نماذج ما قبل السريرية تقييم العلاج المساعد استهداف ورم خبيث سرطان الثدي تفتقر. لمعالجة هذا، قمنا بتطوير نموذج الفئران من دي نوفو الرئوي الانبثاث غدي الثديية، حيث العلاجات التي تدار في وضع مساعد (بعد استئصال الجراحي للأورام الأولية) يمكن تقييمها لفعالية في التأثير الانبثاث الرئوي المصنف سابقا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية دي نوفو سرطان الثديي الانبثاث
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أحد الجوانب التي تحد من المعدل لنماذج الفئران المعدلة وراثيا لسرطان الثدي الغدي هو أن عبء الورم الأساسي في أنسجة الثدي يحدد عادة نقاط نهاية الدراسة. وبالتالي ، فإن الدراسات التي تركز على توضيح آليات ورم خبيث من جديد في المرحلة المتأخرة تتعرض للخطر ، وكذلك الدراسات التي تدرس فعالية العلاجات المضادة للسرطان التي تستهدف وسطاء ورم خبيث في البيئة المساعدة. تم تطوير العديد من نماذج سرطان الثدي في الفئران من خلال التعبير المستهدف عن البروتينات الورمية السائدة للخلايا الظهارية للثدي ، مما ينتج عنه نماذج تحاكي بشكل مختلف الأنواع الفرعية لسرطان الثدي النسيجي المرضي والمحدد بالنسخ الشائعة في النساء < فئة الدعم = 'xref'>1. في حين تم تعلم الكثير فيما يتعلق ببيولوجيا تسرطن الثدي مع هذه النماذج ، فإن فائدتها في تحديد الجزيئات التي تنظم نمو ورم خبيث في المرحلة المتأخرة تتعرض للخطر حيث يتم قتل الفئران عادة في نقاط زمنية مبكرة بسبب عبء الورم الأولي الكبير. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نسبة كبيرة من النساء المصابات بسرطان الثدي يتلقين علاجا مساعدا بعد الاستئصال الجراحي للأورام الأولية وقبل وجود مرض نقيلي يمكن اكتشافه ، فإن هناك حاجة ماسة إلى نماذج قبل السريرية للورم الخبيث من جديد كمنصات لتقييم العلاجات الجديدة التي تهدف إلى استهداف البؤر النقيلية. لمعالجة أوجه القصور هذه ، قمنا بتطوير نموذج الفئران للورم الخبيث لسرطان الثدي من جديد ، حيث يتم استئصال أورام الثدي الأولية جراحيا ، وتتطور البؤر النقيلية لاحقا على مدى 115 يوما بعد الجراحة. يوفر هذا الكمون الطويل نموذجا قابلا للتتبع لتحديد المنظمين المهمين وظيفيا للتطور النقيلي في الفئران التي تفتقر إلى الورم الأولي ، بالإضافة إلى نموذج لتقييم الفعالية العلاجية قبل السريرية للعوامل التي تهدف إلى منع الجزيئات المهمة وظيفيا التي تساعد على بقاء الورم النقيلي ونموه.
المقدمة
النساء في أمريكا الشمالية لديهم خطر عمر٪ 12 ~ لتطوير سرطان الثدي 2 ؛ فإن الغالبية العظمى من هؤلاء الأفراد سوف يكون الأورام الأولية إزالتها عن طريق الجراحة، واعتمادا على نوع فرعي السرطان، وبعد ذلك تلقي المستهدفة والغدد الصماء، تشيمو و / أو العلاج الإشعاعي في إعداد مساعد 3 . ومن الأمثلة على ذلك، النساء المشخصات بسرطانات إيجابية مستقبلات هرمون تلقي علاجات مضادة للإستروجين والنساء مع الأورام HER2 إيجابية تلقي العلاجات المستهدفة HER2 مع الإشعاع / العلاج الكيميائي، في حين لا توجد علاجات المستهدفة متوفرة حتى الآن للأورام السالبة الثلاثي 3 . على الرغم من التقدم في العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي والعلاجات الشخصية المعتمدة على الهرمونات التي تكمل الاستئصال الجراحي، يتكرر المرض في 30-70٪ من النساء المشخصات مع المرحلة الثانية أو الثالثة المرض 4 ، والعلاج غير فعالة إلى حد كبير في القضاء على المرض النقيلي في الأعضاء البعيدة، بما في ذلك الرئة، العظام، bالمطر و / أو الكبد 5 . وهذا أمر مهم بشكل خاص نظرا لأنه عندما يحدث المرض النقيلي في غياب نمو الورم الأولي، وهذا يعني أن الخلايا الخبيثة نشرها من المرجح أن تكون موجودة بالفعل في الأعضاء الثانوية في وقت الجراحة النهائية. وبالتالي هناك حاجة ملحة للعلاجات القادرة على استئصال أو بطء نمو الأورام النقيلي.
