مقالة منهجية

3D الكمي في السيليكو النمذجة (q3DISM) من الدماغيه اميلويد بيتا البلعمة في نماذج القوارض من مرض الزهايمر

DOI:

10.3791/54868

⸱

ديسمبر 26, 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير منهجية ل3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) من دماغي اميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر. ويمكن تعميم هذه الطريقة لتحديد الكميات من أي بلعمة تقريبا في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم الاعتراف Neuroinflammation الآن باعتباره عاملا مسببا رئيسيا في الأمراض العصبية التنكسية. البالعات وحيدات النوى هي الخلايا المناعية الفطرية المسؤولة عن البلعمة وإزالة الأنقاض والمخلفات. وتشمل هذه الخلايا الضامة الجهاز العصبي المركزي المقيمين المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة، والبالعات وحيدات النوى التسلل من المحيط. وعموما استخدمت المجهر الضوئي لتصور البلعمة في القوارض أو عينات الدماغ البشري. ومع ذلك، لم تقدم الطرق النوعية دليل قاطع في الجسم الحي البلعمة. هنا، نحن تصف 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM)، وسيلة قوية تسمح الكميات 3D الحقيقية للاميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في القوارض مرض الزهايمر (AD) نماذج. الطريقة ينطوي على fluorescently تصور Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي في أقسام الدماغ القوارض. مجموعات البيانات مبائر كبيرة زي الأبعاد ثم يتم بناؤها 3D لتحديد الكميات من A &# 946؛ colocalized مكانيا داخل يحلول يبلوعي. ونحن لشرح التطبيق الناجح لq3DISM إلى الماوس والفئران العقول، ولكن يمكن تمديد هذه المنهجية إلى أي بلعمة تقريبا في أي نوع من الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الزهايمر (AD)، والأكثر شيوعا المرتبطة بالعمر الخرف 1، يتميز تراكم الدماغية اميلويد β (Aβ) كما ويحات "خرف"، β اميلويد، المزمن neuroinflammation على مستوى منخفض، tauopathy، وفقدان الخلايا العصبية، واضطراب الإدراك 2 . في ميلادي أدمغة المرضى، وخصصت neuroinflammation بواسطة الخلايا النجمية والبالعات وحيدات النوى رد الفعل (ويشار إلى الخلايا الدبقية الصغيرة، على الرغم من المركزية مقابل الأصل المحيطي يزال غير واضح بهم) المحيطة الودائع Aβ 3. كما رقيب المناعة الفطرية للجهاز العصبي المركزي، يتم وضع الخلايا الدبقية الصغيرة مركزيا لمسح الدماغ Aβ. ومع ذلك، ويرافق التوظيف دبقية لويحات Aβ بواسطة القليل جدا، إن وجدت، Aβ البلعمة 4،5. فرضية واحدة هي أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي اعصاب في البداية من قبل phagocytozing التجمعات الصغيرة من Aβ. ومع ذلك، في نهاية المطاف هذه الخلايا تصبح السمية العصبية كما عبء Aβ ساحق و / أو د الوظيفي المرتبط بالعمرecline، يثير الخلايا الدبقية الصغيرة في النمط الظاهري proinflammatory مختلة وظيفيا، والمساهمة في العصبية والمعرفية تراجع 6.

وقد حددت الدراسات رابطة الجينوم على نطاق الأخيرة (GWAS) مجموعة من الأليلات خطر م ينتمون إلى جوهر مسارات المناعية الفطرية 7 التي تعدل البلعمة 8-11. ونتيجة لذلك، أصبحت الاستجابة المناعية لترسب الأميلويد في الدماغ وهي منطقة رئيسية من الاهتمام، سواء من حيث فهم المسببات م ولتطوير أساليب علاجية جديدة 12-14. ومع ذلك، وهناك حاجة ماسة إلى منهجية لتقييم البلعمة Aβ في الجسم الحي. لتلبية هذه الحاجة غير الملباة، وقد وضعنا 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) لتمكين الحقيقية الكميات 3D من الدماغ البلعمة Aβ بواسطة البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر تشبه.

قلة فقط من المدى الذي ألخص المرض، والنماذج الحيوانية لهاثبت لا تقدر بثمن لفهم م pathoetiology ولتقييم العلاجات التجريبية. ونظرا لحقيقة أن الطفرات في الجينات Presenilin (PS) واميلويد السلائف البروتين (APP) يسبب بشكل مستقل وراثي جسمي م، وقد استخدمت هذه الجينات المحورة متحولة على نطاق واسع لتوليد نماذج القوارض المعدلة وراثيا. الفئران المعدلة وراثيا APP / PS1 coexpressing في وقت واحد "السويدي" متحولة APP البشري (سوي APP) وΔ اكسون 9 متحولة presenilin البشري 1 (PS1ΔE9) الحالي مع الداء النشواني الدماغي المتسارع وneuroinflammation 15،16. وعلاوة على ذلك، ونحن قد ولدت الفئران المعدلة وراثيا ثنائية coinjected مع APP سوي ويبني PS1ΔE9 (خط TgF344-AD، على خلفية فيشر 344). وخلافا للنماذج الماوس المعدلة وراثيا من الداء النشواني الدماغي والجرذان TgF344-AD تطوير اميلويد في الدماغ التي تسبق tauopathy، وفقدان أفكارك من الخلايا العصبية، وضعف السلوكي 17.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول للIMMunostaining الخلايا الدبقية الصغيرة، جسيم حال بلعمي ودائع Aβ في أقسام الدماغ من الفئران APP / PS1 والجرذان TgF344-AD، والحصول على الصور مبائر كبيرة زي الأبعاد. نحن من التفصيل في توليد وتحليل عمليات إعادة البناء 3D الحقيقية من مجموعات البيانات مبائر يسمح الكميات من Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي دبقية SILICO. وعلى نطاق أوسع، ومنهجية أننا التفاصيل هنا يمكن أن تستخدم لقياس تقريبا أي شكل من أشكال البلعمة في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل في هذه الوثيقة من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، وأجرى بما يتفق بدقة مع المعاهد الوطنية للإرشادات الصحة والتوصيات الصادرة عن جمعية للتقويم والاعتماد للمختبر: بيان من أخلاقيات البحث رعاية الحيوان الدولية.

1. القوارض عزل الدماغ والتحضير لالمناعية

اليوم 1:

  1. ضع الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران TgF344-AD (من العمر 14 شهرا) أو APP / الفئران PS1 (عمره 12 شهرا) تحت التخدير المستمر الأيزوفلورين العميق (4٪). تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميها، وعدم وجود رد فعل الانسحاب.
  2. قطع طريق جانبي القفص الصدري ورفع لفضح القلب. إدراج 23 G الإبرة في البطين الأيسر من القلب وإجراء شق صغير في الأذين الأيمن. انتقل إلى استنزاف من قبل نضح transcardial مع الفوسفات مخزنة المالحة المثلج(PBS) باستخدام مضخة تحوي (30 مل للفئران، 150 - 200 مل بالنسبة للفئران).
  3. جعل شق خط الوسط الذيلية في الجلد ونقل الجلد والعضلات جانبا. قطع طريق الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط وبين العينين. إزالة لوحات العظام وعزل كامل الدماغ من الجمجمة.
  4. وضع الدماغ في الاكليلية مصفوفة الدماغ القوارض وشريحة إلى أرباع. احتضان أرباع الخلفية O / N (16 ساعة) في تثبيتي بارافورمالدهيد (4٪ PFA في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية. غسل 3X في برنامج تلفزيوني، ونقل بعد ذلك إلى 70٪ من الإيثانول. تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها تحت غطاء الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

يوم 2:

  1. ضع أرباع الدماغ إلى أشرطة تضمين وتدريجيا يذوى الأنسجة في أكثر تركيزا على التوالي الحمامات الايثانول 1 ساعة (70٪، 80٪، 95٪، و 100٪ X3).
  2. الإيثانول واضح من الأنسجة مع ثلاثة حمامات زيلين 100٪ المتعاقبة (1 ساعة لكل منهما). تحذير: الزيلين غير سامة وSHولد التعامل معها تحت غطاء الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. تضمين الأنسجة في كتل البارافين بعد حمامات اثنين المنصهرة شمع البارافين (56-58 درجة مئوية، 90 دقيقة لكل منهما).

اليوم 3:

  1. قطع 10 أقسام ميكرون سميكة من العقول جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مشراح. أقسام تراجع في حمام مائي (50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)، وتنطبق على المجهر الشرائح. ترك الشرائح لتجف O / N، وضمان التصاق الأنسجة إلى الشريحة.

2. المناعية

ملاحظة: يمكن استخدام مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة لهذا الإجراء تلطيخ هو موضح أدناه. وترد الكوكتيلات الأجسام المضادة متوافقة مع أنسجة المخ من الجرذان والفئران في الجدول 1.

اليوم 4:

  1. Deparaffinize أقسام الدماغ باستخدام 2X حمامات زيلين 100٪ (12 دقيقة لكل منهما).
  2. ترطيب أقسام الدماغ في الحمامات الايثانول المتعاقبة - 100٪ لمدة 10 دقيقة، و 95٪ لمدة 5 دقائق، و 80٪ لمدة 10 دقيقة، وأخيرا 70٪ لمدة 15 دقيقة - اتباعها!د يغسل PBS 3X [5 دقائق على RT، مع الإثارة الخفيفة]. وفي الوقت نفسه، الحرارة استرجاع مستضد حل 95-97 درجة مئوية على طبق ساخن مع شريط التحريك المغناطيسي.
  3. احتضان أقسام الدماغ في مستضد حل استرجاع في 95-97 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، وغسل 3X في برنامج تلفزيوني (5 دقائق على RT، مع الإثارة الخفيفة).
  4. بسرعة الشرائح الجافة باستخدام مساحات مهمة حساسة لتجنب تجفيف الأنسجة، ورسم حاجز مسعور حول منطقة الأنسجة باستخدام قلم حاجز مسعور. ملء منطقة الأنسجة مطوقة مع عازلة تمنع [برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 و 10٪ عادي حمار المصل (NDS)]، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب.
  5. استبدال عازلة تمنع مع الأجسام المضادة الأولية Iba1 (المخفف في المخزن حجب) لتسمية البالعات وحيدات النوى، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب. المضيفين الأجسام المضادة والتخفيفات العمل، انظر الجدول رقم 1 وجدول المواد.

اليوم 5:

  1. شطفالأجسام المضادة الأولية مع حمامات 3X PBS (5 دقائق على RT مع الإثارة الخفيفة). احتضان مع الأجسام المضادة الفلورسنت الثانوي (مترافق مع fluorophore انبعاث 594 نانومتر) لمدة 1 ساعة (في عرقلة العازلة في RT في الظلام) تليها حمامات 3X PBS (5 دقائق على RT مع الإثارة الخفيفة). في هذا الوقت، والحفاظ على المقاطع في الظلام لتجنب تبييض إشارة الفلورسنت.

DAY 6-7:

  1. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 مع CD68 (أدمغة الفئران) أو LAMP1 (الأنسجة الماوس) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (إلى جانب وجود fluorophore انبعاث 488 نانومتر) لتسمية جسيم حال بلعمي.

DAY 7-8:

  1. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6 مع OC (أنسجة الفئران) أو 4G8 (أدمغة فئران) الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية المناسبة (بالإضافة إلى fluorophore 647 نانومتر) لتسمية الودائع Aβ.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة 6E10 بنجاح سواء على الماوس والفئران الأنسجة. لمجموعات الأجسام المضادة المناسبة، انظر جدول المواد .
  2. تسمح المقاطع لكامل يا جاف / N في RT في الظلام. ثم، غطاء عينات مع زلة تغطية مختومة من قبل مضان وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي دابي.

3. اكتساب كبير Z كومة متحد البؤر مجموعات البيانات

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب مؤتمتة بالكامل المسح بالليزر المجهر متحد البؤر مجهزة الهدف 60X و 405 نانومتر، 488 نانومتر، 594 نانومتر، والليزر 647 نانومتر. جميع أجهزة الكمبيوتر التي تسيطر عليها التصوير والمراقبة ليزر البرمجيات. قبل بداية بروتوكول التصوير، والطاقة على جهاز الكمبيوتر، مصباح epifluorescent، المجهر، وأشعة الليزر والكاميرا.

يوم 9:

  1. حدد الهدف المجهر 60X. إضافة زيت الغمر إلى العدسة، ووضع العينة على حامل المجهر مرحلة الشرائح. رفع الهدف حتى يجعل النفط اتصال مع الشريحة. ضبط البؤري لتحديد موقع اللويحات النشوانية في قرن آمون أو القشرة الدماغية باستخدام الإضاءة epifluorescent من خلال oculars.
  2. الحصول على ايم متحد البؤرالأعمار من البالعات وحيدات النوى تنشيط المحيطة الودائع اميلويد في قرن آمون أو قشرة من القوارض بواسطة المجهر متحد البؤر (60X التكبير، خطوات ض المكدس: 0.25 ميكرون <ض <0.40 ميكرون، عددا من الخطوات 25 <ن <35).

