Method Article

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

DOI:

10.3791/54854

⸱

January 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لإخراج الجين ذي الأهمية المتورط في اقتران البلازميد ثم نحلل تأثير غيابه باستخدام فحوصات التزاوج. يتم استكشاف وظيفة الجين بشكل أكبر في منطقة معينة من تسلسله باستخدام الحذف أو الطفرات النقطية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقل المادة الوراثية عن طريق الاقتران البكتيري هو عملية تحدث عبر مجمعات تتكون من بروتينات نقل محددة. في الإشريكية القولونية ، تشكل بروتينات النقل هذه آلية نقل الحمض النووي المعروفة باسم تكوين زوج التزاوج ، أو مجمع نقل الحمض النووي ، مما يسهل نقل البلازميد المترافق. الهدف من هذه الورقة هو توفير طريقة يمكن استخدامها لتحديد دور بروتين نقل معين يشارك في الاقتران باستخدام سلسلة من عمليات الحذف و / أو الطفرات النقطية مع فحوصات التزاوج. يتم إخراج الجين المستهدف على البلازميد المترافق ثم يتم توفيره عبر استخدام بلازميد استرداد صغير يؤوي الجين المستهدف. يمكن أن تكشف الطفرات التي تؤثر على الجين المستهدف في بلازميد الاسترداد عن معلومات حول الجوانب الوظيفية للبروتين المستهدف والتي تؤدي إلى تغيير كفاءة التزاوج للخلايا المانحة التي تؤوي الجين المتحور. توفر التعديلات في كفاءة التزاوج نظرة ثاقبة لدور وأهمية بروتين النقل المعين ، أو منطقة فيه ، في تسهيل نقل الحمض النووي المترافق. سيوفر اقتران مقايسة التزاوج هذه بالدراسات الهيكلية ثلاثية الأبعاد التفصيلية فهما شاملا لوظيفة بروتين النقل الاقتراني بالإضافة إلى توفير وسيلة لتحديد وتوصيف مناطق تفاعل البروتين والبروتين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقل الجينات والبروتينات على المستوى الجزئي العضوي يلعب دورا مركزيا في بقاء البكتيريا وتطورها وكذلك عمليات العدوى. تبادل الحمض النووي بين البكتيريا أو بين البكتيريا والخلايا لا يمكن أن يتحقق من خلال التحول، والاقتران أو ناقلات التنبيغ. 1،2 الإقتران هي فريدة من نوعها بالمقارنة مع التحول والتنبيغ في ذلك خلال الاقتران بين البكتيريا سالبة الجرام مثل كولاي، يحدث نقل الحمض النووي بطريقة تسيطر عليها المانحة حيث يربط نظام الجزيئات المعقدة خلايا المانحة والمتلقية. الإقتران هي أيضا الطريقة الأكثر مباشرة التي الخلايا البكتيرية تتفاعل مع الخلايا المضيفة لحقن الجينات والبروتينات أو المواد الكيميائية في لأنظمة المضيف. 3 وفي كثير من الأحيان، ونقل هذه العوامل له تأثيرات ملحوظة على المضيف، تتراوح بين التسبب والتسرطن لاستضافة التطور والتكيف. وقد تبين أن recombinatio اقترانيةن يزيد من معدل التكيف 3 أضعاف في البكتيريا مع معدلات طفرة عالية في ظل ظروف الإجهاد البيئي. 4 وعلاوة على ذلك، الاقتران هو إلى حد بعيد الطريقة الأكثر شيوعا التي يتم من خلالها نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في السلالات البكتيرية. 5،6

وقد تطورت الكائنات الحية الدقيقة إفراز نظم متخصصة لدعم نقل الجزيئات عبر الأغشية الخلوية. يوجد حاليا 9 أنواع من أنظمة إفراز (TSSs) في البكتيريا سالبة الجرام التي تم وصفها: T1SS، T2SS، T3SS، T4SS، T5SS، T6SS، T7SS، وكذلك المجلس الأعلى للتعليم (إفراز) وتات (يومين أرجينين النبات) مسارات. 7،8 لكل نوع من نظام إفراز ينقسم الى مزيد من أنواع فرعية مختلفة، ضرورة بسبب تنوع البروتينات وتميز الممرات المشتركة، في السلالات البكتيرية المختلفة. على سبيل المثال، في نظام النوع الرابع إفراز (T4SS)، وأنظمة تي والمساعدة النقدية تسهل نقل المستجيب في حين أن F-البلازميد، R27 لالثانية pKM101 T4SSs تسهيل نقل البلازميد اقترانية. 7،9،10 الفهم المفصل من الآليات التي الكائنات تجميع أنظمة إفراز كل منهما من البروتينات المكونة لها وتشترك محتويات الخلوية مع المتلقي أو البيئة المحيطة بهم هو عامل مهم في تطوير استراتيجيات ترمي إلى مكافحة الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض والعمليات عدوى الخلوي.

بعد تحديد الاقتران البكتيري الأولي في كولاي التي كتبها دربيرج وتاتوم، 11 وقد تم تحديد عدد كبير من البلازميدات النقالة واقترانية ويتميز. تظهر هذه البلازميدات 12 المتنقلة مجموعة كبيرة هو حجم (من 1 إلى أكثر من 200 kilobases (كيلوبايت))، ولكن كل البلازميدات النقالة تحتوي على relaxase، الذي يعترف أصل نقل (أوريت) وبالتالي تمكين انتقال البلازميد. البلازميدات اقترانية مزيد من جينات ترميز لتجميع وT4SS وظيفية وكذلك نوعرابعا البروتين اقتران. 12 على سبيل المثال 100 كيلو بايت F البلازميد كولاي بترميز كل الجينات اقترانية ضمن (هيئة تنظيم الاتصالات) المنطقة 33.3 نقل كيلوبايت. 13 الجينات في المنطقة هيئة تنظيم الاتصالات البلازميد ترميز F جميع البروتينات التي تسهل تشكيل شعرة، التزاوج تشكيل الزوج (MPF)، نقل الحمض النووي وظائف استبعاد أثناء نقل البلازميد اقترانية. 10،14،15 مجموعة كبيرة من المعرفة متاحة للاقترانية T4SSs، ومع ذلك بالتفصيل الدراسات الهيكلية للبروتينات اقترانية والمجمعات وإلا أصبحت متاحة في الآونة الأخيرة. 16-28