في حين أن نماذج دي نوفو الماوس من مسرطنة الثديية كانت مفيدة بشكل ملحوظ في الكشف عن آليات تنظيم تطور الورم 1 ، النماذج الموجودة لديها أيضا العديد من القيود. واحدة من هذه هي أن النماذج المعدلة وراثيا دي نوفو عادة تطوير الأورام الأولية في الغدد الثديية متعددة، حيث عبء الورم الأساسي يحد من مدة الدراسات. في حين أن هروب الخلايا السرطانية الأولية والبذر المنتشر من المحتمل أن يحدث في وقت مبكر في تطور الورم في هذه النماذج، والتنمية الصريحة للأورام النقيلي يحدث في وقت متأخر، واعتماد سن نموذج الفأر وخلفية سلالة، وغالبا ما اختراق جزئيا 1 . وهذا يزيد من الحد من فائدة نماذج دي نوفو لاكتشاف الجزيئات التي تنظم الانبثاث في الأعضاء الثانوية، وتقييم الفعالية قبل السريرية من العلاجات في إعداد مساعد.
للتحايل على هذه القيود، قمنا بتطوير نموذج جديد دي نوفو من ورم خبيث سرطان الثدي إلى الرئتين. الوراثة المعدلة وراثيا الإناث ( أي متف-بيمت على خلفية ففب / ن سلالة للدراسات الموصوفة هنا) التي تحمل أواخر مرحلة دي نوفو الأورام الثديية تتراوح أعمارهم بين ~ 100 أيام 6 ، وعند هذه النقطة يتم استئصال أورامها الأولية جراحيا وانفصل إنزيميا إلى تعليق خلية واحدة. يتم تعليق تعليق (1 × 10 6 خلايا) بدورها أورثوتوبيكالي في 6-7 أسبوع المستلم الفئران الإناث المتجانسة، حيث تتطور الأورام الثديية الأولية واحدة على مدى فترة 38 إلى 60 يوما ( الشكل 1A). في حجم الورم المحدد (172 إلى 450 مم 3 )، يتم تخدير الفئران المتلقي والأورام الأولية يتم استئصالها جراحيا بحيث يتم تصغير نمو الورم في الموقع الجراحي، بما يتفق مع الجراحة في النساء ( الشكل التكميلي 1 ). على خلفية ففب / ن سلالة، الفئران تطوير نسيجيا البؤر النقيلي في الرئتين مع 45٪ اختراق من قبل ~ 115 يوما بعد الجراحة ( الشكل 1B ). مع هذا الكمون ممتدة من نمو الورم النقيلي، ويتم وضع نموذج فريد لتقديم العلاج المساعد، ولتوضيح وتقييم البيولوجيا الأساسية التي تؤثر على التقدم النقيلي بعد الاستئصال الجراحي للأورام الأولية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتغطي الحيوانات المستخدمة في البروتوكول التالي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة ولاية أوريغون للعلوم (إاكوك)، والتي تم تصميمها لتكون متوافقة مع لوائح قانون رعاية الحيوان وخدمة الصحة العامة (فس) السياسة.
