الماوس المجهرية تسريب تقنية لالمستهدفة المواد تسليم في الجهاز العصبي المركزي عبر في الشريان السباتي الداخلي

ملخص

يصف البروتوكول الحالي تقنية تسريب الجراحة المجهرية للفأر ، والتي تنقل المواد بشكل فعال إلى الدماغ مباشرة عبر الشريان السباتي الداخلي.

الملخص

تتطلب النماذج الحيوانية لأمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وبالتالي أمراض اضطراب الحاجز الدموي الدماغي ، توصيل مواد خارجية إلى الدماغ. قد تؤدي هذه المواد الخارجية إلى تأثير ضار أو تشكل استراتيجية علاجية. تعتمد طرق توصيل المواد الخارجية الأكثر شيوعا إلى الدماغ على الولادات الجهازية ، مثل الطرق تحت الجلد أو الوريدية. على الرغم من أنها شائعة الاستخدام ، إلا أن هذه الأساليب لها العديد من القيود ، بما في ذلك انخفاض فعالية التوصيل إلى الدماغ. في المقابل ، فإن الطرق الجراحية التي تنقل المواد محليا إلى الجهاز العصبي المركزي أكثر تحديدا وتمنع امتصاص الأعضاء الأخرى للمواد الخارجية. تتوفر العديد من الطرق الجراحية لتوصيل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإنها تميل إلى أن تكون مؤلمة للغاية. هنا ، نصف تقنية الجراحة المجهرية بتسريب الفأر ، والتي تنقل المواد بشكل فعال إلى الدماغ عبر الشريان السباتي الداخلي ، مع الحد الأدنى من الصدمات وعدم التدخل في وظائف الجهاز العصبي المركزي الطبيعية.

المقدمة

في النماذج الحية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) أمراض تتطلب التنفيذ الفعال للمواد الخارجية، مثل المخدرات، ومسببات الأمراض، أو exosomes، في الدماغ. ولذلك، ينبغي أن يسبب طريقة التسليم المثالي الحد الأدنى من الصدمة للحيوان، والحفاظ على سلامة الشبكة العصبية، وتحقيق تركيزات المواد عالية في الدماغ ^1.

وقد وصفت العديد من الطرق الجراحية لتسليم مادة المحلي، بما في ذلك داخل غمد، داخل المخ، والحقن داخل البطين أو يزرع ^{2، 3، 4، 5.} هذه الطرق، ومع ذلك، تعتبر الصدمة على الجهاز العصبي المركزي، وتسمح إدارة كميات منخفضة فقط من المواد المثيرة للاهتمام. وعلاوة على ذلك، فقد قيل أن المواد الخارجية يمكن إزالتها بسرعة عن طريق السائل النخاعي ⁶ ، ولوحظ انخفاض مدى تغلغل في لحمة الدماغ ⁷ عندما تستخدم التقنيات المذكورة أعلاه. وتستخدم طرق التسليم النظامية، مثل الفم والرئة، تحت الجلد، وطرق الوريد، وهو الأكثر شيوعا في النماذج الحيوانية، على الرغم من أنها تظهر فعالية منخفضة في إيصال المواد إلى الجهاز العصبي المركزي، وذلك بسبب امتصاص من قبل الأجهزة الأخرى ^{8 و 9.} وبالتالي، هذه المسارات التسليم تتطلب جرعات مرتفعة من المواد التي يديرها، وزيادة خطر الآثار الجانبية والسمية ^{10 و 11.}

هنا، نحن تصف تقنية جراحة الماوس التسريب، والتي توفر بشكل فعال المواد مباشرة إلى الدماغ عن طريق الشريان السباتي الداخلي. بالإضافة إلى استهداف التسليم إلى الجهاز العصبي المركزي، وهذا الأسلوب لا تجاوز الحواجز الفيزيولوجية الطبيعية، وبالتالي يتصل اتصالا وثيقا البيولوجيةعمليات لتر المشاركين في مقاطع من العلاجات أو مسببات الأمراض في الدماغ.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة في بروتوكول التالي من جامعة ميامي المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC). وبالإضافة إلى ذلك، تجرى جميع الإجراءات في المرافق التي وافقت عليها الجمعية للتقويم والاعتماد للرعاية الحيوان المعملية الدولية (AAALAC).

1. إعداد الفئران لجراحة

1. تخدير الماوس مع isoflurane مختلطة مع الأكسجين، وذلك باستخدام نظام التخدير المختبر. استخدام الأيزوفلورين في وضع بين 4-5٪ وتدفق الأوكسجين في 2 لتر / دقيقة على آلة التجارية (راجع المواد الجدول). نقل الحيوان إلى سطح الجراحة، تحت مجهر تشريحي، والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف (استخدام الأيزوفلورين وضع 1،5-2،5 وتدفق الأوكسجين في 2 لتر / دقيقة).
   1. تأكد من أن معدل التنفس الماوس حوالي 1-2 التنفس / ثانية دون يلهث. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن هذا الحيوان لا يحمل رد فعل التحفيز شعرات ودواسة صeflex (قرصة أخمص قدميه). مراقبة معدل التنفس والجهد أثناء الجراحة، على الأقل كل 5 دقائق. اتبع محددة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة والمبادئ التوجيهية البيطرية لرصد القوارض التخدير.
2. تطبيق قطرة من زيوت التشحيم العيون على كل عين باستخدام مسحة معقمة لمنع جفاف. ويوصى إدارة المضادة للالتهابات والمسكنات لتخفيف الانزعاج.
3. مع الحيوان ملقى على ظهره، والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف.
4. تنظيف منطقة الرقبة الحيوان عن طريق محو المنطقة ثلاث مرات مع الإيثانول 70٪ والكلورهيكسيدين. حلاقة منطقة جراحة الحيوان باستخدام شفرة حلاقة (مفصلة أدناه).

2. تشريح الشريان السباتي المشترك (CCA)

1. تنفيذ الإجراء المجهرية بأكمله تحت مجهر تشريحي. باستخدام مقص جراحي وملقط أداء شق خط الوسط الضحلة في الرقبة، من فوق عظمة الصدر إلى أقل من طنانه الفك (حوالي 3-4 سم).
2. باستخدام ملقط الدهنية منفصل بعناية والنسيج الضام لفضح القصبة الهوائية.
3. ضع وسادة (وجوه مستديرة، حوالي 0.5 سم وقطرها) على الجزء الخلفي من الرقبة من الماوس لتمديد العنق، مما يعرض المنطقة.
4. فصل الأنسجة باستخدام إما ضام الأنسجة أو السنانير.
5. على الجانب الحيوان الأيسر من القصبة الهوائية، ينتف الريش بعناية بعيدا النسيج الضام لفضح CCA اليسار.
6. باستخدام ملقط إزالة بعناية كل النسيج الضام لفضح التشعب التقييم القطري المشترك، وبداية كل الشرايين السباتية الداخلية والخارجية.

3. إعداد التقييم القطري المشترك لتسريب المواد المخدرة

1. إدراج جزأين من الخيط النايلون (حوالي 1 سم لكل منهما) تحت الشريان السباتي الخارجي (ECA)، وذلك باستخدام ملقط.
2. وضع عقدة دائمة في أعلى نقطة ممكنة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
3. عند أدنى نقطة ممكنة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، وعلى الفور فوق التشعب التقييم القطري المشترك، ومكانعقدة القابلة للإزالة. وينبغي أن تكون هذه العقدة فضفاض بالمقارنة مع عقدة العليا.
4. إغلاق التقييم القطري المشترك باستخدام مقطع السفينة، عند أدنى نقطة ممكنة.
5. إغلاق الشريان السباتي الداخلي (ICA) باستخدام مقطع السفينة.
6. باستخدام مقص الربيع تسليخ مجهري أداء قطع صغيرة في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (حوالي 2 مم)، وبين عقدة اثنين.

4. تسريب المواد المخدرة عبر ICA

1. تجميع نظام الحقن في الوريد. نعلق 6 بوصات من الأنابيب الشعرية (أبعاد مثالية: 2.5 مم × 1.2 مم) إلى حقنة السلين تحتوي على 250 ميكرولتر من المادة المراد غرست (المخدرات، ومسببات الأمراض، والحويصلات خارج الخلية، وغيرها)، وإدراج غيض شعري بلطف في شق تنفيذ في الخطوة 3.6.
2. الاستمرار في الانزلاق على شعري حتى تصل إلى نقطة الوسط بين التشعب ومقطع إغلاق التقييم القطري المشترك.
3. التعادل لأسفل انخفاض اللجنة الاقتصادية لأفريقيا عقدة. تحقق من أن عقدة فضفاضة بما يكفي للسماح الشعرية سيولة وضيقة بما يكفي لمنع تتسربز.
4. إزالة مقطع من الإدارة المدنية الإسرائيلية.
5. تطبيق الضغط بلطف على حقنة مكبس السماح مادة ضخ في ما يقرب من 10 ميكرولتر في الثانية الواحدة.

5. إجراءات تسريب المشاركة

1. مكان مقطع مرة أخرى على ICA.
2. إزالة بلطف الأنابيب الشعرية.
3. التعادل لأسفل انخفاض اللجنة الاقتصادية لأفريقيا عقدة تماما.
4. إزالة لقطات من ICA والتقييم القطري المشترك.

6. شق الإنتهاء والعناية بعد العملية

1. إزالة ضام أو الأنسجة السنانير وسادة.
2. منطقة خياطة نظيفة باستخدام محلول ملحي معقم.
3. إغلاق شق باستخدام النايلون خياطة / إبرة وملقط.
4. إدارة المضادة للالتهابات والمسكنات لتخفيف الانزعاج بعد الجراحة.
5. وضع الحيوانات في قفص وضعها على وسادة التدفئة لا يقل عن 1 ساعة والانتعاش الشاشة.

النتائج

هذه التقنية المجهرية الماوس ضخ الموصوفة هنا هي متعددة للغاية، واستخدمت لتقديم مواد مختلفة مباشرة في الدماغ، بما في ذلك تسليم الخلايا السرطانية في نموذج تمثيلي لتكوين ورم خبيث في الدماغ ^{1 و 12.}

هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لتقييم الجوانب المرضية لمسببات الأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركز...

المناقشة

وقد أثبت المجهرية ضخ الموصوفة هنا أن تكون ناجحة جدا في إيصال المواد الخارجية من مختلف الخصائص البيولوجية في الجهاز العصبي المركزي، ومنع نشر غير المرغوب فيها في جميع أنحاء الجسم ^{1، 12.} تعطيل حاجز الدم في الدماغ هو سمة المرضية من العديد من الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي؛ ولتقييم العلاقة بين المواد الخارجية مع حاجز الدم في الدماغ هو من أهمية كبرى والفائدة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أداة التخدير	Vetequip	901806
مقص جراحي	أداة العلوم الدقيقة	14558-09
ملقط جراحي طرف مستقيم	أداة العلوم الدقيقة	00108-11
ملقط جراحي طرف بزاوية	أداة العلوم الدقيقة	00109-11
مقص زنبركي	أداة العلوم الدقيقة	15000-08
خياطة النايلون	Braintree Scientific	SUT-S 104
أنابيب شعرية (Micro-Renathane 0.010 "× 0.005" لكل قدم)		برينتري MRE01050
الخياطة الختامية	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريد	فيشر Scientific	50-121-8005