من أجل تجميع عرض شامل لعملية اقترانية، لا بد من اقتران دراسات هيكلية مفصلة لالطفرات تحليل البروتينات نقل اقترانية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال فحوصات التزاوج اقترانية. لالبلازميد F، كل البروتين المشفرة في المنطقة هيئة تنظيم الاتصالات تلعب دورا في التعاون بوساطة F-njugation. وبالتالي، فإن خروج المغلوب / حذف الجينات نقل تلغي قدرة اقترانية الخلية (الشكل 1). في حين البلازميدات المحمولة الصغيرة هي أكثر ملاءمة لإجراءات الحذف القياسية، لالبلازميدات اقترانية أكبر مثل F، تتحقق بالضربة القاضية جين بسهولة أكبر عبر إعادة التركيب مثلي حيث يتم استبدال الجينات المستهدفة مع واحد نقل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية واضح. في البروتوكول الحالي، ونحن توظيف إعادة التركيب مثلي لاستبدال الجينات نقل الفائدة مع أسيتيل الكلورامفينيكول (CAT) في 55 كيلوبايت F البلازميد مشتق pOX38-ح. 29،30 البلازميد خروج المغلوب الناتجة، pOX38-ح Δgene :: سم، ويسهل المقاومة إلى وجود الكلورامفينيكول (سم) في وسائل الإعلام نمو. الخلايا المانحة إيواء pOX38-ح Δgene :: سم غير قادرة على التأثير اقترانية نقل الحمض النووي / التزاوج كما لوحظ من خلال استخدام فحص التزاوج. كفاءة التزاوج من خلية المانحة pOX38-ح Δgene :: سم ورجب الطبيعيient سينخفض ​​أو، في كثير من الأحيان، أن يلغى. نقل اقترانية من البلازميد pOX38-ح Δgene :: سم يمكن استعادتها عن طريق البلازميد الانتعاش صغير إيواء الجينات نقل المستهدفة. هذا البلازميد الانتعاش يمكن أن يكون واحد أن يوفر التعبير التأسيسي، مثل pK184 البلازميد (pK184 الجينات)، 31 أو أخرى توفر التعبير محرض طالما أن البلازميد يستهدف بشكل صحيح الجين إلى الموقع الصحيح داخل الخلية (السيتوبلازم أو الجبلة المحيطية). ونتيجة لذلك، في المقايسات التزاوج بين هذه الجهات المانحة الجديدة (إيواء pOX38-ح Δgene البلازميدات :: سم + pK184 الجينات) والخلية المستقبلة، ومن المتوقع أن يعيد إلى ما يقرب من ذلك من الطبيعي المانح والمتلقي التزاوج فحص كفاءة التزاوج. هذا النظام يمكن واحد للتحقيق وظيفة الجين خرج من خلال توليد سلسلة من يبني pK184 الجينات (الحذف أو طفرات نقطة) واختبار قدرة كل بناء لاستعادة القدرة التزاوج من إيواء pOX38-ح Δgene :: سم الخلية المانحةالصورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجيل من التركيبات DNA

  1. تصميم الأوليغومرات لمثلي إعادة التركيب من الهدف جين
    1. تصميم واحد 55-72 سنة مضت قليل وحدات إلى الأمام على النحو التالي: (أ) اختيار 19-32 نقطة أساس طويل تسلسل النوكليوتيدات الذي هو مثلي لتسلسل الحمض النووي في شركة بريتيش بتروليوم المنطقة 10-100 المنبع من موقع بداية 5 'من الجين أسيتيل الكلورامفينيكول في البلازميد pBAD33 التجاري و 32 و (ب) اختيار 36-54 سنة مضت النوكليوتيدات طويلة تسلسل مثلي إلى منطقة 10-150 بي بي المصب من موقع بداية 5 'من الجين المستهدف من الفائدة.
      1. تاريخ "نهاية تسلسل النوكليوتيدات التقطت في الفقرة (ب) إلى 5 '3 نهاية النوكليوتيدات اختار تسلسل في (أ)، مما يعطي واحدة 55-72 قليل وحدات إلى الأمام طويلة.
    2. تصميم واحد 55-72 بي بي العكس قليل وحدات على النحو التالي: (أ) اختيار 19-32 نقطة أساس طويل تسلسل النوكليوتيدات الذي هو مثلي لتسلسل الحمض النووي في شركة بريتيش بتروليوم المنطقة 10-100 المصبمن 3 'نهاية الجين الكلورامفينيكول في البلازميد pBAD33 التجاري، و (ب) اختيار 36-54 سنة مضت النوكليوتيدات طويلة تسلسل مثلي إلى منطقة داخل 10-150 بي بي المنبع 3' موقع نهاية الجين المستهدف من الفائدة .
      1. تاريخ "نهاية تسلسل النوكليوتيدات التقطت في الفقرة (ب) إلى 5 '3 نهاية النوكليوتيدات اختار تسلسل في الفقرة (أ) لجعله قليل وحدات واحدة.
      2. نسخ هذا قليل وحدات في أي برنامج المعلوماتية الحيوية المتاحة وتحويل تسلسل إلى متممة العكسي. وهذا يعطي واحدة 55-72 سنة مضت قليل وحدات عكس طويلة.
    3. باستخدام أي برنامج جزئية محلل المتاحة، وتأكد من أن الأوليغومرات إعادة التركيب يكون محتوى GC بين 40-60٪، وانخفاض القاسي درجة حرارة انصهار (T م)، وانخفاض الذاتي ومغاير dimerization T م الصورة. ترتيب الاشعال لتخليق وشحنة من أي شركة للتكنولوجيا الحيوية المفضلة.
  2. التضخيم من كاسيت لجنة مناهضة التعذيب من pBAD33 (سم R ) البلازميد عن طريق الأوليغومرات مصممة لالاقتران مثلي
    1. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها (O / N، 16-18 ح) من الخلايا DH5α إيواء البلازميد pBAD33 في مرق استذابة معقم (LB) مع 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (سم) مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
    2. الطرد المركزي 6-8 مل من ثقافة O / N في درجة حرارة الغرفة، 5000 x ج لمدة 3 دقائق. صب طاف واستخراج البلازميد pBAD33 من بيليه استخدام البلازميد مجموعة مصغرة الإعدادية (مواد الجدول) وبروتوكول الشركة الصانعة.
    3. هل خلاصة من البلازميد الحمض النووي pBAD33 بإضافة ما يلي في أنبوب معقم في ترتيب معين: حجم مناسب من الماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O) إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر، حجم 1 ميكروغرام من pBAD33 البلازميد، 5 ميكرولتر 10X رد فعل العازلة انزيم، و 0.5 ميكرولتر من انزيم التقييد افاعي (RE). المزيج بلطف قبل pipetting والسماح للرد فعل المضي قدما لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. الحرارة تعطيل رد فعل لمدة 20 دقيقة (دقيقة) في 80° C. عينات في مخزن -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة للحد من تدهور لزجة نهاية.
    4. إعداد الاغاروز 1.2٪ يفصل هلام عن طريق خلط 1.2 غرام من الاغاروز مع 100 مل من 1X تاي (40 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.5، و 20 ملم حمض الخليك، 1 ملم EDTA) عازلة في قارورة مخروطي سعة 250 مل. الحرارة ودوامة لتذوب تماما في الميكروويف. وقف تسخين فورا عندما يبدأ السائل في الغليان ودوامة القارورة.
      1. تبريد الاغاروز السائل لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في حين يحوم، إضافة 2 ميكرولتر من 10 ملغ / مل بروميد إيثيديوم ودوامة لخلط. صب الاغاروز في علبة هلام مع المشط جيدا والسماح لها لترسيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أيام في المخزن 1X تاي.
    5. خلط كل RE الهضم من 1.2.3 مع 0.2 حجم صبغ الحمض النووي تحميل (10 ميكرولتر من صبغ في 50 رد فعل ميكرولتر) من قبل pipetting. تحميل 5 ميكرولتر من 500 ميكروغرام / مل سلم الحمض النووي في البئر الأول وجميع من خليط RE هضم صبغ إلى آخر بشكل جيد على لهلام garose. استخدام 2-3 الآبار لتحميل كل من حجم رد الفعل على هلام.
      1. تشغيل هلام المغمورة بالكاد في 1X TAE العازلة والتي تعمل في 45-50 V (4،5-5 V / سم) لمدة 65 دقيقة في الجهاز الكهربائي للهلام.
    6. باستخدام مجلس الوزراء للأشعة فوق البنفسجية والحلاقة معقمة، وقطع بسرعة الفرقة 2.8 كيلوبايت الذي يتوافق مع تسلسل CAT من هلام للحد من التعرض للأشعة فوق البنفسجية من الحمض النووي. استخراج الحمض النووي من هلام شريحة قطع من استخدام عدة استخراج الهلام (مواد الجدول) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: احرص على عدم تعريض الجلد مباشرة تحت الأشعة فوق البنفسجية والتعامل مع الحلاقة مع الرعاية.
    7. تضخيم كاسيت CAT المستخرجة من 1.2.6 عن طريق البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات مصممة في 1.1 التي تحتوي على يتدلى مثلي إلى التسلسل الجيني للسماح لإعادة التركيب مثلي. يتم تعيين ردود الفعل PCR حتى على الجليد باستخدام المبادئ التوجيهية الشركة المصنعة (مواد الجدول) بالترتيب التالي:
