 2.2.1 ومن الخطوة 3.2.3-استخراج الصباغ) باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للتحقق من نقاء عملية الاستخراج.
    2. لإعداد العينات الحبيبية للتصوير، أجهزة الطرد المركزي الأول سواء حبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات لمدة 5 دقائق في 14000 x ج، وتجاهل طاف في دلو النفايات البلاستيكية. اعادة تعليق هذه في 1 مل من الايثانول، وإيداع 2-3 قطرات من تعليق الحبيبية على بذرة الألومنيوم SEM باستخدام ماصة نقل.
    3. بعد تجفيف العينات بين عشية وضحاها، تفل معطف مع طلاء الذهب والبلاتين لمدة 3 دقائق لتحقيق طلاء 15 نانومتر.
    4. صورة باستخدام SEM مع باعث شوتكي وكشف الإلكترون الثانوية. استخدام 5-7 كيلو فولت شعاع الجهد والعمل لمسافات ما بين 8 و 9 ملم الى صورة هذه المواد.
  2. الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية تجاه) القياسات الطيفية
    1. مراقبة الامتصاصية المواليةملفات لجميع الظروف 3 (الحبيبية غير المتفاعل من 2.2.2، الصباغ المستخرج من 3.2.3، والصباغ استخراج حبيبات من 3.2.4) باستخدام شعاع الطيف الضوئي المزدوج 200-800 نانومتر.
    2. جمع قياس فارغة باستخدام الماء منزوع الأيونات في كوفيت 1 مل لحبيبات غير المتفاعل والصباغ استخراج حبيبات. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس أطياف الامتصاص للعينات.
    3. جمع قياس فارغة باستخدام محلول الميثانول الحمضية في كوفيت 1 مل لالصباغ المستخرج. جمع أشعة فوق البنفسجية فيس طيف الامتصاص للعينة.
    4. تحديد الحد الأقصى الطول الموجي من كل عينة عن طريق تحديد الطول الموجي الذي ذروة الامتصاصية يصل أقصى ارتفاع لها النسبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تشريح Chromatophores من د. pealeii ظهري عباءة (الشكل 1A، 1B). مرة واحدة يتم إزالتها، وهي lysed chromatophores وتنقيتها باستخدام الطرد المركزي وغسل دورات لعزل من الحبيبات الصباغية (أرقام 2A، 2B). وتستخدم حلول الميثانول الحمضية (حمض الهيدروكلوريك-MeOH) لاستخراج الصباغ من حبيبات (الشكل 2C)، مما أسفر عن استخراج الصباغ القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أثبتت طريقة لاستخراج الصبغات من حبيبات صبغية الحبار. التي تستهدف على وجه التحديد الحبيبات، وهدفنا هو تحديد دورها في التوسط تلوين التكيف. يختلف هذا الأسلوب من التقارير السابقة تهدف إلى تميز أصباغ رأسيات الأرجل باستخدام عينات الأنسجة السائبة 14 أو تجميد المجفف الجلد 15.

في حين أن هذا البروتوكول هو فعال في استخراج أصباغ صبغية، فإنه يقتصر على جداول رد فعل الصغيرة. تشريح واحدة عوائد الحبار ~ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بامتنان باستخدام المرافق في جامعة نيو هامبشاير بما في ذلك مركز الأجهزة الجامعية. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة نيو هامبشاير ، قسم الكيمياء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كولاجينازألفا إيسار9001-12-1لا يوجد خطر
DithiothreitolSigma-Aldrich3482-12-3مهيج ، سمية حادة
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9مهيج خفيف
حمض الهيدروكلوريكEMD Chemicals7647-01-0تآكل
k-AspartateSigma-Aldrich1115-63-5يتفاعل بعنف مع المؤكسدات
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش7786-30-3مهيج خفيف للعين
الميثانولفارمكو-AAPER67-56-1صغير قابل للاشتعال
مثبطبرياز سيجما ألدريتش469315-90-01تآكل للمعادن والجلد
غراءسيجما ألدريتش9001-73-4مهيج  
قرص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, G. R. R., et al. Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin. Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).
  2. Crookes, W. J., et al. Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues. Science. 303 (5655), 235-238 (2004).
  3. Deravi, L. F., et al. The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores. J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).
  4. Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods. J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).
  5. Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid. Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).
  6. Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores. Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).
  7. Cloney, R. A., Brocco, S. L. Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods. Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).
  8. Hanlon, R. T., Messenger, J. B. Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).
  9. Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects. J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).
  10. Florey, E. Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores. Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).
  11. Florey, E., Kriebel, M. E. Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs. Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).
  12. Williams, T. L., et al. Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores. Langmuir. , (2016).
  13. Nijhout, H. F. Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae). Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).
  14. Van Den Branden, C., Decleir, D. A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis. L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).
  15. Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة