يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إزالة بيوفيلم عن طريق بخاخات ثاني أكسيد الكربون دون النيتروجين تطهير

6.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

نوفمبر 6, 2016

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

في هذه المقالة

ملخص

يمكن إزالة

الأغشية الحيوية على الأسطح بشكل فعال وسريع باستخدام نفاثة دورية من الهباء الجوي لثاني أكسيد الكربون دون تطهير النيتروجين.

الملخص

يمكن أن تسبب

biofilm مخاوف خطيرة في العديد من التطبيقات. لا يمكن أن تسبب خسائر اقتصادية فحسب ، بل يمكن أن تشكل أيضا خطرا على الصحة العامة. لذلك ، من المستحسن للغاية إزالة الأغشية الحيوية من الأسطح. استخدمت العديد من الدراسات حول تنظيفالهباء الجوي ثاني أكسيد الكربون 2 تطهير النيتروجين لزيادة كفاءة إزالة الأغشية الحيوية عن طريق تقليل تكثيف الرطوبة المتولد أثناء التنظيف. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، تم استخدام نفاثات دورية من رذاذ ثاني أكسيد الكربون2 بدون تطهير النيتروجين لإزالة الأغشية الحيوية Pseudomonas putida من أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ المصقولة. الهباء الجويCO2 عبارة عن خليط من ثاني أكسيد الكربونالصلب والغازي 2 ويتم إنشاؤه عندما يتم توسيع غاز ثاني أكسيد الكربون عالي الضغطمن خلال فوهة. تم تطبيق هذه الهباء الجوي عالي السرعة على غشاء حيوي تم نميته لمدة 24 ساعة. تراوحت كفاءة الإزالة من 90.36٪ إلى 98.29٪ وتم تقييمها عن طريق قياس شدة مضان الأغشية الحيوية حيث تراوح وقت المعالجة من 16 ثانية إلى 88 ثانية. أجرينا أيضا تجارب لمقارنة كفاءات الإزالة مع وبدون تطهير النيتروجين. لم تكن كفاءات إزالة الأغشية الحيوية المقاسة مختلفة بشكل كبير عن بعضها البعض (T-Test ، P > 0.55). لذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لتنظيف الأسطح المختلفة الملوثة بيولوجيا في غضون دقيقة واحدة.

المقدمة

الأغشية الحيوية عبارة عن هياكل مجتمعية بكتيرية معقدة يتم فيها تضمين الخلايا البكتيرية داخل مصفوفات منتجة ذاتيا من المواد البوليمرية خارج الخلية ، متماسكة معا ، ومحمية من البيئة الخارجية. يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية خطرا على الصحة العامة وتسبب خسائر اقتصادية لأنها يمكن أن تتشكل على أسطح مختلفة ، بما في ذلك مواد وأجهزة الزرع الطبي ومعدات تجهيز الأغذية والمبادلات الحرارية. في الواقع ، وجد أن الأغشية الحيوية مرتبطة بنسبة 65٪ من جميع الأمراض المعدية البكتيرية لدى البشر ، وفقا لمراكز السيطرة على الأمراض والوقايةمنها 1.

تم استخدام أجهزة التعقيم والمطهرات مثل الكلور بشكل عام لتعطيل الأغشية الحيوية. ومع ذلك ، فإن استخدام الأوتوكلاف محدود للأسطح التي لا يمكنها تحمل البخار بدرجة حرارة عالية ولا يتم وضعها في الأوتوكلاف. المطهرات ليست مناسبة للأسطح الحساسة للمعالجة الكيميائية أو المعرضة لجمع منتجات الأكسدةالسامة 2. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي تعطيل الأغشية الحيوية فحسب ، بل يجب إزالتها أيضا لمنع ارتباط خلايا جديدة بالسطح ، وبالتالي تشكيل غشاء حيويجديد 3. ومع ذلك ، من الصعب إزالة الأغشية الحيوية باستخدام طرق تعتمد على قص السوائل اللزجة لأن سرعة التدفق بالقرب من السطح تكاد تكون صفرا ولا تستطيع قوة القص عادة التغلب على القوى اللاصقة للمواد ذات حجم الميكرون ودون الميكرون. علاوة على ذلك ، من المعروف أن مصفوفة الأغشية الحيوية تعمل كحاجز فيزيائي وكيميائي1.

تم تطوير العديد من التقنيات الفيزيائية والميكانيكية لإزالة الأغشية الحيوية من الأسطح ، بما في ذلك الاهتزاز بالموجات فوق الصوتية1 ، والتيارات الكهربائية4 ، وتشعيع الليزر5 ، وبخاخات الماء عالية الضغط6. كل تقنية لها مزاياها وعيوبها. يمكن استخدام الاهتزاز بالموجات فوق الصوتية والتيار الكهربائي للتحكم في تكوين الأغشية الحيوية. ومع ذلك ، فإنها تتطلب تكوينا معينا وأسطحا موصلة ، على التوالي ، تتطلب إجهاد قص إضافي1 ، 4. يمكن تطبيق تشعيع الليزر على منطقة محدودة وعلى الأسطح الصلبة. ومع ذلك ، تبقى بعض الخلايا الحية والميتة على السطح5. تعمل بخاخات الماء عالية الضغط على إزالة الأغشية الحيوية بشكل فعال ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب زخمها العالي في تلف الركائز الناعمة6.

< p class = 'jove_content'> تم اقتراح إزالة الأغشية الحيوية باستخدام رذاذ ثاني أكسيد الكربون2 سابقا. لقد أظهرت نتائج واعدة ، مع كفاءات إزالة عالية في غضون فترة زمنية قصيرة7-11. يتم إنشاء الهباء الجويCO2 عن طريق التمدد الثابت لغاز ثاني أكسيد الكربون عالي الضغطمن خلال فوهة ، ويتم تطبيقها على الأسطح الملوثة بالغشاء الحيوي. تستخدم تقنية التنظيف هذه نقل الزخم لجزيئات ثاني أكسيد الكربون الصلبة وعمل المذيبات لسوائل ثاني أكسيد الكربونالذائبة 2 ، متبوعة بقوة القص الديناميكية الهوائية لغاز ثاني أكسيد الكربون 2 12. بالمقارنة مع نفاثات الغاز N2 عالية الضغط ، فإن نفاثات الهباء الجوي CO2 عند نفس ضغط الركود أكثر فاعلية في إزالة الإشريكية القولونية الأغشيةالحيوية 7. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن زخم ثاني أكسيد الكربونالصلب 2 الذي يتم توصيله إلى البكتيريا مرتفع إلى حد كبير ، إلا أن زخم نفاثة الهباء الجوي الكلية المطبقة على السطح الصلب أقل بكثير من زخم نفاثات الماء. لذلك ، يمكن التنظيف الخالي من التلف باستخدام تقنية الهباء الجوي CO2.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام نفاثات دورية من رذاذ ثاني أكسيد الكربون2 بدون تطهير النيتروجين لإزالة الأغشية الحيوية Pseudomonas putida من سطح مصقول من الفولاذ المقاوم للصدأ. في الواقع ، تم استخدام تطهير النيتروجين في العديد من دراساتالهباء الجوي لثاني أكسيد الكربون 2 لزيادة كفاءة الإزالة عن طريق تقليل تكثيف الرطوبة المتولد أثناء التنظيف ، على الرغم من اعتماد التسخين باستخدام لوح تسخين أو مصابيح الأشعة تحت الحمراء واستخدام الصناديق الجافة12. يتم وصف تكوين الأغشية الحيوية السطحية وإجراءات التنظيف المحسنة أدناه. تم تقييم كفاءة الإزالة عن طريق قياس شدة مضان الأغشية الحيوية على السطح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد السطح لتشكيل بيوفيلم

  1. قطع 1 ملم سميكة 304 الفولاذ المقاوم للصدأ لوحات في رقائق (10 × 10 مم 2) مع قطع الميكانيكية.
  2. إجراء التنظيف بالموجات فوق الصوتية للرقائق في الأسيتون، والميثانول، ومنزوع الأيونات (DI) بالتتابع الماء لمدة 10 دقيقة لكل منهما. استخدام وعاء مقاوم للمذيب، مصنوعة من مواد مثل الزجاج، لإزالة التلوث العضوي.
  3. شطف رقائق مع المياه المتدفقة DI لمدة 3-5 ثانية.
  4. تجفيف رقائق باستخدام تدفق الغاز N 2 لمدة 3-5 ثانية.

2. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. اتخاذ P. الكريهة KT2440 (تفضلت التي تقدمها البروفيسور سونغ كوك لي، UNIST، كوريا الجنوبية) الأسهم تخزينها في -80 درجة مئوية التجميد العميق.
  2. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة بعد 1 دقيقة، والطبقة العليا من الحل المجمدة الأسهم تتحول إلى طين. تزج حلقة في الطبقة المذابة في المحلول.
  3. استخدام هذه الحلقة إلى خط البكتيريا على لوريا-Bertani (LB) لوحة تحتوي على 1.5٪ أجار.
  4. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية لنمو المستعمرات البكتيرية.
  5. اختيار مستعمرة واحدة من لوحة باستخدام حلقة جديدة.
  6. تطعيم 10 مل من مرق LB في أنبوب مخروطي 50 مل مع حلقة تحتوي على مستعمرة بكتيرية واحدة.
  7. احتضان مرق في حاضنة تهتز لمدة 16 ساعة على 30 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة.

3. تشكيل بيوفيلم على سطح الأرض

  1. التقاط كل من رقائق مستعدة مع ملاقط وتراجع لهم في الايثانول 70٪ 5 مرات لمدة 1-2 ثانية لكل منهما، لتعقيم سطح كل رقاقة. ضمان عقد رقائق مع ملاقط خلال غمس.
  2. تغمس كل شريحة في الماء DI تعقيمها وفي مرق LB بالتتابع، 5 مرات لمدة 1-2 ثانية لكل منهما، لإزالة ما تبقى من الإيثانول.
  3. ضع هذه الرقائق في لوحات ثقافة 6 جيدا مع 2 رقائق و 5 مل مرق LB لكل بئر.
  4. تمييع ثقافة البكتيرية حتى تركيز فى الروافد مرق LB8 × 10 8 خلية / مل (الكثافة البصرية في 600 نانومتر الطول الموجي: ~ 0.8).
  5. تطعيم كل جيدا مع 50 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف.
  6. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة 24 ساعة لتشكيل الأغشية الحيوية.

تنظيف 4. CO 2 الهباء

  1. تراجع رقائق تشكيل بيوفيلم في 10 ملي العازلة خلات الأمونيوم (الطيارة) 5 مرات لإزالة فضفاضة المرفقة والبكتيريا العوالق.
  2. تجف هذه الرقائق في خزانة السلامة البيولوجية، حيث يتدفق الهواء أقل ما يقال.
  3. مباشرة بعد التجفيف، ووضع شريحة على مكان التحميل، والتي هي 20 ملم من فوهة CO 2 على طول محور الطائرة. إمالة محور طائرة إلى زاوية 40 درجة.
  4. ضبط ضغط الركود من CO 2 و N 2 الغاز إلى 5.3 ميجا باسكال و 0.7 ميجا باسكال، على التوالي، وذلك باستخدام المنظمين الغاز الضغط.
  5. تطبيق طائرة الهباء الجوي على الجزء الأوسط من الشريحة. الهباء الجوي البيضاء بما في ذلك ثاني أكسيد الكربون الصلبة يجب 2أن تكون واضحة. تحويل "على" صمام الملف اللولبي لCO 2 لمدة 5 ثوان، ثم تشغيله "قبالة" لمدة 3 ثانية (دورة: 8 ثانية) بشكل دوري باستخدام مفتاح التحكم يدويا. إذا كان يحتاج تطهير النيتروجين لاستخدامها، تشغيل صمام الملف اللولبي لإمدادات مستمرة من N 2.
  6. علاج رقائق مع CO 2 الهباء الجوي لمدة 16، 40، و 88 ثانية مع وبدون عمليات التطهير النيتروجين. الإبقاء على رقائق من دون علاج والضوابط السلبية.

5. تحليل لكفاءة إزالة

  1. إعداد 1 ميكرومتر الأخضر مضان نوكليك وصمة عار حمض (الطول الموجي الإثارة / الانبعاثات: 480/500 نانومتر) في الماء DI إلى وصمة عار الخلايا البكتيرية على السيطرة ورقائق المعالجة الهباء الجوي.
  2. وضع رقائق في حل تلطيخ.
  3. احتضان رقائق في حاضنة دون ضوء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. بعد الحضانة، وشطف بلطف رقائق مع المياه المتدفقة DI لإزالة صبغة الفلورسنت المفرط.
  5. تجفيف واي رقائقال تدفق الغاز N 2.
  6. خذ مضان الصور المجهرية من 5 حقول عشوائية من عرض (321 × 240 ميكرون 2) لكل شرائح باستخدام مجهر epifluorescence، و40X عدسة الهدف، وكاميرا CCD.
  7. الحصول على كثافة مضان لكل صورة باستخدام برامج معالجة الصور مثل يماغيج. في ImageJ، استخدم وظيفة "خلفية طرح" في القائمة "عملية"، وحدد "كثافة المتكاملة" في إطار "تعيين القياسات" في قائمة "تحليل". قيام "القياس" في قائمة "تحليل" للحصول على كثافة مضان.
  8. حساب كفاءة إزالة بيوفيلم وفقا للمعادلة التالية: 100٪ × (أنا من رقائق التحكم - أنا من رقائق المعالجة) / (الأول من رقائق التحكم)، حيث I هي شدة مضان محسوبة.
  9. الحصول على كفاءات إزالة والانحرافات المعيارية المتوسط. استخدام فيأقل 4 رقائق لكل حالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمت CO 2 الهباء الجوي لإزالة P. الكريهة الأغشية الحيوية من SUS304 السطوح (الشكل 1). غطيت معظم الأسطح مع بيوفيلم بعد 24 ساعة من النمو. تمت إزالة معظم بيوفيلم باستخدام CO 2 الهباء الجوي (الشكل 2). كما هو متوقع، ويبين الشكل 3 زيادة في كفاءة إزالة بيوفيلم كوقت العلاج الهباء الجوي CO 2 زيادة. للمرة علاج 88 ثانية، تم تحديد كفاءة إزالة إلى أن تصل إلى 97.74٪ و 98.29٪ مع وبدون تطهير النيتروجين،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في السابق ، أجرينا دراسات تحسين على ثاني أكسيد الكربون2 ضغط الغاز ، وزاوية النفاث ، والمسافة إلى السطح الصلب في ثاني أكسيد الكربون2 تنظيف الهباء الجوي7. على عكس دراساتنا السابقة ، في هذه الدراسة ، لم يتم تضمين تطهير النيتروجين في الهباء الجوي (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تم استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ 304 في هذا البروتوكول ، لأنه أحد أكثر أنواع الفولاذ المقاوم للصدأ شيوعا ويستخدم على نطاق واسع في صناعة المواد الغذائية. السطح المصقول مفيد لتحليل التألق بسبب البعد البؤري ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (# 2015R1A2A2A01006446).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
304 الفولاذ المقاوم للصدأSteelni
(كوريا الجنوبية)		مصقول ومكعبات
منظف بالموجات فوق الصوتيةبرانسون
(الولايات المتحدة الأمريكية)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton و Dickinson and Company
(الولايات المتحدة الأمريكية)		244620500 جم
AgarBecton و Dickinson and Company
(الولايات المتحدة الأمريكية)		214010500 جم
6 آبار لوحة ثقافةSPL علوم الحياة
(كوريا الجنوبية)		32006
عازلة أسيتات الأمونيومSigma-Aldrich
(الولايات المتحدة الأمريكية)		667404 10ملي مولار
وحدة غاز مزدوجةتقنيات السطح التطبيقية
(الولايات المتحدة الأمريكية)		K6-10DGفوهة واحدة لغاز ثاني أكسيد الكربون 2< / sub >
و 8 فوهات لغاز N 2< / sub>
SYTO9Thermo Fissher Scientific
(الولايات المتحدة الأمريكية)		InvitrogenExcitaion: 480 نانومتر
الانبعاث: 500 نانومتر
مجهر التألق  نيكون (اليابان)Eclipse 80i
40X عدسة موضوعيةNikon
(اليابان)		خطة فلورNA: 0.75
CCD camera القياسات الضوئية
(الولايات المتحدة الأمريكية)		SNAP HQ2أحادي اللون
رائع

المراجع

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بكتيريا الزائفة المتألقة (Pseudomonas Putida)أسطح الفولاذ المقاوم للصدأالمجهر الفلوريوقت المعالجة بالرذاذكفاءة الإزالةالتنظيف ثلاثي المراحلالأسطح الملوثة بيولوجياً
إزالة بيوفيلم عن طريق بخاخات ثاني أكسيد الكربون دون النيتروجين تطهير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.