      1. الىالعقيمة أنبوب PCR، إضافة حجم مناسب من ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر، تليها 10 ميكرولتر من العازلة PCR، 1 ميكرولتر من 10 ملي dNTPs، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي عكسي ، 1-25 نانوغرام من الحمض النووي قالب من 1.2.6 و 0.5 ميكرولتر من 100 وحدة / ميكرولتر الحمض النووي بوليميريز.
      2. إعداد عنصر تحكم السلبية التي تحمل نفس المكونات 1.2.7.1 ولكن مع استثناء من الحمض النووي القالب. استخدام حجم مناسب من ده 2 O بدلا من قالب الحمض النووي. إعداد مراقبة إيجابية باستخدام الحمض النووي القالب والاشعال التي ثبت للعمل في تفاعل PCR، مثل تلك المنصوص كما تحكم إيجابية من قبل الشركة المصنعة.
      3. تخلط جميع محتويات رد فعل بلطف قبل pipetting.
      4. تضخيم عبر PCR باستخدام الإعدادات التالية: تمسخ الأولي لمدة 30 ثانية في 98 درجة مئوية، و 30 دورات تمسخ لمدة 10 ق على 98 درجة مئوية، الصلب التمهيدي لمدة 20 ثانية، تمديد لمدة 20 ثانية لكل كيلو قاعدة من amplicon عند 72 درجة مئوية و زعنفةآل تمديد لمدة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. عينات في مخزن -20 درجة مئوية.
    8. تأكد من حجم الصحيح من التضخيم عبر الكهربائي للهلام الاغاروز (انظر 1.2.4-1.2.5) باستخدام فقط 5 ميكرولتر من كل رد فعل. تنقية amplicon PCR باستخدام طقم تنقية PCR وبروتوكول الشركة الصانعة. متجر تنقية الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  3. وpK184 الجينات استعادة البلازميد
    1. تصميم التمهيدي إلى الأمام ابتداء من ل 5 'نهاية والذهاب نحو 3' نهاية بالترتيب التالي: (أ) اختيار 4 النيوكليوتيدات العشوائية (مزيج من الأدنين، ثايمين، الجوانين والسيتوزين) للكفاءة الانقسام، وتعلق على (ب) وEcoRI تقييد انزيم (RE) تسلسل خفض الموقع (GAATTC)، تليها (ج) 21-25 نقطة أساس طويل تسلسل النوكليوتيدات الذي هو مثلي إلى نهاية 5 'من الجينات في المصالح، بما في ذلك كودون البداية. إذا كان يحتوي على الجين المستهدف موقع EcoRI، اختر RE مناسب آخر من pK184 متعددة موقع الاستنساخ.
    2. تصميم التمهيدي العكسي في الترتيب التالي: (أ) اختيار 4 النيوكليوتيدات العشوائية لكفاءة الانقسام، تليها (ب) تسلسل HindIII خفض الموقع (AAGCTT) تليها (ج) 21-25 نقطة أساس تكملة العكسي طويلة من 3 "نهاية الجينات في المصالح بما في ذلك وقف كودون. إذا كان يحتوي على الجين المستهدف موقع HindIII، اختر RE آخر في pK184 متعددة موقع الاستنساخ.
    3. في حالة جينات ترميز البروتينات محيط بالجبلة، وتشمل تسلسل زعيم إضافية بين الموقع RE وكودون بداية على التمهيدي إلى الأمام.
    4. باستخدام أي متاح بنسبة ضئيلة من محلل، تأكد من أن الاشعال لها محتوى GC بين 40-60٪، وانخفاض دبوس الشعر T م، وانخفاض الذاتي ومغاير dimerization T م الصورة. ترتيب الاشعال لتخليق.
    5. تنمو O / N ثقافة خلايا DY330R pOX38-ح في معقم LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين (ح) مع اهتزاز عند 32 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي 6-8 مل من ثقافة O / N في درجة حرارة الغرفة، 5000 x ج لمدة 3 دقائق. صبوطاف استخراج DNA البلازميد من بيليه استخدام البلازميد مجموعة مصغرة الإعدادية (مواد الجدول) وبروتوكول الشركة الصانعة.
    6. تضخيم الجين الكامل في المصالح مع الاشعال من 1.3.1-1.3.5 باستخدام pOX38-ح كقالب (انظر 1.2.7.1-1.2.7.3).
    7. تأكد من حجم الصحيح من التضخيم عبر الكهربائي للهلام الاغاروز (انظر 1.2.4-1.2.5) باستخدام فقط 5 ميكرولتر من كل رد فعل. تنقية تضخيم الحمض النووي باستخدام طقم تنقية PCR وبروتوكول الشركة الصانعة. متجر تنقية الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
    8. هل خلاصة مزدوجة من كل من يتوفر تجاريا الحمض النووي pK184 البلازميد والجينات تضخيم (من 1.3.7.)، وذلك بإضافة ما يلي في أنبوب معقم في ترتيب معين: حجم مناسب لده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر (1) حجم ميكروغرام من pK184 البلازميد، 5 ميكرولتر رد فعل العازلة 10X الانزيم، و1 ميكرولتر من كل EcoRI وHindIII.
      1. المزيج بلطف قبل pipetting والسماح للرد فعل المضي قدما لمدة 1 ساعةفي 37 درجة مئوية. الحرارة تعطيل رد فعل لمدة 20 دقيقة في 80 درجة مئوية. عينات في مخزن -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة للحد من تدهور لزجة نهاية.
        ملاحظة: نوع نوكلياز تقييد استخدامها هنا يعتمد على موقع تقييد نوكلياز التي تم ترتيبه في الاشعال في خطوات 1.3.1 و 1.3.2.
      2. كما تحكم إيجابية، وإنشاء الملخصات واحدة من البلازميد pK184 من خلال إعداد نفس رد الفعل كما هو الحال في 1.3.8 باستثناء إضافة واحد فقط من الدقة لأنبوب رد فعل. هل هذا بشكل منفصل مع كل من الدقة.
    9. تشغيل هضم على هلام الاغاروز 1.2٪ باستخدام بروتوكولات 1.2.4-1.2.5 استخراج الحمض النووي المزدوج هضم أجزاء من كلا pK184 والجين من الفائدة وفقا إلى الخطوة 1.2.6.
    10. Ligate إدراج الجينات في ناقلات pK184 بإضافة المكونات في أنبوب معقم بالترتيب التالي: 2 ميكرولتر من 10X T4 DNA يغاز العازلة، أي ما مجموعه 100 نانوغرام الحمض النووي يتكون من 1: ناقل 3: إدراج (pK184: الجينات) النسبة، ده 2 O ما يصل الىالحجم الكلي لل20 ميكرولتر و 1 يغاز ميكرولتر T4 DNA. ونتيجة لسيطرة سلبية، اقامة رد فعل مماثل باستخدام 100 نانوغرام من ناقلات دون الجين إدراج.
      1. المزيج بلطف على جميع محتويات رد فعل باستخدام micropipette واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. للحرارة على تعطيل التفاعل ربط لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية ومن ثم وضع على الجليد.
    11. بينما على الجليد، إضافة 15 ميكرولتر من pK184 الجينات رد فعل ربط من الخطوة 1.3.10 إلى 100 ميكرولتر من الخلايا DH5α المختصة كيميائيا في العقيمة 1.5 مل أنبوب. المزيج بلطف قبل pipetting واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. تفعل الشيء نفسه بالنسبة للعينة السيطرة السلبية. للتحكم إيجابية، استخدام 20-100 نانوغرام من البلازميد مثل pBAD33 وتحويلها إلى 50 ميكرولتر من DHα الخلايا.
    12. مباشرة نقل عينات من الجليد إلى 42 ° C حمام المياه واحتضان لمدة 90 ثانية. وهذا يوفر للخلايا الصدمة الحرارية وتسمح لهم امتصاص الحمض النووي البلازميد.
    13. خلايا المكان مرة أخرى على الجليد لآخر5 دقائق ثم قم بإضافة 900 ميكرولتر من LB. عقيمة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حين تهتز في 125 دورة في الدقيقة.
    14. قسامة حجم 100 ميكرولتر من عينة من كل رد فعل ربط في 1.3.13 على لوحة أجار يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (كم) وتنتشر الخلايا باستخدام رش العقيمة. يجب أن يكون المضادات الحيوية المناسبة لوحة تحكم إيجابية. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. احتضان لوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    15. باستخدام ماصة معقمة أو حلقة، حصاد مستعمرة متميزة واحدة من الخلايا وتطعيم 20 مل معقم LB مع 50 ميكروغرام / مل كم. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. تنمو الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    16. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من الخلايا DH5α تحويلها عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ الجلسرين (النهائي 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.
    17. أيضا أجهزة الطرد المركزي 6-8 مل من O / N الثقافة في درجة حرارة الغرفة، 5،000 x ج لمدة 3 دقائق. صب طاف واستخراج pK184 الجينات الانتعاش البلازميد من بيليه استخدام البلازميد مجموعة مصغرة الإعدادية (مواد الجدول) وبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. pK184 - المسوخ الجين
    ملاحظة: الاشعال مصممة لالحذف، الإدراج و / أو الطفرات نقطة يمكن أن تتولد بسهولة باستخدام الأدوات المتاحة على الانترنت الصانعين.
    1. تصميم كل التمهيدي إلى الأمام عن طريق التقاط و18-32 نقطة أساس النوكليوتيدات طويلة التسلسل الذي هو مثلي إلى نهاية 5 'من الجينات في المصالح، بما في ذلك كودون البداية. الاشعال تصميم مثل أن كل التمهيدي إلى الأمام anneals 30-180 بي بي المصب من سابقتها، مما أدى إلى طفرات الحذف تفتقر إلى شظايا الببتيد محطة N من أطوال مناسبة.
    2. تصميم التمهيدي العكسي عن طريق التقاط و18-32 نقطة أساس طويل تسلسل النوكليوتيدات الذي هو مثلي إلى نهاية 3 'من الجينات في المصالح بما في ذلك وقف كودون. نسخ هذا التمهيدي إلىنيويورك برنامج المعلوماتية الحيوية المتاحة وتحويل تسلسل إلى متممة العكسي. هذا هو التمهيدي عكسي.
      1. في حالة جينات ترميز البروتينات محيط بالجبلة، تصميم التمهيدي العكسي الذي هو تكملة العكسي من "نهاية التسلسل القيادي أن الجناحين 5 '3 نهاية هذا الجين ومطلوب لتوطين السليم للمنتج البروتين في الجبلة المحيطية.
    3. باستخدام أي برنامج جزئية محلل المتاحة، وتأكد من أن الاشعال الحذف يكون محتوى GC بين 40-60٪، وانخفاض القاسي درجة حرارة انصهار (T م)، وانخفاض الذاتي ومغاير dimerization T م الصورة. ترتيب الاشعال لتخليق وشحنة من أي شركة التكنولوجيا الحيوية المتاحة.
    4. باستخدام بناء pK184 الجينات التي تم الحصول عليها في بروتوكول 1.3 كقالب والمبادئ التوجيهية في 1.2.7-1.2.8، PCR تضخيم بنيات الحذف مع الاشعال مصممة في الخطوات 1.4.1-1.4.3 لتوليد amplicons ΔX pK184 الجينات . مخزن تضخيم الحمض النووي للر -20 درجة مئوية.
    5. Ligate التركيبة تضخيمها باستخدام أي مجموعة الطفرات المتاحة (مواد الجدول).
    6. تحويل كل من ligates ΔX pK184 الجينات بشكل منفصل في الخلايا DH5α المختصة كيميائيا باستخدام بروتوكول الصدمة الحرارية القياسية (انظر 1.3.11-1.3.13).
    7. قسامة حجم 100 ميكرولتر من عينة من كل رد فعل ربط في 1.4.12 على لوحة أجار يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كم وتنتشر الخلايا باستخدام رش العقيمة. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. احتضان لوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    8. باستخدام ماصة معقمة أو حلقة، حصاد مستعمرة متميزة واحدة من الخلايا وتطعيم 20 مل سائل الإعلام العقيمة LB مع 50 ميكروغرام / مل كم. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. تنمو الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    9. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من الخلايا DH5α تحويلها عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ الجلسرين (وإينال 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.
    10. الطرد المركزي 6-8 مل من ثقافة O / N في درجة حرارة الغرفة، 5000 x ج لمدة 3 دقائق. صب طاف واستخراج ΔX البلازميد pK184 الجينات بناء من بيليه استخدام البلازميد مجموعة مصغرة الإعدادية (مواد الجدول) وبروتوكول الشركة الصانعة. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

