Method Article

وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

DOI:

10.3791/54858

⸱

January 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات على مستوى نسيلي. وحيدة الخلية RT-QPCR يؤدي إلى نتائج موثوق بها للغاية مع حساسية قوية لمئات العينات والجينات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير الجيني عدم التجانس هو ميزة مثيرة للاهتمام للتحقيق في السكان اللمفاوية. التعبير الجيني في هذه الخلايا تختلف خلال تنشيط الخلايا، والإجهاد، أو التحفيز. وحيدة الخلية التعبير الجيني تعدد الإرسال يمكن تقييم في وقت واحد من عشرات الجينات 1، 2، 3. على مستوى خلية واحدة، التعبير الجيني تعدد الإرسال يحدد التجانس السكاني 4، 5. انها تسمح للتمييز من عدم التجانس السكاني عن طريق تحديد كل من مزيج محتمل من مراحل السلائف متنوعة بين خلايا ناضجة وأيضا تنوع استجابات الخلايا للمحفزات.

وقد وصفت الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) في الآونة الأخيرة كما يبلغ عدد سكانها المستجيبات الفطرية الاستجابة المناعية 6 و 7. في هذا البروتوكول، وعدم التجانس الخلية لمؤتمر العمل الدولي انهوالتحقيق في مقصورة patic خلال التوازن.

حاليا، هذه التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم التعبير الجيني هو RT-QPCR. هذا التعبير الجيني التدابير الطريقة فقط جين واحد في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يمكن تقدير التباين في التعبير الجيني، وأن هناك حاجة إلى خلايا متعددة للاختبار واحد. وهذا يؤدي إلى قياس متوسط ​​التعبير الجيني للسكان. عند تقييم أعداد كبيرة من الجينات، يصبح RT-QPCR وقت-، reagent-، وطريقة تستغرق العينة. وبالتالي، فإن المفاضلة تحد من عدد الجينات أو السكان الخلية التي يمكن تقييمها، مما يزيد من خطر المفقودين الصورة العالمية.

توضح هذه المخطوطة كيف حيدة الخلية متعدد RT-QPCR يمكن استخدامها للتغلب على هذه القيود. وقد استفادت هذه التقنية من على microfluidics مؤخرا التقدم التكنولوجي 1 و 2. ردود الفعل التي تحدث في متعدد رقائق RT-QPCR لا غير شاملالعيدين المستوى نانولتر. وبالتالي، التعبير الجيني وحيدة الخلية، وكذلك التعبير الجيني متعددة في وقت واحد، لا يمكن أن يؤديها في reagent-، sample-، وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. فمن الممكن لاختبار الجينات الخلوية توقيع التجانس على مستوى نسيلي بين مجموعات فرعية خلية ضمن مجموعة من السكان في مراحل النمو المختلفة أو في ظل ظروف مختلفة 4، 5. العمل على السكان نادر مع أعداد كبيرة من الشروط على مستوى خلية واحدة لم يعد قيدا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق على نحو متزايد الخلايا اللمفاوية الفطرية (الاستقصائية). وعلى الرغم من عدم وجود مستقبلات مستضد معين، وأنها تنتمي إلى سلالة اللمفاوية وتمثل حراس مهم لتوازن الأنسجة والالتهابات. وتنقسم الاستقصائية حاليا إلى ثلاث مجموعات على أساس التعبير عنها من مجموعات محددة عامل النسخ وعلى قدرتها على إنتاج السيتوكينات 6 و 7.

تساهم الاستقصائية إلى العديد من حالات التماثل الساكن والفيزيولوجية المرضية في أجهزة متنوعة عبر إنتاج السيتوكينات محددة 8 و 9. لتكون قادرة على فهم دور هذه الخلايا، فمن المهم تحديد مختلف المجموعات السكانية الفرعية مؤتمر العمل الدولي في الجهاز وتحديد العلاقات التنموية. وبالإضافة إلى ذلك، تم المتعلقة ظواهر اللدونة بين مجموعات فرعية مختلفة. من خلال دراسة التباينمن الخلايا الموجودة في الجهاز واحد، فمن الممكن لتحديد مراحلها من النضج وللتمييز وظائفها المحددة.

لتوضيح تقنية وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR، وقد تم اختيار الاستقصائية الكبدية، مع التركيز بشكل خاص على عدم التجانس في إطار المجموعة نفسها لجنة القانون الدولي (نوع 1 ILC) 10. أولا، من خلال استخدام التدفق الخلوي، وتميزت ثلاثة السكان لجنة القانون الدولي واضح في الكبد. تمثل مجموعة 1 مؤتمر العمل الدولي حوالي 80٪ من المستجيبات الفطرية، في حين أن اثنين من السكان الآخرين نادرة السكان لجنة القانون الدولي الكبدي (أقل من 5٪ من المستجيبات الفطرية). تم فرز هؤلاء السكان باستخدام أعرب على نطاق واسع علامات سطح الخلية من السكان لجنة القانون الدولي. ونتيجة لذلك، تم فرزها السكان لجنة القانون الدولي في الكبد تبدو واحدة مماثلة على نطاق واسع إلى آخر.

وقد ظهرت وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR باعتبارها واحدة من أفضل التقنيات لتحقيق على وجه السرعة عدم تجانس هؤلاء السكان 11 . يتم تحديد اثنين من الخصائص الرئيسية من خلال الاستفادة من وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR التقنية. أولا، من خلال النظر في مستوى نسيلي، فمن الممكن لاستعادة التعبير الجيني خلية محددة للمقارنة بين الخلايا التي تعرض على ما يبدو مراحل نمو مماثلة. ثم، من خلال النظر في مجموعة مختارة مسبقا من التعبير الجيني، وسوف نحدد التوقيعات وراثية جديدة استنادا إلى أنماط التعبير الجيني في وقت واحد في نقطة مرة واحدة. هذه الجوانب تسمح جمع مجموعة متنوعة واسعة من البيانات التعبير لعدد كبير من الخلايا، حتى على السكان نادر الحدوث حيث يتم تنفيذ هذه التقنية على مستوى نسيلي. وبالتالي، عدم التجانس لجنة القانون الدولي في الكبد ويمكن تقييم كاف.

بعد ذلك، عن طريق فرز جميع الخلايا مع النمط الظاهري لجنة القانون الدولي العالمي، ويتم الحصول على نظرة واسعة للتعبير متعددة الجينات الكبد السكان لجنة القانون الدولي، على الرغم من أنها تمثل السكان نادرة للغاية. رقاقة القائم على ميكروفلويديك يسمح التجريب مع حتىكمية صغيرة من مادة الخلية. ونتيجة لذلك، فإن ملامح التعبير الجيني للسكان الخلية نادرة يمكن الحصول. استخدام الانترنت التوقيع الجيني برامج التحليل، مجموعات السكان الخلية والعلاقات المحتملة للخلايا يمكن التحقيق فيها. ونتيجة لذلك، الاختبارات الوظيفية لا يمكن أن يؤديها للتحقق من صحة البيانات التجميع على مستوى في الجسم الحي.

يمكن تقييم عشرات من تعبيرات الجين الوقت نفسه على مئات أو أكثر من الخلايا واحدة على الشريحة نفسها 3 و 11 و 12. تصميم الاختبار هو أطول وأهم جزء من التجربة. تحديد الجينات ذات الصلة لفرضية لفحصها هو الهدف الأسمى للحصول على نتائج ذات الصلة. ثانيا، هناك حاجة إلى الرقابة الداخلية (مثل علامات سطح معروفة تستخدم لفرز) وضوابط محددة. هذا أمر بالغ الأهمية لاختبار خصوصية التمهيدي التضخيم، وكفاءة التضخيم، وركان غياب المنافسة التمهيدي. لذلك، والعمل مع وحيد الخلية متعدد RT-QPCR هو أسلوب للوقت، كما يتم تقييم التعبير متعددة الجينات في خلية في نفس الوقت.

باستخدام نفس رقاقة ومزيج من المواد الكيميائية لجميع خلايا يحد من الأخطاء المحتملة من التلاعب ويسمح لاستنساخ بين العينات. وإجمالا، فإن جوانب مختلفة من وحيد الخلية متعدد RT-QPCR تسمح لإنتاج نتائج موثوق بها للغاية على مستوى نسيلي، مع مستوى كبير من الحساسية لمجموعة واسعة من العينات والجينات. النتائج التي تم الحصول عليها توفر بيانات قوية ومتينة للاختبارات الإحصاء الحيوية.

ويمكن تحقيق ذلك بسبب الجانب ميكروفلويديك من طريقة، والذي يسمح للعمل على كميات صغيرة جدا من المواد ويؤدي إلى نتائج شاملة. وأخيرا، وذلك باستخدام البرمجيات عبر الإنترنت، فمن الممكن المقارنة بين السكان المطلوب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة السلامة معهد باستور وفقا لوزارة الزراعة الفرنسية وإرشادات الاتحاد الأوروبي.

1. إعداد 96-جيدا وحيدة الخلية الفرز لوحة

  1. تحضير مزيج ما قبل التضخيم في أنبوب 1.5 مل بإضافة 5.0 ميكرولتر من العازلة محدد الرجعية النسخ، 1.3 ميكرولتر من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل المنخفض (EDTA) TE العازلة (10 ملي TE الحل، ودرجة الحموضة 8، والحل 0.1 ملي EDTA؛ 0.2 ميكرومتر تصفيتها )، و 0.2 ميكرولتر من طق الحمض النووي بوليميريز لكل بئر (الشكل 1A).
  2. في لوحة 96-جيدا، وتوزيع 6.5 ميكرولتر من مزيج ما قبل التضخيم في كل بئر (تصل إلى 48 بئرا). هذه اللوحة هي 96-جيدا خلية واحدة لوحة الفرز.
    ملاحظة: استخدام ماصة الالكترونية يوصى به لهذا البروتوكول. انها تسمح لقياس حجم دقيقة وقابلة للتكرار ويوفر الوقت.

figure-protocol-1
(أ) على خلية واحدة 96-جيدا الفرز لوحة، ويتم توزيع المزيج قبل التضخيم لأول مرة، يليه مزيج 0.2x الفحص. (ب) يجب أن تبقى وسجل كل موقف وحيدة الخلية في جدول بيانات. وتسمى أيضا دون خلية "لا دخل" بشكل جيد، ويمكن استخدامها كعنصر تحكم. صفين يمكن أن يدخر للسيطرة على كفاءة التمهيدي مع [كدنا التخفيف (متسلسلة واحد من كل عشرة التخفيفات من ما يعادل 10 5 الخلايا لخلية واحدة). (ج) على لوحة فحص 96-جيدا، ويتم توزيع كاشف فحص التحميل أولا، تليها إضافة الاشعال. لا ننسى أن تبقي تخطيط كل موقف التمهيدي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. و>

  1. إعداد مزيج 0.2x فحص في أنبوب 1.5 مل بإضافة 1.4 ميكرولتر من كل التمهيدي (الاشعال 20x و، تصل إلى 48 تحقيقات مختلفة؛ انظر الجدول 1). ضبط الحجم النهائي إلى 140 ميكرولتر مع انخفاض عازلة EDTA TE.
  2. توزيع 2.5 ميكرولتر من مزيج 0.2x الفحص إلى 48 بئرا في لوحة 96-جيدا وحيدة الخلية والفرز التي تحتوي على مزيج ما قبل التضخيم.
    ملاحظة: الحجم النهائي في كل بئر من لوحة عينة 96-جيدا ينبغي أن يكون 9 ميكرولتر.
  3. ختم لوحة مع فيلم الغطاء. دوامة لوحة وتدور عليه في 280 x ج لمدة 45 ثانية. تخزين 96-جيدا وحيدة الخلية لوحة الفرز في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

2. تفكك خلية واحدة

  1. باستخدام نظام تسليم CO 2، الموت ببطء الماوس عن طريق نقص الأكسجة. إصلاح الماوس على لوحة تشريح وفتح التجويف البريتوني طوليا باستخدام المقص.
  2. استعادة الاستقصائية من الكبد.
    1. قبل العزلة الكبد وتدفق وليفخلايا إيه-المتداولة.
      1. لاخراج الوريد البابي، نقل صغيرة والأمعاء الغليظة إلى الجانب الأيسر من الفأرة. يظهر الوريد البابي كأكبر الوريد في التجويف البريتوني.
      2. مع حقنة 10 مل و إبرة 0.45 ملم، مسح الكبد مع الفوسفات مخزنة المالحة المتوسطة (PBS) من خلال الوريد البابي. لتسهيل التنظيف الكبد، وقطع شريان المعدة مع مقص.
      3. لإزالة المرارة، قرصة قاعدة المرارة مع ملقط وفصلها عن الكبد مع مقص.
      4. لعزل الكبد، قرصة قاعدة الكبد مع ملقط، واستخدام مقص، فصل الكبد من بقية التجويف البريتوني.
      5. نقل الكبد في أنبوب بوتر مع 5 مل من المتوسط ​​المعهد التذكاري روزويل بارك (RPMI) 2٪ مصل العجل الجنين (FCS).
  3. فصل الكبد مع التفكك الميكانيكي باستخدام مدقة. نقل متوسطة إلى أنبوب 15 مل. جعل إجمالي حجمإلى 14 مل مع RPMI 2٪ FCS. ترك تعليق الخلية على الجليد لمدة 15-20 دقيقة إلى صب خلايا الكبد.
  4. استرداد طاف (بدون خلايا الكبد) في أنبوب 15 مل جديد باستخدام ماصة 1 مل (يمكن توقع 12 مل من طاف). تدور باستمرار في 120 x ج لمدة 7 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف بعد الطرد المركزي.
  5. resuspend الكرية حصلت عليه في الخطوة 2.4 في 14 مل من التدرج الكثافة المتوسطة (على سبيل المثال، Percoll 40٪). تدور باستمرار في 600 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. إزالة طاف بواسطة الطموح.
  6. resuspend الكرية في 1 مل من خلات البوتاسيوم (ACK). ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة، وجلب الحجم الإجمالي إلى 14 مل مع مملحة الحل هانك المتوازن (HBSS) 2٪ FCS. تدور باستمرار في 120 x ج لمدة 7 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف.
  7. وصمة عار على الخلايا.
    1. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز (انظر الجدول المواد، إضافة كافة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز تذكرإد) ونقل الخلايا في 1.5 مل أنبوب. ترك الأمر في الظلام لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    2. جعل إجمالي حجم 1 مل مع HBSS 2٪ FCS. تدور باستمرار في 120 x ج لمدة 7 دقائق في 10 درجة مئوية. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة إلى جانب تألقي وstreptavidin ملون تألقي مترافق (انظر الجدول المواد، إضافة كافة الأجسام المضادة تألقي يقترن ذكرها). ترك الأمر في الظلام لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. جعل إجمالي حجم 1 مل مع HBSS 2٪ FCS. تدور باستمرار في 120 x ج لمدة 7 دقائق في 10 درجة مئوية. إزالة طاف باستخدام ماصة 1 مل. resuspend الكرية في 1 مل HBSS ويوديد propidium (بي. 1: 4000).
    ملاحظة: عند استخدام علامات سطح الخلية لجنة القانون الدولي أعرب على نطاق واسع، يتم تعريف 3 السكان: NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +، وNKp46 - IL-7Rα +. يتم فرز جميع السكان النسب - CD3 - CD4 - CD45.2 +.

3. وحيدة الخلية مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)

  1. استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لفرز الخلايا واحد (13).
    ملاحظة: يمكن فرز أنواع الخلايا المختلفة على نفس 96-جيدا لوحة الفرز وحيدة الخلية (الشكل 2).
    1. استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لفرز خلية واحدة لكل تحتوي أيضا على مزيج 0.2x فحص والمزيج قبل التضخيم على 96-جيدا لوحة الفرز وحيدة الخلية. استخدام الطازجة 96-جيدا وحيدة الخلية لوحة الفرز أو ذوبان الجليد لو المخزنة في -20 درجة مئوية.
      1. وضع ختم لوحة 96 جيدا على حامل لوحة FACS. استخدام فارغة لوحة 96-كذلك اختبار. وضع لوحة مع A1 جيدا على اليسار ونحو مجرب.
      2. ضبط حامل لوحة للحصول على قطرة في وسط A1 جيدا مع حبات التحقق.
      3. كرر الخطوة 3.1.1.2 مع جميع الآبار في خط أ.
      4. إزالة ختم من لوحة 96-جيدا ونوع 100 حبات التحقق لكل بئر. تحقق من دتشكيل شرطة عمان السلطانية في وسط الآبار.
      5. عندما تعديلها بشكل صحيح، وضع 96-جيدا وحيدة الخلية فرز لوحة على حامل لوحة. رسم تخطيط لوحة ونوع 1 خلية لكل بئر.
        ملاحظة: تحديد المواقع المناسبة من كل خلية على لوحة فرز 96-جيدا خلية واحدة أمر ضروري. يجب أن تبقى هناك تخطيط لوحة على برنامج جداول البيانات. سيتم استخدام تخطيط لوحة في الخطوات القليلة القادمة (الشكل 1B) 14. ترك واحدة تحتوي على مزيج جيد 0.2x فحص ومزيج ما قبل التضخيم على لوحة عينة 96-جيدا دون الخلايا. ويستخدم هذا فضلا عن سيطرة أي من المدخلات. ترك صفين من 6 آبار لتخفيف كدنا]. وتستخدم هذه الآبار والضوابط للكفاءة التمهيدي (الشكل 1B).
      6. تخزين 96-جيدا وحيدة الخلية لوحة الفرز في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

4. قبل التضخيم

  1. استخدام الفرز وحيدة الخلية لوحة OBT طازجة أو إذابة 96-جيداained في خطوة 3.1.1.6. دوامة لوحة وتدور عليه (280 x ج لمدة 45 ثانية).
  2. وضع 96-جيدا وحيدة الخلية فرز لوحة على thermocycler. أداء النسخ العكسي وقبل التضخيم حسب البرنامج المذكور في الشكل 3 والجدول 2.

figure-protocol-2
الشكل (3): برنامج ما قبل التضخيم. من أجل الحصول على ما يكفي من المواد، مطلوب قبل التضخيم من الجينات المستهدفة المحددة على الخلايا وحيدة تم فرزها. يتم تحميل 96-جيدا خلية واحدة لوحة الفرز على thermocycler لمتابعة برنامج ما قبل التضخيم. ثم يتم تخفيفه المنتجات قبل التضخيم مع العازلة TE منخفضة EDTA ويمكن استخدامها على الفور أو تجميدها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تمييع ما قبل أمبيرlified عينات عن طريق إضافة 36 ميكرولتر من انخفاض عازلة EDTA TE في كل بئر.
  2. ختم لوحة مع فيلم الغطاء. دوامة لوحة وتدور عليه (280 جرام لمدة 45 ثانية). تخزين، 96-جيدا وحيدة الخلية لوحة فرز تضخيم ما قبل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

5. إعداد لوحة عينة 96-جيدا

  1. إعداد 191 ميكرولتر من مزيج الرئيسي بإضافة 175 ميكرولتر من مزيج الرئيسي QPCR و 17.5 ميكرولتر من كاشف تحميل عينة.
  2. في لوحة 96-جيدا جديدة وتوزيع 3.6 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر (تصل إلى 48 بئرا). هذا هو لوحة عينة 96-جيدا.
  3. نقل 2.9 ميكرولتر من تضخيم ما قبل كدنا] من لوحة عينة 96-جيدا لوحة 96-جيدا جديدة. الحفاظ على نفس الموقف لكل عينة بين الخلية فرز 96 لوحة واحدة ولوحة عينة 96-جيدا.
  4. ختم لوحة مع فيلم الغطاء. دوامة لوحة وتدور عليه (280 x ج لمدة 45 ثانية). ضع جديدة لوحة 96 جيدا على الجليد محمية من الضوء. تخزين 96-جيدا الصورةلوحة واسعة في -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

6. إعداد لوحة الفحص جيدا 96

  1. في لوحة 96-جيدا جديدة وتوزيع 3 ميكرولتر من كاشف فحص تحميل في كل بئر (تصل إلى 48 بئرا). ويطلق على لوحة فحص 96-جيدا هذه اللوحة.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من التمهيدي إلى كل بئر. الحفاظ على تخطيط على برنامج جداول البيانات (الشكل 1C والجدول رقم 1، واستخدام كل الاشعال المدرجة في الجدول 1). وتحديد المواقع المناسبة من كل التمهيدي على لوحة فحص 96-جيدا هو ضروري لالخطوات القليلة القادمة.
    1. إذا كان عدد العينات أقل من 48، وإضافة الماء بدلا من التمهيدي إلى الآبار غير المستخدمة.
  3. ختم لوحة مع فيلم الغطاء. دوامة لوحة وتدور عليه (280 x ج لمدة 45 ثانية). متجر لوحة فحص 96-جيدا عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
    ملاحظة: لتجنب تجميد المتكررة وذوبان الاشعال وتوزيع الاشعال لمزيج قبل التضخيم ول-أهلا وسهلا 96ل لوحة فحص في نفس الوقت.

7. وحيدة الخلية الجينات التعبير رقاقة

  1. ضع دائرة ميكروفلويديك متكاملة (IFC) على مقاعد البدلاء والتحقق من الصمامات باستخدام حقنة توج. فتح حقنة، وضعه عموديا على صمام، واضغط بشدة. يجب أن تتحرك يا الدائري. ملء رقاقة مع السائل خط السيطرة (0.3 مل من السلين).
  2. كرر الخطوة 7.1 مع صمام الثاني.
    ملاحظة: يجب أن يكون تسرب السائل لا على رقاقة.
  3. إزالة الفيلم الأزرق من الجزء السفلي من الشريحة. تحميل رقاقة في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية. على الشاشة تحكم مؤسسة التمويل الدولية، حدد "برايم" ثم "تشغيل". السيطرة على خطوط ميكروفلويديك تستمر 10 دقيقة.
  4. إخراج رقاقة وإعادة ختم الفيلم الأزرق في الجزء السفلي من الشريحة.

figure-protocol-3
الشكل (4): وحيدة الخلية تعدد الإرسال الجينات التعبير رقاقة التحميل. تتطلب هذه الخطوات زالدقة ريت، خصوصا أثناء نقل لوحة 96-جيدا إلى خلية واحدة تعدد الإرسال رقاقة الجينات التعبير. لتجنب الأخطاء التحميل وmisplacements، فإنه ينصح بشدة على العمل بالتتابع. يجب السيطرة على حجم اتخاذها من أجل كل نقل أثناء عملية pipetting ل. وأخيرا، من المهم تجنب أي فقاعات ولإزالتها في حال تشكيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستخدام ماصة 8 قنوات، نقل 5 ميكرولتر من لوحة فحص 96-بشكل جيد على الجانب A1 (الجانب الأيسر) من رقاقة. ملء الجانب الأيسر من الشريحة، كما هو مبين في الشكل (4). كن حريصا على رسم دائما نفس الحجم في النصائح.
    1. لا خلق فقاعات. إذا ظهرت فقاعات، وإزالتها باستخدام 10 نصائح ميكرولتر. تغيير نصائح لكل بئر من الشريحة.
  2. كرر الخطوة 7.5 على حق والجانب سو الشريحة باستخدام 5 ميكرولتر من لوحة عينة 96-جيدا.
  3. إزالة الفيلم الأزرق من الجزء السفلي من الشريحة. تحميل رقاقة في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية. على الشاشة تحكم مؤسسة التمويل الدولية، حدد "تشغيل هذا البرنامج النصي" ثم "تشغيل". تحميل خطوط ميكروفلويديك يستمر 45 دقيقة.
  4. إخراج رقاقة وإعادة ختم الفيلم الأزرق في الجزء السفلي من الشريحة.

8. تشغيل رقاقة

  1. على الكمبيوتر QPCR ميكروفلويديك، حدد "جمع البيانات" البرمجيات. بمجرد أن يبدأ، حدد "تشغيل جديد."
  2. حدد "إخراج" إزالة الفيلم الأزرق من الجزء السفلي من الشريحة، وتحميل رقاقة. وضع رقاقة للحصول على A1 جيدا على اليسار ونحو مجرب.
  3. على "إعداد مشروع"، حدد "لا شيء" ثم "التالي".
  4. حدد "تشغيل جديد رقاقة"، "دليل رقاقة جديد" (إنشاء مجلد للتجربة)، و "التالي".
  5. على "التعبير الجيني" حدد "،؛ السلبي إشارة = ROX "(كربوكسي-X-رودامين) و" التحقيق واحد، "حدد تصفية الصحيح وفقا لالاشعال اختر" التالي ".
  6. حدد "استعراض" وحدد البرنامج الصحيح وفقا لالاشعال المستخدمة.
    ملاحظة: "الافتراضي-10min-Hotstart.pcl" هو برنامج الأكثر استخداما لوحيدة الخلية متعدد RT-QPCR.
  7. حدد "ابدأ تشغيل". رد فعل يستغرق حوالي 90 دقيقة.
  8. بمجرد الانتهاء، حدد "إخراج-تم."

تحليل 9. البيانات

  1. فتح البرنامج "في الوقت الحقيقي تحليل PCR"، حدد "ملف" و "فتح"، العثور على مجلد التجربة، وحدد "ملف ChipRun.bml."
  2. انقر على "تحليل عرض،" "جدول نتائج"، و "عرض خريطة الحرارة." صناديق تحمل علامة "X" هي دون مستوى الكشف عن عتبة و / أو كان منحنيات التضخيم سيئة.
  3. اسم العينات. انتقل إلى "إعداد نموذج" وقانون حالة الطوارئإلخ "96. SBS جديد" انقر على "التخطيط" وحدد "..." نسخ ولصق بتصاميم عينة من برنامج جداول البيانات. تعريف التخطيط الذي تم لصقه ب "اسم عينة".
  4. اسم المقايسات. كرر الخطوة 9.3 مع أسماء التمهيدي في "إعداد الكاشف". تعريف التخطيط الذي تم لصقه ب "اسم الكاشف".
  5. انقر على "وجهة نظر التحليل" و "تحليل"؛ ويمكن أن يعزى أسماء عينة والتمهيدي تلقائيا إلى عينات والاشعال (الشكل 7).
  6. حساب ط، ط دلتا، وأضعاف التغيير من أجل كل عينة. استخدام الجينات التدبير المنزلي بوصفه الرقابة الداخلية (هنا، GAPDH):
    ΔCt = ط م عينة - الرقابة الداخلية ط م
    أضعاف تغيير = 2 - (مراقبة ΔCtsample-ΔCtnegative)
    1. انقر على "الإعداد للكشف عن" وحدد بشكل جيد مع أي مراقبة المدخلات (استخدام الجينات التدبير المنزلي بوصفه الرقابة الداخلية لتطبيع التعبير الجيني). حدد "Editor "،" تحديد المرجع "، و" تحديث ".
    2. تحديد جميع الآبار التي سيتم تطبيق الرقابة الداخلية المحددة أعلاه. حدد "محرر" و "تحديد مثل اختبار". تحديد الجين إشارة المناسب ثم انقر فوق "تحديث".
    3. حدد "إعداد نموذج" لتحديد سيطرة سلبية أيضا. حدد "محرر" وتحديد "مرجع". انقر على زر "تحديث".
    4. حدد "تحليل عرض" و "تحليل"؛ سيتم تلقائيا احتساب دلتا ط م وتغيير أضعاف.
  7. تصدير البيانات. حدد "ملف" و "التصدير، حفظ باسم" نتائج الجدول "، حدد مجلد وجهة، وضرب" حفظ "و" الخروج ".
  8. كرر الخطوة 9.7، ولكن بدلا من "نتائج الجدول،" حفظ باسم "نتائج خريطة التمثيل اللوني."

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكان اللمفاوية عرض تنوع كبير في التعبير الجيني. في هذا البروتوكول، وكان التحقيق عدم التجانس الكبد مقصورة لجنة القانون الدولي باستخدام وحيدة الخلية متعدد التعبير الجيني RT-QPCR. وخلافا للتقنيات التعبير الجيني أخرى، وحيدة الخلية متعدد التعبير الجيني RT-QPCR يسمح العمل على العديد من السكان، حتى أندر، في نفس الوقت. هذه الخصوصية، إلى جانب وجود حساسية عالية على مستوى نسيلي، تتيح للتحقيق في الاختلافات في التواقيع الجينات بين السكان وبين السكان نادرة. وك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على معلومات شاملة التعبير الجيني على مستوى نسيلي. هنا، ونحن التحقيق الكبد لجنة القانون الدولي عدم التجانس المقصورة. بعد الفرز وحيدة الخلية من السكان لجنة القانون الدولي مختلف (على أساس علامات سطح مؤتمر العمل الدولي أعرب على نطاق واسع)، وعينات تم قبل تضخيم للجينات محددة مسبقا محددة. ثم، تم تحميل كدنا] والاشعال الحصول على وRT-QPCR رقاقة ميكروفلويديك متعددة. وأخيرا، حصلنا على التعبير من 48 جينات مختلفة من 48 خلايا مفردة. وقد تم تحليل النتائج التعبير ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل معهد باستور، INSERM، جامعة باريس ديدرو، ووزارة البحوث (إلى S.C.)؛ وجمعية البحث عن السرطان (إلى S.C. و R.G.)؛ برنامج الاستثمار المستقبلي REVIVE والوكالة الوطنية للأبحاث (ANR؛ منحة "Twothyme" إلى A.C.)؛ منحة ANR "Myeloten" (إلى R.G.) ؛ والمعهد الوطني للسرطان (دور البيئة المكروية المناعية أثناء تسرطن الكبد ، إلى R.G.). نعرب عن تقديرنا لمنصة مركز المناعة البشرية وقياس الخلايا في معهد باستور لدعمهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

مجموعة العلمي

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cells Direct One Step qRT-PCRللأنظمة الحيوية التطبيقية 11753100مجموعة الكشف عن مسبار التمهيدي. يحتوي على مزيج تفاعل 2x ، إنزيم SSIII Platinium.
Low TE EDTA BufferAffymetrix75793 100ML
96 بئر ألواحThermofisher ScientificAB 110096 بئر تتكيف مع فرز الخلايا والحرارة
فيلم الغطاءDominique Dutscher106570فيلم غطاء الألومنيوم ؛ تجنب التلوث والتبخر
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x primer
AesThermofisher ScientificMm01148854_s120x التمهيدي
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x التمهيدي
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s1 20x التمهيدي
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x التمهيدي
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x التمهيدي
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x التمهيدي
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s1 20x التمهيدي
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x التمهيدي
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x التمهيدي
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x التمهيدي
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x التمهيدي
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s1 20x التمهيدي
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x التمهيدي
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x التمهيدي
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x التمهيدي
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x التمهيدي
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x التمهيدي
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x
Il-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x برايمر
Il-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x برايمر
Il-1rl1Thermofisher ScientificMm00434237_s120x برايمر
Il-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x برايمر
Il-23rThermofisher ScientificMm00519943_s120x primer
Il-2raThermofisher ScientificMm01340213_s120x برايمر
Il-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x التمهيدي
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x التمهيدي
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x التمهيدي
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s1 20x التمهيدي
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s1 20x التمهيدي
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x التمهيدي
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x التمهيدي
روراThermofisher ScientificMm01173766_s120x التمهيدي
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x برايمر
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x برايمر
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x برايمر
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x برايمر
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x التمهيدي
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x التمهيدي
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x التمهيدي
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x التمهيدي
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x التمهيدي
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x التمهيدي
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x التمهيدي
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x التمهيدي
qPCR Master mix Applied BioSystemsP / N 4304437
2x فحص تحميل كاشفFluidigmP / N 85000736متوسط كثافة محددة لفحوصات التحميل في رقاقة الموائع الدقيقة RT-qPCR متعددة الإرسال.
2x كاشف تحميل العينةFluidigmP / N 85000735متوسط كثافة محددة لتحميل العينات في رقاقة الموائع الدقيقة RT-qPCR متعددة الإرسال.
48.48 رقاقة الموائع الدقيقة متعددة الميكروفيلداتFluidigmBMK-M-48.4848.48 مصفوفة ديناميكية IFC للتعبير الجيني ؛ رقاقة لتفاعل RT-qPCR متعدد الخلية
الواحدة 48.48 multiliplex RT qPCR وحدة تحكم رقاقة الموائعالدقيقة Fluidigm8900002048.48 وحدة تحكم IFC ؛ التحكم في نظام السوائل الداخلي للرقاقة ، وعينات التحميل والمقايسات في غرف التفاعل
متعددة RT qPCR ، cycler الحراري الموائعالدقيقة FluidigmGE48.4848.48 المصفوفة الديناميكية IFC thermocycler
96 بئر لوحاتThermofisher ScientificAB 1100ألواح 96 بئرا مكيفة لفرز الخلايا وإعادة التدوير الحراري
C57Bl / 6 فئرانجانفييهC57Bl / 6 miceJ@RJ
10 مل حقنةBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio Abcysالقياسية مصل العجل الجنين
أنبوب بوترN / A
أنبوب 15 ملCorning352097
1.5 مل أنبوبSigma-AldrichT9661-1000EA
FACSآلة N / A
جهاز طرد مركزي 75004538Thermofisher Scientific
1,000 & micro; ل نصائحفيشر 10313272
P1000 & nbsp ؛جيلسونF123602
بيركولدومينيك دوتشر17-0891-01
أنبوب فاكسفالكون352235
الأجسام المضادة للفأر البيوتينالمضادة للفأر سوني1103520النسب الجسم
المضاد المضاد CD19 البيوتين الجسم المضاد للفأرسوني1177520النسب الجسم المضاد
المضاد TCRab Biotin الفأرBioLegend109204النسب الجسم المضاد
المضاد TCRgd البيوتين الجسم المضاد للفأرBD Biosciences553176النسب الجسم المضاد
المضاد Ter119 البيوتين الجسم المضاد للفأرBD Biosciences553672النسب الجسم المضاد
المضاد ل Gr1 البيوتين الجسم المضاد للفأرBD Biosciences553125النسب الجسم المضاد
المضاد CD45.2 PerCPCy5.5 الجسم المضاد للفأرBioLegend109828
الأجسام المضادة للفأر المضادة للفأر المضادة ل IL7ra PeCy7ebioSciences25-1271-82
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل CD3 BV510BD Biosciences563024
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل CD4 BV786BD Biosciences563727
الأجسام المضادة للفأر المضادة ل NKp46 PEebioSciences12-3351-82
StreptavidinSony2626025
بروبيديوم يوديدسيجما-ألدريتشP4864-10ML
ماصة إلكترونيةEppendorf4986000017
Combitips 0.1 ملماصة Eppendorf30089405
متعددة القنواتRaininL8-10XLS +
AccudropBD Biosciencesحبات التحقق 345249 ل FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell Gene ExpressionMultiplex RT qPCRRare Lymphoid PopulationsInnate Lymphoid CellsHepatic ILC CompartmentFluorescence activated Cell SortingMicrofluidic qPCR ChipPre amplification MixGene Expression HeterogeneityReal time PCR Analysis

Related Articles