يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس تفاضلي مميثل

5.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

ديسمبر 21, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

جزيرة β موت الخلايا يسبق تطور مرض السكري من النوع 1 ، وقد يسمح اكتشاف هذه العملية بالتدخل العلاجي المبكر. هنا ، نقدم وصفا مفصلا لكيفية قياس أنواع الحمض النووي INS الميثيل تفاضليا في المصل البشري كمؤشر حيوي لموت الخلايا β.

الملخص

يعتقد أن موت خلايا β الجزيرة يكمن وراء التسبب في جميع أشكال مرض السكري تقريبا ويسبق تطور فرط السكر في الدم الصريح ، خاصة في مرض السكري من النوع 1. قد يسمح تطوير المؤشرات الحيوية الحساسة والموثوقة لموت الخلايا β بالتدخل العلاجي المبكر لمنع أو تأخير تطور مرض السكري. في الآونة الأخيرة ، أفادت العديد من المجموعات بما في ذلك مجموعتنا أن الحمض النووي الخالي من الخلايا والميثيل تفاضليا الذي يشفر بريبروأنسولين (INS) في الدورة الدموية يرتبط بموت الخلايا β في مرض السكري من النوع 1 ومرض السكري من النوع 1 الجديد. هنا ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لقياس الحمض النووي INS الخالي من الخلايا والذي يتم ميثله تفاضليا عند السيتوزين عند الموضع -69 نقطة أساس (بالنسبة لموقع بدء النسخ). نوضح أن الاختبار يمكن أن يميز بين السيتوزين الميثيلي وغير الميثيل في الموضع -69 نقطة أساس ، وهو خطي عبر عدة أوامر من حيث الحجم ، ويوفر الكمية المطلقة لأرقام نسخ الحمض النووي ، ويمكن تطبيقه على عينات من المصل البشري من الأفراد المصابين بداء السكري من النوع 1 الجديد والضوابط الخالية من الأمراض. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا مع أي نوع من أنواع الحمض النووي التي يرغب فيها اكتشاف السيتوزينات الميثيلية تفاضلية ، سواء من الدورة الدموية أو من الخلايا والأنسجة المعزولة ، ويمكن أن يوفر التقدير الكمي المطلق لشظايا الحمض النووي.

المقدمة

مرض السكري نوع 1 (T1D) هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يتميز بها تدمير جزيرة المنتجة للانسولين β الخلايا عن طريق خلايا autoreactive تي 1. وعادة ما يتم التشخيص من T1D على قياس (الجلوكوز في الدم> 200 ملغ / دل) ارتفاع السكر في الدم في العجاف، فرد الشاب، الذي قد يقدم مع الحماض الكيتوني كدليل على نقص الأنسولين. في وقت التشخيص من T1D، وهناك أدلة لخسارة كبيرة في وظيفة خلايا β وكتلة (50-90٪) 2. في الدراسات السريرية، تبين أن العديد من الأدوية تغييري المناعة التي أقيمت في وقت التشخيص في تحقيق الاستقرار في وظيفة خلايا β (ويفترض الكتلة)، ولكن لا شيء قد أسفرت عن مغفرة السريرية للمرض، وهو الاكتشاف الذي أثار الدعوة إلى تطوير المؤشرات الحيوية للكشف في وقت سابق من هذا المرض وتتبع طولية من فعالية مجموعة من العلاجات 3،4. الجهود التي تبذلها اتحادات دولية، مثل هذاق كونسورتيوم شبكة البحوث جزيرة البشرية التابع للمعاهد الوطنية للهيث 5، وشدد على ضرورة تطوير المؤشرات الحيوية التي تركز على الإجهاد خلية بيتا والموت في T1D.

وتماشيا مع هذه الجهود، لدينا مجموعة والبعض الآخر قد وضعت مؤخرا فحوصات العلامات البيولوجية التي تقيس المتداولة، شظايا الحمض النووي تعديل epigenetically التي تنشأ في المقام الأول من الموت خلايا β 6-9. في جميع المقايسات التي نشرت حتى الآن، كان التركيز على الكميات من الجين البشري ترميز سلف طليعة الأنسولين (INS)، والذي يدل على درجة أكبر من المواقع الدليل السياسي الشامل unmethylated في المناطق الترميز والمروج مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا. كان الافتراض تحرير unmethylated شظايا الحمض النووي INS كما تنشأ أساسا من الموت (نخرية، أفكارك) خلايا β. وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن في الشباب، والارتفاعات في كل unmethylated والميثيلي والحمض النووي INS في موقف -69 سنة مضت (نسبة إلى Tانه النسخي بدء الموقع) لوحظت في الظهور الجديد T1D، وجنبا إلى جنب خدم المؤشرات الحيوية محددة لهذه الفئة من السكان 6. هذه المقايسات العلامات البيولوجية تنطوي على عزل الحمض النووي خالية من الخلايا من المصل أو البلازما باستخدام مجموعات تدور التجارية، تليها تحويل بيسلفيت لعزل الحمض النووي (لتحويل cytosines غير ميثليته إلى uracils، وترك cytosines ميثليته سليمة).

في هذا التقرير، وصفنا الجوانب التقنية لجمع عينة الدم، وعزل الحمض النووي خالية من الخلايا من الدم، وتحويل بيسلفيت، وأداء PCR الرقمي بالقطيرات (من الآن فصاعدا، PCR الرقمي) لميثليته تفاضلي INS الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات: تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة إنديانا. قدم آباء الأشخاص موافقة خطية مستنيرة ، وقدم الأطفال الذين تزيد أعمارهم عن 7 سنوات الموافقة على مشاركتهم.

< p class = "jove_title" >1. معالجة المصل

ملاحظة: تم اختبار الاختبار كما هو موضح بدقة باستخدام مصل بشري معزول على النحو التالي.

  1. اجمع الدم في أنبوب جمع الدم الأحمر (بدون إضافات؛ غير مغطى).
  2. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للجلطة بالتكون.
  3. أنبوب الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الطافية (المصل) إلى أنبوب جديد مخصص لتخزين المصل (أنابيب علوية لولبية من مادة البولي بروبلين ، يعتمد الحجم على العينات).
  4. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لعزل الحمض النووي.
< p class = "jove_title" >2. استخراج الحمض النووي في المصل

ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي باستخدام 50 ميكرولتر من المصل (موصى به) ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات.

  1. قم بإعداد 200 ميكرولتر من محلول التحلل + 1 ميكرولتر بولي (A) (5 ميكروجرام) لكل عينة في أنبوب طرد مركزي دقيق. دوامة لمدة 15 ثانية. توضع جانبا حتى الخطوة 2.3.
  2. خذ عينات مصل من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. رفع حجم عينة المصل إلى 200 ميكرولتر إجمالا باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم).
  3. قم بتحليل العينة عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من البروتياز (1.4 وحدة أنسون / مل) إلى العينة ، متبوعا بمزيج 200 ميكرولتر من التحلل / مزيج polyA (من الخطوة 2.2) والدوامة لمدة 8 ثوان. احتضان العينة عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 7 ثوان بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق (>10,000 × جم).
  4. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 230 ميكرولتر 100٪ من الإيثانول إلى العينة والدوامة لمدة 8 ثوان>.
  5. قم بتطبيق الحمض النووي على عمود الدوران عن طريق إضافة خليط عينة 600 ميكرولتر إلى عمود الدوران الصغير. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من التدفق وضع العمود في أنبوب نظيف.
  6. اغسل الحمض النووي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1 إلى العمود. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تخلص من التدفق وضع العمود في أنبوب نظيف. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 إلى العمود وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة (>10,000 × جم) لمدة 3 دقائق. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة مرة أخرى لمدة 1 دقيقة.
  7. قم بإزالة الحمض النووي عن طريق وضع عمود في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل وإضافة مخزن مؤقت للشطف سعة 60 ميكرولتر مباشرة على الفلتر. من المهم تبديل النصائح بين العينات لمنع التلوث المتبادل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة 1 دقيقة. أضف 60 ميكرولتر أخرى من محلول الشطف وجهاز الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة دقيقة واحدة.
  8. قم بتخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا ، أو انتقل على الفور إلى تحويل ثنائي الكبريتيت.
< p class = "jove_title" >3. تحويل ثنائي الكبريتيت

ملاحظة: يتم إجراء تحويل ثنائي الكبريتيت باستخدام مجموعة تحويل ثنائي الكبريتيت ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة مع بعض التعديلات.

  1. لتحويل السيتوزين غير الميثيل إلى يوراسيل ، أضف 130 ميكرولتر من كاشف تحويل ثنائي الكبريتيت إلى 20 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 2.7 في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (أنبوب PCR واحد 0.2 مل أو أنابيب PCR ذات 8 شرائط). احفظ 40 ميكرولتر المتبقية من الحمض النووي لاستخدامها في المستقبل ، أو استخدمها في التفاعلات المكررة. امزج 20 مرة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة للتأكد من عدم وجود قطرات على الجوانب أو الغطاء. احتضن في حمام مائي أو جهاز تدوير حراري على النحو التالي: 98 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، 54 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. انتقل إلى الخطوة 3.2 أو قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 20 ساعة.
  2. أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى عمود الدوران وضع العمود في أنبوب التجميع المقدم. ضع الحمض النووي ثنائي الكبريتات على العمود واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (>10,000 × جم) لمدة 30 ثانية.
  3. اغسل الحمض النووي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى العمود وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة (>10,000 × جم) لمدة 30 ثانية.
  4. قم بإجراء إزالة الكبريت لإزالة مجموعة الكبريتات لإنهاء تحويل السيتوزين غير الميثيل إلى اليوراسيل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة الكبريتونات إلى العمود. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة (>10,000 × جم) لمدة 30 ثانية.
  5. اغسل الحمض النووي عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى العمود وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
  6. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بإزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف مباشرة إلى مرشح العمود. احتضن لمدة 1 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة لتصفية الحمض النووي. تحديد كمية الحمض النووي المستعاد عن طريق قياس الطيف الضوئي عند A260.
    ملاحظة: يمثل الحمض النووي الذي تم اكتشافه بواسطة قياس الطيف الضوئي في المقام الأول الحمض النووي الحامل polyA الذي تمت إضافته في الخطوة 2.3 أعلاه. عادة ما يكون استرداد polyA ≥85٪ من المدخلات (>4.25 ميكروغرام).
  7. قم بتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للمضي قدما في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي.
فئة

4. PCR رقمي متعدد الإرسال

  1. اصنع مزيجا رئيسيا مع حل كاف لكل عينة وتحكم. قم بتضمين عينة واحدة على الأقل تحتوي على الماء (تحكم سلبي) ، وعينة واحدة من البلازميد الذي يحتوي على INS غير ميثيل (1 بيكوغرام ، تحكم إيجابي) ، وعينة واحدة من البلازميد المحتوي على INS الميثيلي (1 بيكوغرام ، تحكم إيجابي) ، وعينة واحدة تحتوي على خليط 1: 1 من البلازميدات.
    1. لتحضير المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 12.5 ميكرولتر لكل تفاعل من المخزن المؤقت PCR (على سبيل المثال ، 125 ميكرولتر لكل 10 عينات) ، 1.25 ميكرولتر لكل تفاعل تمهيدي / مزيج مسبار (على سبيل المثال ، 12.5 ميكرولتر لكل 10 عينات) ، 8.25 ميكرولتر لكل ماء تفاعل (على سبيل المثال ، 82.5 ميكرولتر لكل 10 عينات) ، 0.5 ميكرولتر لكل تفاعل إنزيم EcoR1 (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر لكل 10 عينات).
      ملاحظة: البادئات والمجسات المستخدمة هنا هي كما يلي: التمهيدي الأمامي: 5'-GGAAATTGTTTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'; التمهيدي العكسي: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3 '; مسبار AM: FAM-5'-ACCCCTACCTAAC-3'-MGB; مسبار مركز فيينا الدولي: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. قم بإعداد تفاعل PCR متعدد الإرسال في لوحة 96 بئرا. أضف 19.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر. أضف 2.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المحولة من ثنائي الكبريتيت إلى كل بئر مناسب (احفظ 7.5 ميكرولتر المتبقية من الحمض النووي المحول للثنائي كبريتيت أو استخدمه في التفاعلات المكررة). تخلط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع الآبار الثمانية على التوالي على عينة أو تحكم عازل.
  3. ختم بختم رقائق معدنية باستخدام مانع تسرب الألواح وجهاز طرد مركزي في دوار اللوحة حتى لا يكون هناك سائل على جوانب الآبار.
  4. قم بإعداد مولد القطرات الآلي على شاشة اللمس.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع الآبار الثمانية في الخرطوشة على عينة أو تحكم في المخزن المؤقت.
    1. اضبط عدد الصفوف المستخدمة عن طريق لمس الصف (الصفوف) التي يتم فيها تحميل العينات على اللوحة المكونة من 96 بئرا من الخطوة 4.2 وقم بتمييز الصف باللون الأزرق للإشارة إلى صف نشط.
    2. قم بتحميل المواد الاستهلاكية من الخلف إلى الأمام لتجنب التلوث. للبدء ، أضف خراطيش على طول الصف الخلفي من الجهاز. قم بتحميل النصائح في الصف الأوسط من الأداة.
      ملاحظة: يمكن أن تتناسب الخراطيش مع الحوامل في الاتجاه الصحيح فقط.
    3. ضع لوحة 96 بئر في الجهاز. قم بإزالة كتلة باردة من الفريزر -20 درجة مئوية وضع لوح جديد 96 بئرا فيه. ضعه داخل الجهاز بجوار اللوحة المحملة بعينة 96 بئر.
    4. أضف الزيت إلى الموزع في مقدمة الجهاز. حدد نوع الزيت على شاشة اللمس.
    5. المس زر البدء الأزرق لبدء الجري. قم بتأكيد إعداد اللوحة والمس زر بدء التشغيل للبدء.
  5. بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة اللوحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على القطرات المشكلة حديثا وأغلقها بختم رقائق معدنية باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح.
  6. قم بإجراء PCR10 على جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10:00 دقيقة ؛ 40 دورة عند: 94 درجة مئوية لمدة 00:30 دقيقة ، 57.5 درجة مئوية لمدة 01:00 دقيقة ؛ 98 درجة مئوية لمدة 10:00 دقيقة ؛ 12 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى 24 ساعة.
  7. ضع اللوحة على قارئ القطرات وقم بإعداد القارئ.
    1. انقر فوق علامة تبويب الإعداد. افتح قالبا جديدا بالنقر فوق قالب > جديد. أدخل اسم ملف.
    2. استخدم محرر البئر لتعيين المعلمات لكل عينة. امنح كل عينة اسما فريدا، واضبط التجربة على اكتشاف الأحداث النادرة (R-RED)، واضبط المزيج الرئيسي على المزيج المستخدم في الخطوة 4.1.
    3. أعط الهدف 1 اسما (أي غير ميثيلي) وحدد الغاية 1 على أنها غير معروفة (U). أعط الغاية 2 اسما (أي ميثيلية) وحدد الغاية 2 كمرجع (R).
    4. انقر فوق علامة التبويب "تشغيل" لبدء التشغيل. في نافذة خيارات التشغيل، حدد كيمياء الكشف (FAM/VIC).
< p class = "jove_title" >5. تحليل البيانات

  1. افتح النتائج في علامة تبويب التحليل وقم بالتحليل باستخدام مخطط ثنائي الأبعاد بناء على عناصر التحكم الإيجابية (انظر الشكل 1).
  2. تصدير ملف CSV الذي تم إنشاؤه بواسطة Droplet Reader إلى برنامج جداول بيانات لتحليل البيانات.
  3. لتوليد "نسخ لكل ميكرولتر" من المصل ، استخدم الصيغة: (التركيز * 250) / (حجم المصل المستخدم لعزل الحمض النووي بالميكرولتر). 6
    ملاحظة: عادة ما يتم تحويل البيانات إلى log10 عند الحصول عليها من المصل البشري لضمان التوزيع الطبيعي. بدلا من ذلك ، يمكن رسم البيانات على مقياس log10 وتحليلها بواسطة إحصائيات غير معلمية.
< نوع النمط = "text / css" >p.p1 {الهامش: 0.0 بكسل 0.0 بكسل 0.0 بكسل 0.0 بكسل ؛ الخط: 16.0 بكسل 'Times New Roman'} span.s1 {الخط: 16.0 بكسل Calibri}

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتفسير البيانات بشكل مناسب، ونحن نستخدم الضوابط البلازميد لكل من الهدف INS الحمض النووي unmethylated والميثيلي في كل شوط PCR الرقمي. هذه الضوابط تضمن إشارات الموافق الحمض النووي الميثيلي وunmethylated يمكن تمييزها بوضوح. ويبين الشكل 1 المؤامرات مبعثر 2-D الموافق قطرات للضوابط تحتوي على البلازميد تحويلها بيسلفيت unmethylated INS الحمض النووي (الشكل 1A)، الميثيلي INS الحمض النووي (ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مثيلة من cytosines التي كتبها ميثيل الحمض النووي يسمح لمراقبة جينية من النسخ في العديد من الجينات. وأعرب عن الجين INS في البشر على وجه الحصر تقريبا في جزيرة β خلايا، ويبدو أن هناك علاقة بين وتيرة مثيلة من cytosines في الجين INS لإسكات من النسخ في 11. على هذا النحو، فإن معظم أنواع الخلايا تظهر ترددات أعلى بكثير من مثيلة من الجين INS في cytosines مختلف مقارنة بيتا خلايا 11-13. وقد اقترح أن انتشار موت الخلايا بيتا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة UC4 DK104166 (إلى RGM). نود أن نعرب عن تقديرنا للمساعدة التي قدمها مركز أبحاث السكري في إنديانا للترجمة الأساسية المدعومة من منحة المعاهد الوطنية للصحة P30 DK097512.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المكنسة الكهربائية الحمراء العلوية Beckon Dickinson366441بدون مادة مضافة ، داخلية غير مطلية ، 10 مل
من Cryovial TubeSimportT310-3Aمن البولي بروبيلين ، أنبوب غطاء لولبي ، أي حجم
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly (A)SigmaP9403غير محبوب في TE المؤقت (10 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 8.0 + 1 ملي مولار EDTA) إلى 5 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ l 
الإيثانول المطلق (200 برهان) فيشرScientificBP2818-500
DPBS (مع CaCl 2< / sub > و MgCl 2< / sub>)SigmaD8662
0.2 مل PCR 8 شرائطأنابيب MidSciAVST
8 شرائط ، DomeMidSciAVSTC-N
EZ DNA مثيلة البرق KitZymoD5031
ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP)Biorad1863024
التحكم في العازلة للمجساتBiorad1863052
البشري غير الميثيل / الميثيل التمهيدي / مزيج المسبارLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96 ،Eppendorf951020346
ثقب احباط ختم الحرارةBiorad1814040
PX1 PCR لوحة السدادةBiorad1814000
QX200 AutoDG Droplet نظام PCR الرقميBiorad1864101
زيت توليد القطرات الآلي للمجساتBiorad186-4110
DG32 خرطوشة لمولد القطرات الآليBiorad186-4108
نصائح ماصة لمولد القطرات الآليBiorad186-4120
صناديق تلميح الماصة لمولد القطرات الآليBiorad186-4125
C1000 Touch Thermal CyclerBiorad1851197
QX200 قارئ قطراتBiorad186-4003
ddPCR Droplet Reader OilBiorad186-3004
شبه التنورة

المراجع

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحمض النووي الميثيلي المتمايزتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقميموت خلايا بيتاتحويل البيسلفيتالحمض النووي لبروبروإنسولينداء السكري من النوع الأولالتكميم المطلقالحمض النووي الخالي من الخلاياميثيلي غير ميثيلي
قياس تفاضلي مميثل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.