2. توليد pOX38-ح Δgene :: سم سلالات

  1. DY330R pOX38-ح Δgene :: بالضربة القاضية سم
    1. إعداد O / N ثقافة خلايا DY330R pOX38-ح في 10 مل معقم LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ح. تنمو ثقافة O / N عند 32 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
    2. جعل 1:70 التخفيف من O / N ثقافة إلى 20 مل من LB. عقيمة جديدة تنمو الخلايا على 32 درجة مئوية حتى (0،4-0،6 OD ل 600Nm) مرحلة النمو منتصف السجل.
    3. نقل 10 مل من ثقافة إلى قارورة معقمة واحتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 150 دورة في الدقيقة في هز با المياهعشر. وسيحفز هذا التعبير عن بروتينات معينة إعادة التركيب في DY330R.
    4. هدئ الثقافة في حمام الماء المثلج لمدة 10 دقيقة. إعداد خلايا electrocompetent على النحو التالي.
      1. نقل الخلايا المبردة في أنابيب المخروطية قبل المبردة وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. يجب وضع جميع الأنابيب والماصات لاستخدامها في الخطوات القادمة في 4 درجات مئوية أو على الجليد لتبريد.
      2. إزالة طاف ومعلق بلطف الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة ده 2 O. إضافة 30 مل أخرى من الجليد البرد ده 2 O.
      3. الطرد المركزي الخلايا (4000 x ج، 7 دقائق، 4 ° C)، تجاهل طاف وبلطف معلق الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة ده 2 O.
      4. نقل الخلايا معلق إلى ما قبل المبردة 1.5 مل أنابيب microfuge والطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      5. معلق بلطف بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة ده 2 O وقسامة في 50 مجلدات ميكرولتر. Electrocompeteويمكن تخزين الخلايا الإقليم الشمالي في -80 ° C
    5. إضافة 300 نانوغرام من الكاسيت CAT تضخيم من 1.2 إلى 50 ميكرولتر من خلايا DY330R pOX38-ح electrocompetent حين خلط على الجليد، بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. كرر هذه الخطوة باستخدام معدلة pBAD33 البلازميد كعنصر تحكم إيجابية.
    6. نقل الخلايا إلى (-20 درجة مئوية) 1 مم كفيت electroporation المبردة مسبقا. Electroporate الخلايا عند 1.8 كيلو فولت مع الوقت ثابت من 5.5 مللي ثانية، وذلك باستخدام electroporator. فورا بعد تطبيق النبض، وتمييع الخلايا مع 1 مل من شركة نفط الجنوب وسائل الإعلام ونقل إلى أنبوب microfuge جديدة. احتضان الخلايا عند 32 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    7. قسامة 100 ميكرولتر من كل عينة على لوحات أجار التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ح و 20 ميكروغرام / مل سم وانتشر استخدام رش العقيمة. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. احتضان لوحة رأسا على عقب على 32 درجة مئوية خلال الليل لتحديد لrecombinants ناجحة. سوف الكاسيت CAT أدخلت الخلية تخضع إعادة مثليبالاشتراك مع الجينات في المصالح وخلق DY330R pOX38-ح Δgene :: سم (ريف R، ح R، سم R) استنساخ.
      ملاحظة: من المهم أن ينمو خلايا DY330R في 32 درجة مئوية، مع استثناء من تحريض مدة 15 دقيقة في 42 ° C من الخطوة 2.1.3 قبل توليد خلايا electrocompetent، والنمو لفترات طويلة في درجات حرارة مرتفعة المخاطر موت الخلايا بسبب إنتاج المنتجات السامة من ص L الاوبرون مسؤولة عن وظائف إعادة التركيب في DY330R. 33،34
    8. إعداد O / N من DY330R pOX38-ح Δgene :: خلايا سم من حصاد مستعمرة متميزة واحدة من الخلايا مع ماصة معقمة أو حلقة، وتحصين وسائل الإعلام 20 مل معقم LB مع 10 ميكروغرام / مل ح، و 20 ميكروغرام / مل سم. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. تنمو الخلايا O / N عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    9. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من O / N عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ GLycerol (النهائي 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.
    10. الطرد المركزي 6-8 مل من ثقافة O / N في درجة حرارة الغرفة، 5000 x ج لمدة 3 دقائق. صب طاف واستخراج pOX38-ح Δgene :: سم بناء من بيليه استخدام البلازميد مجموعة مصغرة الإعدادية (مواد الجدول) وبروتوكول الشركة المصنعة. تخزين الحمض النووي النقي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    11. إجراء فحص التزاوج اقترانية باستخدام XK1200 خلايا دور المتلقي لتأكيد تعطيل اقتران بالضربة القاضية جين حسب بروتوكول 3.1.
  2. DY330R pOX38-ح Δgene :: سم + pK184 الجينات
    1. تحويل خلايا DY330R pOX38-ح Δgene :: سم electrocompetent مع 300 نانوغرام للبناء pK184 الجينات عبر Electroporation للوفقا لخطوات 2.1.4-2.1.7. يجب أن يحتوي على جميع وسائل الإعلام انتقائية 20 ميكروغرام / مل سم و 50 ميكروغرام / مل كم. احتضان عند 32 درجة مئوية. والبلازميد الانتعاش في خلايا electroporated الآن استعادة وظيفة الجين خرج في DY330R pOX38-ح Δgene :: خلايا سم.
    2. إعداد O / N من DY330R pOX38-ح Δgene :: خلايا المؤتلف سم + pK184 الجينات التي كتبها حصاد مستعمرة متميزة واحدة من الخلايا مع ماصة معقمة أو حلقة، وتحصين وسائل الإعلام 20 مل معقم LB مع 20 ميكروغرام / مل سم و 50 ميكروغرام / مل كم. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. تنمو الخلايا O / N عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    3. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من O / N عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ الجلسرين (النهائي 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.
    4. أيضا تنفيذ بروتوكول 3.1 لتوليد XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم خلايا المؤتلف.
  3. XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم + pK184 الجينات والمسوخ
    1. إعداد خلايا electrocompetent XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم (من الخطوة 2.2.4).
    2. بشكل منفصل electroporate 300 نانوغرام من pK184 الجينات أو pK184 الجينات الطافرة البلازميدات إلى 50 ميكرولتر من ايلىctrocompetent XK1200 pOX38-ح Δgene :: خلايا سم حسب الخطوات 2.1.4-2.1.7. يجب أن يحتوي على جميع وسائل الإعلام انتقائية 10 ميكروغرام / مل حمض الناليديكسيك (نال)، و 20 ميكروغرام / مل سم، و 50 ميكروغرام / مل كم ويتم حضنت عند 37 درجة مئوية.
    3. إعداد O / N من XK1200 pOX38-ح Δgene :: خلايا المؤتلف سم + pK184 الجينات التي كتبها حصاد مستعمرة متميزة واحدة من الخلايا مع ماصة معقمة أو حلقة، وتحصين وسائل الإعلام 20 مل معقم LB مع نال 20 ميكروغرام / مل سم و 50 ميكروغرام / مل كم. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. تنمو الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    4. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من O / N عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ الجلسرين (النهائي 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.

3. اقترانية التزاوج فحوصات

  1. اقترانية التزاوج لتوليد خلايا XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم
    1. إعداد 20 مل معقم LB O / N طريق مسدودالبنية من DY330R pOX38-ح Δgene :: خلايا سم + pK184 الجينات باستخدام ماصة معقمة أو حلقة لتطعيم 20 مل معقم LB تحتوي على 20 ميكروغرام / مل سم و 50 ميكروغرام / مل كم مع مخزون الجلسرين أو مستعمرة واحدة على لوحة أجار. ينمو بمعدل 32 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. إعداد نفسه لXK1200 الخلايا في 20 مل معقم LB مع 10 ميكروغرام / مل نال، وتزايد عند 37 درجة مئوية.
    2. جعل 1:70 التخفيفات من كل ثقافة على حدة في 2 مل من معقم LB مع نفس المحتويات للمضادات الحيوية. إضافة الجلوكوز إلى تركيز النهائي من 100 ملم إلى جميع الخلايا المانحة. تنمو الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل (OD 600 0،5-0،7) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    3. أجهزة الطرد المركزي (4000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية) لتكوير الخلايا، تجاهل طاف، ويغسل مرة واحدة مع LB معقم البارد لإزالة المضادات الحيوية، والخلايا resuspend في 2 مل LB. عقيمة البرد
    4. قسامة 100 ميكرولتر من كل ثقافة إلى 800 ميكرولتر من وسائل الاعلام LB العقيمة والسماح لهم للتزاوج في 32 درجة مئوية لمدة 1 ساعة دون أن تهتز.
      5. <لى> دوامة الخلايا لمدة 30 ثانية لعرقلة أزواج التزاوج ووضعها على الجليد لمدة 10 دقيقة لمنع المزيد من التزاوج.
    5. قسامة 100 ميكرولتر من خليط الخلية على لوحة أجار التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل نال و 20 ميكروغرام / مل سم لتحديد الخلايا XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم. انتشار الخلايا باستخدام رش العقيمة. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. المحتضنة لوحة O / N عند 37 درجة مئوية رأسا على عقب.
    6. حصاد مستعمرة واحدة من الجين الجديد XK1200 pOX38-ح Δ :: سم خروج المغلوب سلالة باستخدام ماصة معقمة أو حلقة وتنمو في معقم LB مع 20 ميكروغرام / مل سم، O / N في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. جعل 3-5 الأسهم الجلسرين من O / N عن طريق خلط 500 ميكرولتر من O / N ثقافة مع 500 ميكرولتر من معقمة 100٪ الجلسرين (النهائي 50٪ ت / ت) في العقيمة البرد الأنابيب. تخزين في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الخلايا الناتجة أصبحت الآن قادرة على أن تدلي المختصة للتحول مع بنيات pK184 الجينات (بروتوكولات 1.3 و 1.4) للالحمارessing الجينات والطفرات على القدرة على استرداد نقل اقترانية في بروتوكول 3.2.
  2. اقترانية التزاوج الفحص من XK1200 الجهات المانحة إلى المستلمين MC4100
    1. إعداد O / ثقافة N من XK1200 pOX38-ح Δgene :: سم + pK184 الجينات الخلايا في 20 مل من معقم LB مع 20 ميكروغرام / مل سم، 50 ميكروغرام / مل كم وMC4100 الخلايا في 5 مل LB مع 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (SM) باستخدام خلايا من المخزون الجلسرين أو مستعمرة واحدة على لوحة أجار ومعقمة ماصة أو حلقة. تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز.
    2. جعل 1:70 التخفيفات من كل O / N ثقافة على حدة في 2 مل من معقم LB مع نفس المضادات الحيوية. إضافة الجلوكوز إلى تركيز النهائي من 100 ملم إلى جميع الخلايا المانحة. تنمو الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل (OD 600 0،5-0،7) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
    3. أجهزة الطرد المركزي (4000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية) لتكوير الخلايا، تجاهل طاف، ويغسل مرة واحدة مع LB معقم البارد لإزالة المضاداتالتشنجات اللاإرادية، والخلايا resuspend في 2 مل LB. عقيمة البرد
    4. في نسختين، قسامة 100 ميكرولتر من كل ثقافة إلى 800 ميكرولتر من وسائل الاعلام LB العقيمة والسماح لهم للتزاوج عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة دون أن تهتز.
    5. دوامة الخلايا لمدة 30 ثانية لعرقلة أزواج التزاوج ووضعها على الجليد لمدة 10 دقيقة لمنع المزيد من التزاوج.
    6. باستخدام الثقافات منتصف سجل من الخطوة 3.2.2 ومعقم LB جديدة، وإعداد 6 التخفيفات المسلسل من الخلايا المانحة والمتلقية من 10 -2 الى 10 -7.
    7. على كل من نصفين من لوحة أجار التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل نال 20 ميكروغرام / مل سم و 50 ميكروغرام / مل كم، بقعة 10 مكل من كل تخفيف من XK1200 الخلايا المانحة، كما هو مبين في الشكل 2. كرر لالتخفيفات من الخلايا MC4100 المتلقي على لوحات أجار يحتوي على 50 ميكروغرام / مل ن خ. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.
    8. باستخدام خليط vortexed من الخطوة 3.2.5 ومعقم LB جديدة، وإعداد 6 التخفيفات (10 -2 الى 10 -7 ) من transconjugants. اختر لtransconjugant خلايا MC4100 pOX38-ح Δgene :: سم من اكتشاف 10 مكل من كل من التخفيف في كل شوط من لوحات أجار يحتوي على 50 ميكروغرام / مل ن خ و 20 ميكروغرام / مل سم، كما في الشكل (2). كرر لكل من الخلطات مكررة. إبقاء المنطقة العقيمة والعمل بالقرب من اللهب. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية.
    9. تحديد كفاءة التزاوج من كل بناء كما هو موضح في بروتوكول 3.3.
    10. كرر هذا البروتوكول لجميع البلازميدات الانتعاش لتقييم تأثير طفرة معينة على كفاءة تصريف الافعال.
  3. حساب الكفاءة التزاوج
    1. حساب عدد المستعمرات من نفس اكتشاف تخفيف لكل المانحة والمتلقي وخلايا transconjugant على لوحات كل منها.
    2. عدد المستعمرات المتلقي لاختبار أي تحيز التي ستنجم عن وجود عدد أكبر من transconjugants من المتلقين في ذلك تخفيف معين.
    3. Calculate كفاءة التزاوج حيث بلغ عدد المستعمرات transconjugant مقسوما على عدد من المستعمرات المانحة. ضرب من قبل 100 إلى الحصول على قيمة الكفاءة لكل 100 الخلايا المانحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عملية F يحركها البلازميد الاقتران البكتيري هي عملية منسقة الذي ينطوي على البروتينات نقل داخل المنطقة هيئة تنظيم الاتصالات من F-البلازميد التي تجمع على T4SS لتسهيل تركيب شعرة ونقل الحمض النووي اقترانية. مطلوب لتشكيل F-شعرة اقترانية، وTraF البروتين (يونيبروت معرف P14497 بنك الجينات الانضمام # BAA97961). 10،14،35 - 37 البروتين يحتوي على نطاق مثل thioredoxin C-المحطة، على الرغم من أنه لم يكن لديك عزر CXXC الحفا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر عملية الاقتران البكتيري الوسائل التي يمكن للبكتيريا تنتشر الجينات توفير ميزة تطورية للنمو في البيئات الصعبة، مثل انتشار علامات مقاومة للمضادات الحيوية. لأن الكثير من البلازميدات اقترانية هي كبيرة جدا، 12 دراسة وظيفية على البروتينات المشاركة في تجميع جهاز نقل من خلال تحور الجينات المستهدفة على البلازميد اقترانية نفسها هي غير عملي. البروتوكولات بالتفصيل هنا توفر الوسائل التي يمكن للمرء أن تقييم بسهولة أكبر على الجينات المستهدفة من الفائدة من خلال استخدام، البلازميدات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البحث من قبل منحة ديسكفري من العلوم والهندسة مجلس الطبيعية في كندا (NSERC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