صيانة الظروف المعقمة: يجب أن تستخدم أدوات معقمة وبين الفئران، وينبغي أن تمحى نظيفة بشاش معقم، وتشطف في برنامج تلفزيوني تليها التعقيم مع مطهر الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل. يجب ارتداء قبعة الجراحية، قناع الوجه، ثوب، والقفازات للعمليات الجراحية البقاء على قيد الحياة. يتم تضمين إعداد قبل الجراحة للحيوان لعمليات الجراحة في البروتوكول التالي. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة من الكواشف والمعدات.
1. عزل وتحضير تعليق خلية واحدة من الأورام الثديية الأولية
- تخدير الإناث المانحة 100 يوم المعدلة وراثيا متف-بيمت (ففب / ن) الفئران والحفاظ على تحت جالتخدير الشاذ عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير. تأكد من أن الماوس تخدير بشكل صحيح مع غائبة منعكس القدم قرصة.
- في وضع معقمة، استئصال الأورام الثديية الأولية من 100 سنة من العمر المعدلة وراثيا الإناث متف-بيمت (ففب / ن) الفئران عن طريق فصل الورم الثديي من المغطي الجلد والمحيطة الأنسجة الدهنية و / أو العقد الليمفاوية باستخدام مقص العقيمة. الموت ببطء الفئران تخدير عن طريق خلع عنق الرحم.
- مع مقص العقيمة أو مشرط، اللحم المفروم الأورام الأولية يدويا إلى قطع صغيرة (~ 1.0 مم 3 ). مكان قطع الورم في 3.0 ملغ / مل كولاجيناز A و 4.0 U / مل دناز أنا حل في دمم. استخدام ~ 10 مل من المتوسطة الهضم أعلاه لكل 1.0 سم ورم القطر.
- أداء عملية الهضم في زجاجة معقمة 25 مل مع شريط ضجة معقمة في ~ 125 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- وقف الهضم عن طريق إضافة مصل الأبقار الجنين (فبس) إلى التخفيف النهائي من 10٪ ووضع الخليط بأكمله على wو الجليد حيث يتم الحفاظ عليه.
- تصفية تعليق الورم هضمها من خلال مصفاة النايلون 0.7 ميكرون في أنبوب مخروطي 50 مل وتجاهل أي ورم المتبقية في مصفاة. الطرد المركزي طاف في 300 x ج في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند بيليه في 10 مل دمم لكل 1.0 سم الورم وإعادة تصفية من خلال مصفاة النايلون 0.7 ميكرون. عد تركيز الخلية، ثم الطرد المركزي في 300 x ج في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند بيليه في 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل مع 90٪ فبس في تركيز 2 × 10 7 خلايا حية / مل. تخزين تعليق خلية واحدة من الورم الرئيسي كله في -80 درجة مئوية.
2. أورثوتوبيك حقن الورم الثديي
- جزئيا ذوبان الجليد المجمدة تعليق الورم الأساسي عند 37 درجة مئوية حتى يمكن تحريرها بيليه المجمدة من أنبوب المبردة إلى 20 مل دمم وعد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج في 4 درجات مئوية و ريسوسبيند الخلايا في 1: 1 دمم: خفض عامل النمو سولوبيليزد الطابق السفلي غشاء إعداد البريدشتراكتد من ساركوما الماوس إنجلبريث-هولم-سرب (إهس) بتركيز 1 × 10 7 خلية / مل (انظر جدول المواد ).
- وضع المستلقي تخدير الإناث سينجينيك الماوس بطني الجانب حتى والحفاظ على تحت التخدير المستمر عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير.
- تعقيم الحق 4 الغدة الثديية موقع الحقن باستخدام الهباء 70٪ من الإيثانول وتطبيق بولي (فينيلبيروليدون) -Iodine مع مسحة القطن العقيمة.
- حقن 100 ميكرولتر (1 × 10 6 خلايا حية من المجمدة تعليق الورم الأساسي) شطبة الجانب حتى في حق غير واضح 4 الغدة الثديية من 6 إلى 10 من العمر الإناث ففب / ن الماوس بعمر باستخدام 29 G 0.3 مل حقن الأنسولين.