4. q3DISM

ملاحظة: من أجل تحقيق نتائج هامة، فإننا نقترح تحليل ما لا يقل عن 3 صور لكل حيوان / المنطقة من اهتمام. لكل صورة، وفرة من الخلايا لتحليل قد تختلف اعتمادا على النماذج التجريبية. في نتائج تمثيلية هو مبين في هذا التقرير، قمنا بتحليل 3 خلايا / حالة (على سبيل المثال، البالعات وحيدات النوى بعيدة عن أو المرتبطة ويحات، وانظر الأرقام 1C - D و2C - D).

اليوم 10:

  1. تحليل مجموعات البيانات متحد مع colocalization معالجة الصور 3D العلمي وتحليل البرمجيات (coloc) وحدة للقرب المكاني للIba1 / CD68 (أنسجة الفئران) أو Iba1 / LAMP1 (الأنسجة الماوس) تلطيخ في جميع الطائرات ض في وقت واحد.إنشاء إيبا + / CD68 + أو + إيبا / LAMP1 + colocalization القنوات التي تتوافق مع جسيم حال بلعمي داخل البالعات وحيدات النوى تفعيلها.
    1. اختر TRITC لقناة ألف (الموافق Iba1 تلطيخ جانب 594 نانومتر fluorophore) وFITC للقناة ب (الموافق CD68 أو تلطيخ LAMP1 إلى جانب 488 نانومتر fluorophore). على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج ل"وضع الاختيار، '' عتبة،" اختيار ول 'شدة coloc،' اختر 'قنوات المصدر'.
    2. انقر على "تحرير" لتحديد "اللون coloc" على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج.
    3. لكل قناة بشكل مستقل، وضبط عتبات لتشمل تلطيخ محددة واستبعاد / إشارات خلفية غير محددة. مرة واحدة تعديلها، لا تتغير عتبات بين الصور لضمان تحليل غير متحيز. سوف تظهر voxels colocalized (بكسل من كل مداخن ض) في اللون المحدد في الخطوة 4.1.2 في كل رزمة ض SIMultaneously.
    4. انقر على "بناء قناة coloc". سوف قناة colocalization إنشاؤها تظهر في إطار تعديل العرض.
    5. انقر على قناة coloc لفتح إحصاءات القناة. و'٪ من حجم / المواد ألف أعلاه عتبة colocalized "تمثل٪ من إشارة Iba1 (voxels المقابلة لfluorophore 594 نانومتر) colocalized مع LAMP1 أو إشارة CD68 (voxels المقابلة لfluorophore 488 نانومتر). ببساطة أكثر، وهذا هو حجم الوحيدات التي كتبها جسيم حال بلعمي (انظر الأرقام 1C و2C) المحتلة.
      ملاحظة: '٪ من حجم / المواد (ب) أعلاه عتبة colocalized "يناظر٪ من LAMP1 أو CD68 إشارة colocalized مع Iba1. وينبغي أن تكون قريبة من 100٪، كما جسيم حال بلعمي هي هياكل داخل الخلايا. تستند القيم على نسبة إشارة من كل مداخن ض فوق عتبة colocalized.
  2. باستخدام وحدة coloc، وتحليل قناة coloc بإنشائه في الخطوة 4.1 لقربها المكاني مع OC (الفئران منظمة الشفافية الدوليةssue) أو 4G8 (الأنسجة الماوس) إشارات Aβ. وهذا يسمح لتحديد الكميات من Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي.
    1. حدد القناة مجموعة البيانات coloc (المقابلة لIba1 / CD68 أو قناة Iba1 / LAMP1 coloc بإنشائه في الخطوة 4.1) وCy5 لقناة B (الموافق OC أو 4G8 تلطيخ جانب 647 نانومتر fluorophore).
    2. بناء قناة coloc كما هو موضح في الخطوات 4.1.2 إلى 4.1.5.
    3. انقر على قناة coloc لفتح إحصاءات القناة. و'٪ من حجم / المواد ألف أعلاه عتبة colocalized "تمثل٪ من Iba1 / LAMP1 أو Iba1 / CD68 (voxels المقابلة لقناة coloc بنيت في الخطوة 4.1.5.) colocalized مع OC أو إشارة 4G8 (voxels المقابلة ل647 fluorophore نانومتر). هذا هو حجم phagolysosomal بواسطة Aβ (انظر الأرقام 1D و 2D) المحتلة.
      ملاحظة: '٪ من حجم / المواد (ب) أعلاه عتبة colocalized "يتوافق مع٪ من إجمالي إشارة Aβ colocalized مع جسيم حال بلعمي.وهذا يمكن أن تستخدم لتقييم نسبة من إجمالي الودائع Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي (لا يظهر في نتائج تمثيلية الحالية).