مجموعة طقم Gel نيو العلمي

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
التحضير المصغرة للبلازميد GeneJetFisher ScientificK0503
GeneJetKit طقم تنقية Fisher ScientificK0692
GeneJet PCRطقم تنقية فيشر ScientificK0702
Q5 طقم الطفرات الموجه بالموقعنيو إنجلاند BiolabsE0554S
سلم الحمض النووي واسع النطاقإنجلاند بيولوجيسN0303A
أطباق بتريفيشر FB0875713
ElectroporatorEppendorf4309000027
كوفيت التثقيبالكهربائي فيشر ScientificFB101Cuvettes بها فجوة 1 مم.
<قوي>إنزيمات< / قوي> AvaI
نيو إنجلاند بيولابزR0152S
EcoRIنيو إنجلاند بيولابزR0101S
HindIIIنيو إنجلاند بيولابزR0104L
NdeIنيو إنجلاند بيولابزR0111S
فوسيون الحمض النووي بوليميرازنيو إنجلاند بيولابزM0530L
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
DpnINew England BiolabsR0176S
AntibioticsFinal Concentrates
Chloramphenicol (سم)Fisher ScientificBP904-10020 & micro; جم / مل
كاناميسين (كم) شركةBioBasic Inc.DB028650 & جم / مل
حمض ناليديكسيك (نال)سيجما ألدريتشN8878-25G10 & مايكرو ؛ جم / مل
ريفامبيسين (ريف)كالبيوكيم55730320 وميكرو ؛ جم / مل
التتراسيكلين (Tc) فيشرالعلميBP912-10010 & جم / مل
ستربتومايسين (سم) فيشرساينتفيكBP910-5050 & مايكرو ؛ جم / مل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
  3. Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).
  4. Cooper, T. F. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).
  5. Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
  6. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  7. Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).
  8. Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).
  9. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  10. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
  11. Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
  12. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  13. Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
  14. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
  15. Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).
  16. Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
  17. Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
  18. Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
  19. Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
  20. Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
  21. Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
  22. Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735(2008).
  23. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
  24. Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
  25. Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
  26. Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).
  27. Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
  28. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
  29. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).
  30. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  31. Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).
  32. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  33. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
  34. Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
  35. Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
  36. Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
  37. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).
  38. Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
  39. Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
  40. Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
  41. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  42. Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
  43. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
  44. Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial ConjugationConjugative Mating AssaysTransfer Protein AnalysisType Four Secretion SystemPlasmid Transfer EfficiencyGene Knockout MethodHomologous RecombinationMating Efficiency CalculationDonor Recipient CellsProtein protein Interactions

Related Articles