3. الاستئصال الجراحي للورم الثديي مثلي
- 38-60 أيام التالية حقن الخلايا السرطانية، الموت ببطء الفئران لا تظهر حجم الورم مثلي تتراوح بين 172 إلى 450 مم 3 في حجم [طول × (عرض 2 ) / 2] (حوالي 75٪ من الفئران المحقونة).
- وضع الفئران تخدير عرض حجم الورم المناسب بطني الجانب حتى تحت التخدير المستمر عن طريق إعطاء 2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع التخدير وتأكيد الماوس تخدير صحيح مع غائبة القدم قرصة المنعكس. تطبيق طبيب بيطري مرهم للعيون للوقاية من جفاف بينما تحت التخدير.
- رش 70٪ من الإيثانول لتعقيم المنطقة الجراحية المحيطة الورم الرئيسي، ثم تطبيق بولي (فينيلبيروليدون) -Iodine مع مسحة القطن العقيمة.
ملاحظة: إزالة الشعر في الموقع الجراحي أسفرت عن إكسكورياتيونس الجلد و / أو العدوى ل ~ 5٪ الفئران وبالتالي تم استبعادها من هذه الخطوة (لا تظهر البيانات). - كما هو مبين في الشكل 1C ، وجعل شق الجلد الأولي باستخدام مقص حادة الإنسي الذيلية إلى الورم.
- المقبل، وجعل ختان متفوقة من الجلد ( الشكل 1C ) الإنسي إلى الورم. إيلاء الاهتمام للحاجة إلى كيوي أي الأوعية الدموية فيتحرير الورم الموجود على الجلد قبل توسيع شق.
- مواصلة شق الجلد أفقيا (الخلفي إلى الورم)، ثم جعل متفوقة استئصال الجلد (الوحشي إلى ورم)، والختان وسطي (متفوقة على الورم) ( الشكل 1C ).
- بعد أن تم استئصال الجلد كفافي حول الورم ( الشكل 1C )، ورفع الجلد المغطي تعلق على الورم باستخدام ملقط بينما حادة تشريح الورم بعيدا عن عضلات جدار البطن والحفاظ على الغدد الثديية سليمة.
- تحديد (عن طريق تشريح حادة) وكوى السفن الكبيرة من خلال تشغيل ال 4 و 5 تشرين الغدد الثديية.
- المكوس ما يقرب من نصف ال 4 و 5 تشرين الغدد الثديية في موقع الكي لتحرير الورم، المغطي الجلد، وأجزاء من الغدد الثديية (الشكل 1C).
- في حالة النزيف، وتحديد النزيف بنشاطالسفن وعلى الفور كيو لهم. إذا تم فقدان أكثر من 250 ميكرولتر من الدم، واستبعاد الماوس من الدراسة والقتل ببطء عليه.
- إغلاق مواقع الختان مع مقاطع الجرح باستخدام جرح مقطع أبل ( الشكل 1C ).
ملاحظة: إزالة مقاطع الجرح 10 يوما بعد الجراحة مع مزيل كليب الجرح. - إدارة محلول ملحي معقم دافئ تحت الجلد (4٪ من وزن الجسم الحيوان) والحفاظ على الحارة الحيوان مع مصباح الحرارة. تحقق الحيوانات كل 5-10 دقيقة خلال الانتعاش من التخدير.
ملاحظة: إدارة إما بوبيفاكين أو يدوكائين زيادة وفيات ما بعد الجراحة (لا تظهر البيانات). الفئران التي أظهرت علامات الألم (الحنق، غير راغبة في التحرك، وعدم العريس) 1 ساعة بعد الجراحة الموت الرحيم.- مرة واحدة وقد تعافى الماوس تماما، إعادته إلى الشركة من الفئران الأخرى.
4. عزل ومعالجة الدم والرئة لتدفق الخلوي والأنسجة
<رأ>ملاحظة: يتم استخدام الأسهم المجمدة من برومودوكسيوريدين المذاب في غضون 1 شهر بعد التحضير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أكثر من 75٪ من الفئران المتلقية تلقي 1 × 10 6 خلايا من الأورام الثديية الأولية المستمدة من الفئران متف-بيمت، وتطوير أدينوكارسينوماس الثديية واحدة تتراوح في الحجم من 172 إلى 450 مم 3 في غضون 38-60 يوما (لا تظهر البيانات). ثم يتم تسجيل الفئران المؤهلة للحصول على العشوائية في مجموعات الدراسة بعد استئصال الجراحي من الأورام الأولية كما هو مبين ( الشكل 1C ). تم تحديد نمو الورم الرئيسي في أقل من 2٪ من ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه:
عندما تشريح الورم حادة بعيدا عن جدار البطن، قد يبقى الورم ملتصقا جدار البطن. وقد لوحظ هذا في <5٪ من الفئران حقن مع ورم (لا تظهر البيانات). للفئران مع الأورام ملتصقة بجدار البطن، والفأر يجب الموت الرحيم كما استئصال صعبة دون إعادة نمو الورم الرئيسي.
قيود النموذج / التقنية:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي إفصاح عن التضارب مع البيانات المقدمة هنا.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جو هيل للمساعدة في علم الأنسجة، والدكتور جون غليستين لتدريس تقنية الجراحة، تيسا ديبيل للمساعدة في التصوير بالفيديو، وجميع أعضاء مختبرات وونغ وكوسنز للحصول على البصيرة والنقاشات الحرجة، ومعهد أوسسو كنيت كانسر للحصول على الدعم المالي. يقر المؤلفون الدعم من T32GM071388-10 و T32CA106195-11 إلى سيغ، نسي / نيه، وزارة الدفاع برنامج أبحاث سرطان الثدي، ومؤسسة سوزان G كومين، ومؤسسة أبحاث سرطان الثدي، والوقوف إلى السرطان - مؤسسة لوستغارتن سرطان البنكرياس التقارب فريق الأحلام منحة البحوث الانتقالية (SU2C-آكر-DT14-14) لمك، ودورة صحة المرأة دائرة إعطاء جائزة ل مهو، ومركز بريندن كولسون للصحة البنكرياس ل مهو و لمك.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأيزوفلوران | بيرامال للرعاية الصحية | N / A | طلب وصفة طبية |
| كولاجيناز أ | روش | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 مل زجاجة بيركس | سيجما ألدريتش | CLS139525 | |
| مصل الأبقار الجنيني | أتلانتا بيو ؛ | S11150 | |
| 0.7 & م مصفاة النايلون | كورنينج | 352350 | |
| 50 مل أنبوب مخروطي | VWR | 89039-658 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما-ألدريتش | D2650 | |
| عامل النمو المخفض Matrigel | BD | 354230 | تحضير الغشاء القاعدي القابل للذوبان بعامل النمو المستخرج من ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) |
| Poly (vinylpyrrolidone) & ndash ؛ مركب اليود | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 مقياس 0.3 مل حقنة الأنسولين | BD | 324702 | |
| طقم كي الأوعية الصغيرة | FST | 18000-00 | |
| مقاطع الجرح | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip مشبك الجرح التطبيق | BD | 427630 | |
| مزيل مشبك الجرح AutoClip | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| أنابيب شعرية هيبارينية | فيشر | 22362566 | |
| أنابيب Microtainer مع ثنائي البوتاسيوم EDTA | د.ب | 365974 | |
| 20 مل حقنة | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT - التجميد المتوسط | VWR | 25608930 | |
| الفورمالين ، مخزن مؤقت ، 10٪ (عازلة الفوسفات) | فيشر | SF100-4 | |
| إبرة 23 جرام | فيشر | 14-826-6B | |
| FVB / n ماوس | مختبرات جاكسون | 001800 |
المراجع
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer (Version 3.2014). , Accessed November 25. http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