  3. استخدم تجاوز وحدة لإعادة بناء مداخن صورة مبائر وتوليد نماذج 3D من Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي الوحيدات.
    1. في الإطار "تعديل عرض"، حدد TRITC (لإظهار تلطيخ فقط Iba1). في الإطار "خصائص الصوت"، انقر فوق "إضافة سطح جديد".
    2. في خطوة "1/5 خوارزمية"، في "ضبط"، اختر "سطح". أيضا، في "اللون"، اختر نوع اللون في لوحة أو RGB وضبط الشفافية (يتم تعيين الأحمر في 60٪ من الشفافية في الأرقام 1B و 2B). خانة الاختيار "تحديد المنطقة ذات الاهتمام. انقر فوق التالي.
    3. في الخطوة '2/5 المنطقة من اهتمام، "رسم نافذة حول الخلية من الفائدة من خلال تعديل س، ص والإحداثيات ض (انظر المربعات البيضاء في أرقام 1A و2A). انقر فوق التالي.
    4. في الخطوة '3/5 قناة مصدر "، حدد قناة مصدر TRITC. ضع علامة في المربع "ناعمة"، وتعيين مستوى التفاصيل المساحة إلى 0.4 ميكرون. ل"العتبة"، اختر كثافة المطلقة. انقر فوق التالي.
    5. في الخطوة '4/5 عتبة، "ضبط عتبة حتى أن حجم إنشاؤها يتداخل تماما مع إشارة قناة TRITC. انقر فوق التالي.
    6. في الخطوة '5/5 تصنيف السطوح، "في قسم" نوع التصفية، "تحديد كائنات حسب حجمها ليتم تضمينها أو استبعادها من الكميات المراد إنشاؤه. انقر فوق إنهاء وتنفيذ جميع الخطوات الخلق، وإنهاء المعالج.
    7. كرر الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.6 لخلق سطح 3D لقناة FITC (LAMP1 + أو CD68 + جسيم حال بلعمي).
    8. كرر الخطوات من 4.3.1 إلى 4.3.6 لخلق سطح 3D لقناة Cy5 (OC + أو الودائع 4G8 + Aβ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام منهجية متعددة المراحل لq3DISM المفصلة أعلاه، ونحن قادرون على تحديد Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي الوحيدات في أدمغة APP / الفئران PS1 (الشكل 1) والجرذان TgF344-AD (الشكل 2). ولذلك، فقد مكنت منهجية q3DISM تحليل البالعات وحيدات النوى في الماوس والفئران نماذج من م. ومن المثير للاهتمام، وزاد حجم التداول بنسبة CD68 + جسيم حال بلعمي المحتلة بشكل كبير في Iba1 + البالعات وحيدات النوى المرتبطة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الذي وصفنا في هذا التقرير لتحديد الكميات 3D الحقيقية للAβ البلعمة في الحي بواسطة البالعات وحيدات النوى يعتمد على وضع العلامات المحددة من المقصورات الخلوية والتحت خلوية وكذلك الودائع Aβ. على وجه التحديد، ونحن نستخدم Iba1 (مؤين الكالسيوم ملزم محول جزيء 1)، وهو البروتين الذي يشارك في الإزعاج غشاء والبلعمة على تنشيط الخلايا 18، 19، إلى وصمة عار البالعات وحيدات النوى الدماغية. في حين تعتبر خلايا Iba1 + عموما الخلايا الدبقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = 'jove_content'> م -في. جي إس. مدعوم من قبل جائزة زمالة أبحاث مرض الزهايمر (A2015309F) وجمعية الزهايمر ، جائزة الباحث الشاب لفرع كاليفورنيا ساوثلاند. يتم دعم T.M.W. من قبل مؤسسة ARCS ومؤسسة جون دوغلاس الفرنسية لمرض الزهايمر ماجي ماكنايت راسل - JDFAF التذكارية لما بعد الدكتوراه. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (1R01NS076794-01 ، إلى TT ) ، وجائزة زميل زينيث لجمعية الزهايمر (ZEN-10-174633 ، إلى TT) ، وجائزة الاتحاد الأمريكي لأبحاث الشيخوخة / مؤسسة إليسون الطبية جولي مارتن في منتصف حياتها المهنية في أبحاث الشيخوخة (M11472 ، إلى TT). نحن ممتنون لتمويل بدء التشغيل من معهد زيلخا للوراثة العصبية ، والتي ساعدت في جعل هذا العمل ممكنا.  

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
مقص تشريحVWR82027-582
مقص تشريح طرف حادVWR82027-588
ملاقطVWR94024-408
23 G إبرةVWRBD305145
مضخة تمعجية FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ تركيز العمل 1x
مصفوفة دماغ الفأر البالغ ، شرائح الإكلالية ، الفولاذ المقاوم للصدأ 1 مم   ؛كينت ScientificRBMS-200C
مصفوفة دماغ الفئران البالغة ، شرائح إكليلية ، ستانلس ستيل 1 مم   ؛كينت العلميةRBMS-305C 
محلول مائي بارافورمالدهايد 32٪ (PFA) EMS15714-Sتحذير: سام. تركيز العمل: 4٪ في PBS
EthanolVWR89125-188تركيزات مختلفة ، انظر بروتوكول
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
تضمين وتسلل ParaffinVWR15147-839
Microtome Leica RM2125Leica Biosystems
شفرات Microtome يمكن التخلص منها   ؛VWR25608-964
حمام مائي لايكا HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4Lتحذير: سامة  
حل استرجاع الهدف 10xDAKOS1699تركيز العمل 1x
KimWipesVWR21905-026
قلم PAP مسعورVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
مصل الحمار العادي (NDS)Jackson Immuno017-000-121
CoverslipsVWR48393081
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان باستخدام DAPILife TechnologiesP36935
رف منزلق زجاجيVWR100492-942
الجسم المضاد Iba1 (متعدد النسيلة ، الأرنب)واكو019-19741   ؛تركيز العمل 1:200
الجسم المضاد Iba1 (متعدد النسيلة ، الماعز)LifeSpan BioscienceLS-B2645تركيز العمل 1: 200
الفئران CD68 [KP1] الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفأر) Abcamab955تركيز العمل 1: 200
فأر CD68 [FA-11] الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفئران) Abcamab53444تركيز العمل 1: 200
فأر CD107a (LAMP1) الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفئران) Affymetrix14-1071تركيز العمل 1: 100
بيتا أميلويد ، 17-24 (4G8) جسم مضاد (أحادي النسيلة ، فأر)CovanceSIG-39220تركيز العمل 1: 200
بيتا أميلويد ، 1-16 (6E10) جسم مضاد (أحادي النسيلة ، فأر)CovanceSIG-39320تركيز العمل 1: 200
OC الجسم المضاد (متعدد النسيلة ، الأرنب)موهوب من قبل DH Cribbs و CG Glabe (UC Irvine) تركيزالعمل 1: 200
Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانوي للفأرInvitrogenA-11001تركيز العمل 1: 1,000
Alexa Fluor 488 الفئران الجسم المضاد الثانويInvitrogenA-11006تركيز العمل 1: 1,000
Alexa Fluor 594 الأرانب الجسم المضاد الثانويInvitrogenA-11037تركيز العمل 1: 1,000
Alexa Fluor 594 الجسم المضاد الثانوي للماعزInvitrogenA-11080تركيز العمل 1: 1,000
Alexa Fluor 647 الجسم المضاد الثانوي للفأرInvitrogenA-21235تركيز العمل 1: 1,000
Alexa Fluor 647 الأرانب الجسم المضاد الثانويInvitrogenA-21443تركيز العمل 1: 1,000
زيت الغمرنيكون & nbsp ؛
A1 مجهر متحد البؤرنيكون 
NIS Elements برامج البحث المتقدمةنيكون 
Imaris: يتم استخدام وحدة برنامج Bitplane الإصدار 7.6Bitplane"coloc" و "supass". بدلا من ذلك ، البرمجيات المجانية مفتوحة المصدر   يمكن استخدام ImageJ للتوطين المشترك  تحليل مجموعات بيانات Z-stacks متحدة البؤر.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774(2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949(2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393(2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185(2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة