مقالة منهجية

محرض الموسومة LAP خطوط الخلية مستقرة للتحقيق في وظيفة البروتين، الزمانية المكانية التعريب وشبكات التفاعل البروتين

11.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54870

⸱

ديسمبر 24, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

نصف طريقة لتوليد خطوط الخلايا المستقرة المحفزة الموسومة بالتوطين وتنقية التقارب (LAP) للتحقيق في وظيفة البروتين ، وتوطين الخلايا الفرعية الزمانية المكانية وشبكات تفاعل البروتين والبروتين.

الملخص

غالبا ما تحكم

المجمعات متعددة البروتينات ، بدلا من البروتينات المفردة التي تعمل بمعزل عن بعضها البعض ، المسارات الجزيئية التي تنظم التوازن الخلوي. بناء على هذا المبدأ ، فإن تنقية البروتينات الهامة المطلوبة لعمل هذه المسارات جنبا إلى جنب مع شركائها الأصليين المتفاعلين لم يسمح فقط برسم خرائط لمكونات البروتين لهذه المسارات ، ولكنه قدم أيضا فهما أعمق لكيفية تنسيق هذه البروتينات لتنظيم هذه المسارات. في هذا السياق ، يمكن أن يساعد فهم التوطين الزماني المكاني للبروتين وشبكة تفاعل البروتين والبروتين في تحديد دوره داخل المسار ، وكذلك كيف يمكن أن يؤدي سوء تنظيمه إلى التسبب في المرض. لتلبية هذه الحاجة ، تم تصميم العديد من الأساليب لتنقية البروتين مثل تنقية التقارب الترادفي (TAP) والتوطين وتنقية التقارب (LAP) واستخدامها بنجاح. ومع ذلك ، من أجل تطبيق هذه الأساليب على التحليلات البروتينية على نطاق المسار ، يجب استكمال هذه الاستراتيجيات بالتطورات التكنولوجية الحديثة في الاستنساخ وتوليد خط الخلايا المستقرة للثدييات. هنا ، نصف طريقة لتوليد خطوط خلوية مستقرة محفزة للإنسان تحمل علامة LAP للتحقيق في توطين البروتين دون الخلوي وشبكات تفاعل البروتين والبروتين. تم تطبيق هذا النهج بنجاح على تشريح المسارات الخلوية المتعددة بما في ذلك انقسام الخلايا وهو متوافق مع التحليلات البروتينية عالية الإنتاجية.

المقدمة

للتحقيق في الوظيفة الخلوية لبروتين غير مميز ، من المهم تحديد توطينه في الجسم الحي والزماني المكاني وشركائه البروتينيين المتفاعلين. تقليديا ، تم استخدام علامات الحاتمة المفردة والترادفية المدمجة في الطرف N أو C لبروتين ذي أهمية لتسهيل توطين البروتين ودراسات تفاعل البروتين. على سبيل المثال ، مكنت تقنية تنقية التقارب الترادفي (TAP) من عزل مجمعات البروتين الأصلية ، حتى تلك التي تكون منخفضة الوفرة ، في كل من خطوط خلايا الخميرة والثدييات1،2. تعد تقنية التوطين وتنقية التقارب (LAP) تطورا حديثا يعدل إجراء TAP ليشمل مكون توطين من خلال إدخال بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كأحد علامات الحاتمة3. أعطى هذا النهج الباحثين فهما أعمق لتوطين البروتين تحت الخلايا في الخلايا الحية مع الاحتفاظ أيضا بالقدرة على إجراء عمليات تنقية معقدة TAP لرسم خريطة لشبكات تفاعل البروتين والبروتين.

ومع ذلك ، هناك العديد من المشكلات المرتبطة باستخدام تقنيات TAP / LAP التي أعاقت استخدامها على نطاق واسع في خلايا الثدييات. على سبيل المثال ، طول الفترة الزمنية اللازمة لتوليد خط خلوي مستقر يعبر عن بروتين علامة TAP / LAP ذي أهمية ؛ والذي يعتمد عادة على استنساخ الجين المعني في ناقل فيروسي واختيار متكاملات مستقرة أحادية الخلية بمستوى التعبير المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من المسارات الخلوية حساسة للإفراط في التعبير عن البروتين التأسيسي (حتى عند المستويات المنخفضة) ويمكن أن توقف الخلايا أو تؤدي إلى موت الخلايا بمرور الوقت مما يجعل توليد خط خلوي مستقر TAP / LAP مستحيلا. وقد أعاقت هذه القيود وغيرها منهجيات LAP/TAP من أن تصبح أنظمة عالية الإنتاجية لتوطين البروتين وتوضيح مركب البروتين. لذلك ، كان هناك اهتمام كبير بتطوير نظام وضع العلامات على LAP عالي الإنتاجية المحفز لخلايا الثدييات الذي يستفيد من الابتكارات الحالية في تقنيات الاستنساخ وخط الخلايا.

نقدم هنا بروتوكولا لتوليد خطوط خلوية مستقرة باستخدام بروتينات Doxycycline / Tetracycline (Dox / Tet) ذات الأهمية التي تحمل علامة LAP المحفزة والتي تطبق التطورات في كل من تقنيات الاستنساخ وخط خلايا الثدييات. يعمل هذا النهج على تبسيط الحصول على البيانات فيما يتعلق بتوطين البروتين تحت الخلايا الموسومة ب LAP ، وتنقية مركب البروتين وتحديد البروتينات المتفاعلة4. على الرغم من أن بروتينات التقارب تستخدم مجموعة واسعة من التقنيات لتوضيح مركب البروتين5 ، إلا أن نهجنا مفيد لتسريع تحديد هذه المجمعات وشبكات التفاعل الأصلية الخاصة بها وهو قابل لوضع علامات على البروتين عالي الإنتاجية وهو أمر ضروري للتحقيق في المسارات البيولوجية المعقدة التي تحتوي على العديد من مكونات البروتين. مفتاح هذا النهج هو التقدم في استراتيجيات الاستنساخ التي تمكن من الاستنساخ عالي الدقة والاستنساخ المعجل للجينات المستهدفة في مجموعة من النواقل للتعبير الجيني في المختبر ، في كائنات مختلفة مثل البكتيريا والفيروس العصبي ، وفي خلايا الثدييات6،7. بالإضافة إلى ذلك ، قام تعاون ORFeome باستنساخ الآلاف من إطارات القراءة المفتوحة التي تم التحقق من صحتها في المتجهات التي تتضمن هذه التطورات في الاستنساخ ، والتي تتوفر للمجتمع العلمي8-11. في نظامنا ، يتيح متجه وضع العلامات pGLAP1 LAP الاستنساخ المتزامن لعدد كبير من المستنسخة ، مما يسهل وضع علامات LAP عالية الإنتاجية. يقترن إجراء الاستنساخ المعجل هذا بنهج مبسط لتوليد خطوط الخلايا باستخدام الجينات ذات الأهمية الموسومة ب LAP والتي يتم إدخالها في موضع جيني واحد محدد مسبقا. يستخدم هذا خطوط الخلايا التي تحتوي على موقع واحد للتعرف على هدف الفليباز (FRT) داخل جينومها ، وهو موقع تكامل الجينات الموسومة ب LAP. تعبر خطوط الخلايا هذه أيضا عن مثبط التتراسيكلين (TetR) الذي يرتبط بمشغلي Tet (TetO2) في المنبع من الجينات الموسومة ب LAP ويسكت تعبيرهم في غياب Dox / Tet. يسمح هذا بالتعبير المحفز Dox / Tet للبروتين الموسوم ب LAP في أي وقت. يعد امتلاك القدرة على التعبير عن البروتين المحفز الموسوم ب LAP أمرا بالغ الأهمية ، نظرا لأن العديد من المسارات الخلوية حساسة لمستويات البروتينات الحرجة التي تحكم المسار ويمكن أن توقف نمو الخلايا أو تؤدي إلى موت الخلايا عندما يتم التعبير عن هذه البروتينات بشكل مفرط ، حتى عند المستويات المنخفضة ، مما يجعل توليد خطوط الخلايا المستقرة غير المحفزة الموسومة ب LAP مستحيلا12.

البروتوكول

ملاحظة: لمحة عامة عن جيل من خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP محرض لأي بروتين من الفائدة هو موضح في الشكل (1) ونظرة عامة للتعبير البروتين LAP الموسومة، وتنقية والتحضير ل[بروتيوميك الشامل ويتضح التحليلات في الشكل (3).

1. استنساخ الإطار المفتوحة القراءة (ORF) من جين الاهتمام في LAP العلامة المتجهات

  1. استنساخ ORF من الجينات الاهتمام في المكوك المتجهات.
    1. استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم ORF في المصالح مع attB1 وattB2 مواقع مناسبة داخل الاشعال إما الانصهار N-محطة أو الانصهار C-المحطة. انظر الجدول رقم 1 لمتواليات التمهيدي والجدول رقم 2 للشروط الاسترداد.
    2. هلام تنقية المنتجات PCR من حلها على هلام الاغاروز 1٪. استئصال الفرقة تضخيم هذا هو الحجم الصحيح من هلام واستخراجها من شريحة هلام باستخدام الحمض النووي زالكيت استخراج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. احتضان attB النقي الذي يحتوي على منتجات PCR مع attP التي تحتوي على ناقلات المكوك وrecombinase التي تسمح للمنتجات PCR لإعادة تجميع في ناقلات حسب تعليمات الشركة الصانعة (انظر M المقيدين الجدول).
      ملاحظة: ناقلات المكوك فارغة وLAP وضع العلامات ناقلات تحتوي على الجين اتفاقية مكافحة التصحر باء ويجب أن يتم نشرها في اتفاقية مكافحة التصحر B الخلايا البكتيرية مقاومة (انظر المواد الجدول). ومع ذلك هو معاد الجين ccdB بها عندما يتم إدخال ORF إلى هذه النواقل، وبالتالي استخدام معيار خلايا القولونية DH5α E. عندما نشر ناقلات مع ORFS المستنسخة.
    4. تحويل DH5α E. خلايا القولونية مع 1 ميكرولتر من ناتج التفاعل ولوحة الخلايا تحولت إلى مرق لوريا (LB) لوحة أجار مع 50 ملغ / مل الكانامايسين 13.
    5. حدد المستعمرات مقاومة كانامايسين.
    6. تنمو المستعمرات المختارة في LB ليديا مع 50 ملغ / مل الكانامايسين، وجعل الحمض النووي مصغرة الإعدادية وتأكيد التكامل الجينات من تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات التسلسل المدرجة في الجدول 3.
  2. نقل الجينات من الفائدة من المكوك المتجهات في LAP العلامة المتجهات.
    1. احتضان ناقلات المكوك التي تحتوي على تسلسل التحقق من جينة من ORF المصالح مع LAP العلامة ناقلات (pGLAP1 عن الانصهار N-محطة) وrecombinase التي تتوسط نقل الجينات في المصالح من ناقلات المكوك في ناقلات LAP-العلامة كما في تعليمات الشركة الصانعة (انظر المواد).
      ملاحظة: سلسلة من نواقل LAP / TAP التي يمكن استخدامها على أساس المروج المطلوب، حاتمة العلامة، و N أو علامات C-الطرفية يمكن العثور عليها في الجدول رقم 4.
    2. تحويل DH5α E. خلايا القولونية مع 1 ميكرولتر من ناتج التفاعل ولوحة الخلايا تحولت على لوحة أجار LB مع 100 ملغ / مل الأمبيسلين 13.
    3. حدد كولو مقاومة الأمبيسلينالاقتصادات الحديثة التصنيع.
    4. تنمو المستعمرات المختارة في وسائل الإعلام LB مع 100 ملغ / مل الأمبيسلين، وجعل الحمض النووي مصغرة الإعدادية، وتأكيد التكامل الجينات من تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات التسلسل المدرجة في الجدول رقم 5.

2. الجيل من خط الخلية مستقرة محرض أن تعرب عن جين الموسومة LAP الاهتمام

  1. حدد خط الخلية الأنسب للمشروع من الفائدة. بدلا من ذلك، إنشاء خط الخلية المضيفة من أي خط الخلية الحالية التي تعبر بشكل جوهري على TetR ويحتوي موقع FRT يسمح الجين الموسومة LAP التي تهم تكون متكاملة مستقر في الجينوم (انظر المواد).
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خط خلية HEK293 الذي يحتوي على TetR وموقع FRT، الذي يزرع في -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 [المصنوع من 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) أن يخلو من التتراسيكلين (-Tet)] (4) .
  2. تحديد الحد الأدنى لتركيز هيغروميسين اللازمة لقتل خط الخلية المضيفة ضمن 1-2 ويكانساس بعد إدمان المخدرات. تركيز يمكن أن تختلف بين خطوط الخلية المضيفة، مع معظم تتراوح بين 100 ميكروغرام / مل و 800 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: خلايا HEK293 نمت في -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 مع 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 سيموتون في غضون 1-2 أسابيع.
  3. شارك في transfect ناقلات التي تعبر عن recombinase flippase (يتوسط التكامل بين الجينات LAP الموسومة الفائدة إلى الموقع FRT داخل جينوم الخلية) مع ناقل الموسومة LAP إلى خلايا HEK293 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن حسب تعليمات الشركة الصانعة . استخدام نسبة 4: 1 من ناقلات recombinase لناقلات LAP 14.
    ملاحظة: إن النسبة المثلى تعتمد على خط الخلية المضيفة وطريقة ترنسفكأيشن، وقد تتطلب المعايرة. وهناك نسبة 4: 1 يعمل بشكل جيد بالنسبة لمعظم خطوط الخلايا. تتضمن لوحة وهمية transfected كعنصر تحكم السلبية.
  4. يوم واحد بعد ترنسفكأيشن، استبدال وسائل الإعلام / F12 -Tet DMEM مع وسائل الإعلام الجديدة.
  5. يومين بعد transfectiعلى، تقسيم الخلايا إلى 25٪ التقاء. تسمح للخلايا ~ 5 ساعة إرفاقه، ثم يضاف هيغروميسين التي تحتوي على -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 في تركيز محدد مسبقا في الخطوة 2.2. لHEK293 الخلايا تستخدم 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين.
    ملاحظة: FRT تحتوي على خط الخلية HEK293 يحتوي أيضا على TetR مقترن المقاومة Blasticidin، وبالتالي يتم استخدام 5 ميكروغرام / مل Blasticidin خلال عملية اختيار خط الخلية مستقرة لتحديد لTetR والتقليل من التعبير المتسرب.
  6. استبدال هيغروميسين التي تحتوي على -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 حسب الحاجة حتى تظهر بؤر خلية متميزة تشبه البقع المعتمة ضد لوحة شفافة.
  7. إضافة 20 ميكرولتر من التربسين على رأس كل بؤر خلية والماصة صعودا وهبوطا 2 مرات مع 200 ميكرولتر طرف الماصة. خلايا مكان في 24 لوحة جيدا وتوسيع الخلايا عن طريق النمو المستمر في هيغروميسين التي تحتوي على -Tet DMEM / وسائل الإعلام F12.
  8. خلايا الشاشة للتعبير البروتين الموسومة LAP محرض من قبل خلايا ثابتة أو العيش الخلية المجهر مضان و / أوالنشاف الغربي للعلامة GFP داخل LAP العلامة 15.

3. تنقية البروتين المجمعات الموسومة LAP

ملاحظة:-LAP الموسومة تنقية البروتين تفاصيل بروتوكول التوصيات التالية على الشروط وأحجام تستخدم لتنقية البروتين LAP الموسومة نموذجية على أساس الخبرة السابقة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر لضمان أن يتم تحسين التجريبية من أي مستوى التعبير مجمع البروتين والبروتين من الفائدة لتقديم أفضل النتائج.

  1. نمو الخلايا وحصاد الخلايا.
    1. توسيع خط خلية الموسومة LAP التحقق من صحة لعزل TAP المجمعات البروتين، من خلال الركض باستمرار جميع الخلايا HEK293 في لوحات أكبر و / أو زجاجات الأسطوانة في -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    2. لخطوط الخلايا محرض تيت / دوكس، وحمل لمدة 10-15 ساعة عند تركيز 0.2 ميكروغرام / مل تيت / دوكس عندما تصل الخلايا ~ 70٪ confluency، قبل harvestinز الخلايا.
      ملاحظة: يجب تحديد وقت التركيز والحث على كل من البروتين، ينصح المعايرة من 0،1-1 ميكروغرام / مل تيت / دوكس لمدة 10-15 ساعة.
    3. خلايا الحصاد عن طريق التحريض أو trypsinization وبيليه الخلايا في 875 x ج لمدة 5-10 دقيقة.
  2. اقتران مكافحة GFP الضد إلى الخرز والبروتين
    1. استخدام 40 ميكروغرام من الأجسام المضادة للمناعي من المحللة أعدت من بيليه 0.5 مل الخلايا، حجم الخلية معبأة (PCV).
      ملاحظة: كمية من الأجسام المضادة المطلوبة سوف تعتمد على وفرة من البروتين الموسومة LAP، من بين عوامل أخرى، وسوف تتطلب التحسين. ينصح معايرة 10-40 ميكروغرام.
    2. تتوازن 160 ميكرولتر حجم معبأة (PV) حبات البروتين في PBST (PBS + 0.1٪ توين-20) في أنبوب 1.5 مل. يغسل 3 مرات مع 1 مل من PBST.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع يغسل هنا من قبل الطرد المركزي حبات في 5000 x ج لمدة 10 ثانية.
    3. الخرز resuspend في 500 ميكرولتر PBST وإضافة 80 ميكروغرام من تقاربأرنب -purified مكافحة GFP الضد إلى كل أنبوب من 160 حبات ميكرولتر. مزيج لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. تغسل حبات 2 مرات مع 1 مل من PBST. ثم، وغسل حبات 2 مرات مع 1 مل من 0.2 M بورات الصوديوم، ودرجة الحموضة 9 (20 مل 0.2 M الصوديوم بورات + 15 مل 0.2 M حمض البوريك). بعد غسل النهائي، إضافة 900 ميكرولتر من بورات 0.2 M الصوديوم، ودرجة الحموضة 9 لجلب الحجم النهائي إلى 1 مل.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من 220 ملي dimethylpimelimidate (DMP) إلى تركيز النهائي من 20 ملم. تدوير أنابيب بلطف على RT لمدة 30 دقيقة. 220 ملي DMP، و resuspend محتويات أحد زجاجة 50 ملغ في 877 ميكرولتر من 0.2 M بورات الصوديوم، ودرجة الحموضة 9 وعلى الفور إضافة إلى تعليق حبة.
    6. بعد الحضانة مع برنامج إدارة الكوارث، وغسل حبات 1 مرة مع 1 مل من 0.2 M ايثانول، 0.2 M كلوريد الصوديوم درجة الحموضة 8.5 لإبطال نشاط crosslinker المتبقية. حبات Resuspend في 1 مل من المخزن نفسه وتدويره لمدة 1 ساعة على RT. الخرز بيليه والخرز resuspend في 500 ميكرولتر من 0.2 M ايثانول، 0.2 M كلوريد الصوديوم الهيدروجيني 8.5. حبات مستقرة لسيفيرال أشهر في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد المخازن لتحلل الخلايا وتنقية مجمع
    1. إعداد مخازن LAPX (حيث X هو تركيز الملح المطلوب [ملي بوكل] من المخزن المؤقت LAP، 300 ملي لتحلل الخلية، 200 ملم لمعظم يغسل حبة، و 100 ملي لغسل حبات البروتينات قبل يبلغ حجمه) بجعل درجة الحموضة 7.4 الحل تحتوي على 50 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، X ملي بوكل، 1 ملم حمض جلايكول الإثيلين tetraacetic (EGTA)، 1 ملم MgCl 2، و 10٪ الجلسرين.
      ملاحظة: مكونات هذا المخزن المؤقت تستخدم لتقريب والبيئة في الخلايا الحية. يستخدم HEPES كمنطقة عازلة في الغضب درجة الحموضة من 7،2-8،2. بوكل هو الملح المستخدمة للحفاظ على قوة الأيونية للالعازلة. EGTA هو عامل خالب الذي يربط أيونات الكالسيوم للحد من مستويات الكالسيوم مقارنة مع المغنيسيوم. يتم استخدام الجلسرين وMgCl 2 لتحسين الاستقرار من البروتينات.
    2. إعداد عازلة LAPX N بإضافة 0.05٪ نونيل phenoxypolyethoxylethanol إلى المخزن المؤقت LAPX.
      ملاحظة: نونيل phenoxypolyethoxylethanol هو منظف معتدل أن solubilizes البروتينات، ولكن يحافظ على تفاعلات البروتين البروتين، وبالتالي يتم استخدام تركيز أعلى أثناء عملية الاستخراج ومن ثم يتم خفضه خلال الخطوات الملزمة والغسيل.
  4. إعداد الخلية لست]
    1. و resuspend 500 ميكرولتر من PCV إلى 2.5 مل من LAP300 مع 0.5 ملي dithiothreitol (DTT) ومثبطات الأنزيم البروتيني. إضافة 90 ميكرولتر من 10٪ phenoxypolyethoxylethanol نونيل (النهائية 0.3٪) وتخلط بواسطة قلب.
    2. وضع على الجليد لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 21000 x ج لمدة 10 دقيقة. جمع هذه السرعة طاف منخفضة (LSS). أخذ عينة 10 ميكرولتر من LSS لتحليل هلام.
    3. نقل LSS لأنبوب TLA100.3 وتدور في 100000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. جمع هذه السرعة العالية طاف (الأحرار)، في أنبوب ووضعه على الجليد. أخذ عينة 10 ميكرولتر من الأحرار لتحليل هلام.
      ملاحظة: تجنب أخذ كبار معظم الدهون طبقةد القاع معظم طبقة الحطام الخلية. يجب إزالة طبقة الدهن عن طريق الشفط قبل جمع الأحرار.
  5. أول لقطة تقارب: الربط إلى الخرز مكافحة GFP
    1. ، أزل قبل الأجسام المضادة إلى جانب الخرز (استخدام 160 ميكرولتر من الخرز في 0.5 مل خلية بيليه (PCV)) من خلال غسلها 3 مرات مع 1 مل من شطف العازلة [3.5 م MgCl 2 مع 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4] للتخلص من. فصل الأجسام المضادة وتقلل الخلفية. هل بسرعة. لا تترك حبات من الملح عالية لفترة طويلة.
    2. تغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من LAP200 N. مزيج الأحرار استخراج مع الخرز الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 21000 x ج لمدة 10 دقيقة. أخذ عينة 10 ميكرولتر من طاف (أي تدفق من خلال (FT)) للتحليل هلام.
    3. تغسل حبات 3 مرات مع 1 مل من LAP200 N مع 0.5 ملي DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني. تغسل حبات 2 مرات (5 دقائق لكل منهما) مع 1 مل من LAP200 N مع 0.5 ملي DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني. يغسل بسرعة 2 ربرامج تحرير أسلوب الإدخال مع 1 مل من LAP200 N مع 0.5 ملي DTT ولا مثبطات الأنزيم البروتيني قبل إضافة البروتيني فيروس حفر التبغ (TEV).
  6. TEV انشقاق
    1. تمييع 10 ميكروغرام TEV البروتيني في 1 مل من LAP200 N وتدوير الأنابيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الأمثل هذه الخطوة لأي بروتين الموسومة LAP إلى أن تكتمل في غضون ساعات قليلة عن طريق ضبط تركيز TEV البروتيني، والتي يمكن أن تساعد في الحفاظ على المجمعات البروتين LAP الكلمات الدلالية.
    2. الخرز بيليه ونقل طاف لأنبوب جديد. شطف حبات مرتين مع 160 ميكرولتر LAP200 N مع 0.5 ملي DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني (تركيز الثلاثي) لإزالة أي البروتين المتبقية. أخذ عينة 10 ميكرولتر من طاف للتحليل هلام.
  7. الثاني القبض على الانجذاب: الربط إلى S البروتين الاغاروز
    1. غسل أنبوب 1 من 80 ميكرولتر البروتين S الاغاروز الطين (40 ميكرولتر الراتنج معبأة) 3 مرات مع 1 مل من LAP200 N.
      ملاحظة: S بروتعين ملزما للS-العلامة وإعادة لريبونوكلياز نشط وينبغي النظر في علامة حاتمة الثانية بديلة عن الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مجمعات البروتين.
    2. مزال إضافة TEV طاف لS الخرز البروتين الاغاروز والصخور لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية. الخرز بيليه ويغسل 3 مرات مع 1 مل من LAP200 N مع 0.5 ملي DTT ومثبطات الأنزيم البروتيني. تغسل حبات 2 مرات مع 1 مل من LAP100.
  8. البروتين شطف
    1. أزل البروتينات من البروتين S الاغاروز بإضافة 50 ميكرولتر من عينة العازلة 4X Laemmli والحرارة في 97 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن أيضا البروتينات يكون مزال من الخرز مع شطف العازلة (3.5 M MgCl 2 مع 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4).

4. تحديد التفاعل البروتينات عن طريق تحليل الطيف الكتلي

  1. اختبار جودة تنقية من خلال تحليل العينات التي تم جمعها من قبل الكهربائي دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE)، وتلطيخ الفضة هلام (انظر مواد الجدول) وimmunoblotting وeluates والتحقيق مع أضداد GFP لضمان تنقية الموسومة LAP عملت 16، انظر الشكل 4.
  2. لتحديد أنواع شارك في تنقية متكافئة وsubstoichiometric، واتخاذ عينة شطف النهائي وفصلها بواسطة SDS-PAGE. وصمة عار الجل مع مطياف الكتلة البروتين متوافق صمة عار. استئصال العصابات أبرز والفضاء بينهما من هلام ومعالجتها لتحليل الطيف الكتلي على حدة 16.
    ملاحظة: هناك العديد من المناهج لفصل eluates تنقية النهائية وإعدادهم لقياس الطيف الكتلي 5. على سبيل المثال، مجمعات للتنقية LAP يمكن مزال من الخرز S-بروتين باستخدام الملح العالية (3.5 M MgCl 2) والسكان البروتين بأكمله بشكل جماعي يمكن تحليلها بواسطة مطياف الكتلة (17). بدلا من ذلك، eluates النهائية يمكن فصلها عن 1 مم SDS-PAGE واحدة 1 ملم الفرقة يمكن أن يكون البريدxcised وتحليلها. هذا مسح خليط معقد من أي الخرز أو الجسيمات التي من شأنها أن تتداخل مع التحليل.

النتائج

لتسليط الضوء على فائدة هذا النظام، تم استنساخ إطار القراءة المفتوحة (ORF) من بروتين تاو أنيبيب في ناقلات المكوك عن طريق تضخيم تاو ORF مع الاشعال تحتوي على attB1 وattB2 مواقع (الجدول 1)، واحتضان المنتجات PCR مع ناقلات المكوك وrecombinase التي تتوسط إدخال المنتجات PCR في ناقلات المكوك. واستخدمت المنتجات رد فعل لتحويل البكتيريا DH5α 13 و DNA البلازميد من كانامايسين المستعمرات المقاومة والتسلسل لضمان تاو الإدراج. وبعد ذلك يستخدم تسلسل التحقق من صحة المكوك تاو ناقلات لنقل تاو ORF في ناقلات pGLAP1، التي تنصهر تاو في إطار مع LAP (EGFP-TEV-S-بروتين) العلامة، التي يحتضنها ناقلات المكوك تاو مع ناقلات pGLAP1 وrecombinase التي تتوسط نقل ORF من ناقلات المكوك إلى pGLAP1. واستخدمت المنتجات رد فعل لتحويل البكتيريا DH5αكان التسلسل 13 و DNA البلازميد من الأمبيسلين المستعمرات مقاومة للتأكد من أن الانصهار LAP-تاو كان في الإطار. تسلسل التحقق ثم شارك في transfected pGLAP1-LAP-تاو مع ناقلات تعبر عن انزيم flippase إعادة التركيب في خلايا HEK293 التي تتضمن هدفا الاعتراف flippase واحد الموقع (FRT) داخل الجينوم، والتي هو موقع التكامل الجينات الموسومة LAP 14. أعرب هذا الخط الخلية أيضا TetR التي تربط لمشغلي تيت المنبع من الجينات الموسومة LAP ويسكت التعبير عنها في غياب تيت / دوكس. وقد تم اختيار integrants مستقرة مع -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12 مع 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين لمدة 5 أيام. تم حصادها هيغروميسين بؤر خلية مقاومة الفردية من خلال إضافة 20 ميكرولتر من التربسين على رأس وpipetting صعودا وهبوطا 2 مرات. تم وضع الخلايا في 24 لوحة جيدا وتوسعت بنسبة نمو المستمر في -Tet DMEM وسائل الإعلام / F12.

للتحقق من أن خلية مقاومة هيغروميسينالصورة كانت قادرة على التعبير عن LAP-تاو، استميلت خلايا HEK293 LAP-تاو مع 0.1 ميكروغرام / مل دوكس لمدة 15 ساعة والبروتين مقتطفات أعدت من الخلايا غير التي يسببها والتي يسببها دوكس. تم فصل هذه مقتطفات من SDS-PAGE، ونقل إلى غشاء PVDF، وimmunoblotted لGFP وتويولين كما تحكم التحميل. كما رأينا في الشكل 4A، LAP-تاو (تصور مع أضداد GFP) وأعرب عن فقط في وجود دوكس. للتحقق من أن LAP-تاو والمترجمة بشكل صحيح إلى المغزل أنيبيب الإنقسامية خلال الانقسام، كما تبين سابقا تاو الذاتية 18، والتي يسببها الخلايا HEK293 LAP-تاو مع 0.1 ميكروغرام / مل دوكس لمدة 15 ساعة وتم إصلاح الخلايا مع 4٪ امتصاص العرق وشارك الملطخة عن الحمض النووي (هويشت 33342) والأنابيب الدقيقة (الأجسام المضادة، تويولين). باستمرار، كان المترجمة LAP-تاو إلى المغزل الإنقسامية خلال الطورية الانقسام (الشكل 4B). للتحقق من أن LAP-تاو والبروتينات التفاعل لها يمكن تنقيته مع هذا تميز الكليةوقد نمت تيم، وخلايا HEK293 LAP-تاو في زجاجات الأسطوانة إلى ~ 70٪ confluency، الناجم مع 0.1 ميكروغرام / مل دوكس لمدة 15 ساعة، تحصد الإثارة، هي lysed مع العازلة LAP300، وتنقيته LAP-تاو باستخدام بروتوكول أعلاه. تم حل Eluates من تنقية LAP-تاو بواسطة SDS-PAGE وهلام والفضة الملون. ويبين الشكل 4C تنقية LAP-تاو، التي تحمل علامة النجمة هي LAP-تاو وعدة فرق أخرى تدل على البروتينات التفاعل تاو يمكن أن ينظر إليه.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على توليد محرض خطوط الخلية مستقرة الموسومة LAP لأي بروتين من الفائدة. وتتضخم إطار القراءة المفتوحة (ORF) من الجينات في المصالح مع attB1 وattB2 مواقع المرافقة 5 'و 3' تسلسل النهاية، على التوالي (يتم إعطاء تسلسل التمهيدي في الجدول 1) والمستنسخة في ناقلات المكوك. ثم يتم استخدام تسلسل التحقق ناقلات المكوك مع الجينات في المصالح لنقل الجينات في المصالح في ناقلات pGLAP1. تسلسل التحقق pGLAP1 ناقلات مع الجين ومن ثم شارك transfected مع ناقلات تحتوي على recombinase flippase في خط الخلية المطلوبة التي تحتوي على هدف الاعتراف flippase واحد الموقع (FRT) داخل الجينوم، والتي هو موقع التكامل لLAP الجينات -tagged. هذه خطوط الخلايا أيضا تعبير عن قامع تيت (TetR) الذي يربط لمشغلي تيت (تيتو 2) المنبع من الجينات الموسومة LAP، ويسكت التعبير عنها في غياب تيت / دوكس. ثم يتم معاد الجين الموسومة LAP من الفائدة في الموقع FRT ويتم اختيار integrants مستقرة مع هيغروميسين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
الشكل 2: نظرة عامة على طلبات الحصول على خطوط الخلية مستقرة الموسومة LAP. ويتسبب محرض خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP للتعبير عن البروتين LAP الموسومة الاهتمام من جانب دوكس إضافة ويمكن أن تكون متزامنة في مراحل مختلفة من دورة الخلية أو يمكن حفز مع المواد الكيميائية أو بروابط لتنشيط مسار الإشارات المطلوب. توطين التحت خلوية من البروتين LAP الموسومة من الفائدة يمكن تحليلها من قبل خلية حية أو التصوير الخلية ثابت. يمكن أيضا أن تكون البروتينات الموسومة LAP جنبا إلى جنب تقارب تنقية ويمكن التعرف على البروتينات التفاعل من قبل السائل اللوني جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS). وأخيرا، Cytoscape يمكن استخدامها لتوليد شبكة تفاعل البروتين البروتين البروتين الطعم. دوكس يشير دوكسي، يشير IP immunoprecipitate، EGFP يشير إلى تعزيز البروتين الفلوري الأخضر، TEV يشير الموقع انشقاق TEV البروتيني، وS يشير S-العلامة.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل (3): نظرة عامة على الموسومة LAP البروتين التعبير وتنقية والتحضير لقياس الطيف الكتلي. بروتوكول ديه 9 الخطوات التالية: 1) النمو وتحريض التعبير البروتين LAP الموسومة، 2) حصاد الخلايا وتحلل، 3) إعداد لست]، 4) ربط لست] إلى حبات مكافحة GFP، 5) TEV البروتيني انشقاق وGFP العلامة، 6) وملزمة لللست] إلى حبات S-بروتين، 7) شطف من البروتين الطعم والبروتينات التفاعل، و 8-9) إعداد عينات لتحليل البروتين الجماعي القائم على الطيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: التحقق من التعبير LAP-تاو. (A) لطخة غربية (WB) تحليل عينات البروتين من الخلايا غير الناجم عن ودوكس التي يسببها LAP-تاو HEK293 بحث مع مكافحة GFP وتويولين مكافحة الأجسام المضادة للكشف عن البروتين تاو الموسومة LAP والسيطرة تويولين تحميل، على التوالي. ملاحظة يتم التعبير عن ذلك LAP-تاو فقط عندما يتم يسببها الخلايا مع دوكس. تم إصلاح الخلايا (ب) الميتوزى معربا عن LAP-تاو وتحليلها شارك الملطخة عن الحمض النووي (هويشت 33342) وتويولين (حوض) مع أضداد تويولين وتوطين التحت خلوية من LAP-تاو كتبها microcopy مضان. لاحظ أن LAP-تاو يموضع إلى المغزل والمغزل القطبين الإنقسامية خلال الانقسام. (ج) فضية الملون هلام لتنقية LAP-تاو. ميغاواط يدل على الوزن الجزيئي، CL يشير لست] مسح، والهندية Eآتش eluates النهائية. تم تشغيل العينات على 4-20٪ SDS-PAGE وهلام الفضة الملون لتصور تنقية البروتينات. لاحظ أن الفرقة الموافق LAP-تاو يتم وضع علامة مع علامة النجمة وعدة فرق أخرى مماثلة لالبروتينات شارك في تنقية يمكن أن ينظر إليه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الانصهار-N محطة
إلى الأمام 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 "
عكسي 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT تي TTATCA - (> 18gsn) -3 "
الانصهار C-محطة
إلى الأمام 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 "
عكسي 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 "

الجدول 1: إلى الأمام وعكس الاشعال لتضخيم ORFS أو الفائدة للالإدراج في المكوك المتجهات. وسلط الضوء على مواقع attB في بأحرف بارزة، GSN يدل على أن أكثر من 18 جينة النيوكليوتيدات محددة تضاف إلى التمهيدي.

خطوة درجة الحرارة مرة
تمسخ الأولي 94 ° C 2 دقيقة
دورات PCR التضخيم (35) تفسد 94 ° C 30 ثانية
حمى 55 ° C (اعتمادا على التمهيدي تيم) 30 ثانية
تمديد 72 ° C 1 دقيقة / كيلو بايت
عقد 4 ° C إلى أجل غير مسمى

الجدول 2: PCR شروط التضخيم من ORFS الاهتمام.

ناقلات إلى الأمام تسلسل التمهيدي عكس التسلسل التمهيدي
مكوك المتجهات 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 " 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 "

الجدول 3: إلى الأمام وعكس التسلسل الاشعال لمكوك المتجهات.

هوية شخصية بناء أبوي متعهد البكالوريا الدقة مام الدقة تيت ريج؟
pGLAP1 N الأجل EGFP-TEV-S الببتيد pcDNA5 / FRT / لل CMV أمبير سائل النظافة نعم فعلا
pGLAP2 N الأجل العلم-TEV-S الببتيد pcDNA5 / FRT / لل CMV أمبير سائل النظافة نعم فعلا
pGLAP3 N-المدى EGFP-TEV-S الببتيد. C-المدى V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a أمبير سائل النظافة لا
pGLAP4 N-مصطلح العلم-TEV-S الببتيد. . C-المدى V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a سائل النظافة لا
pGLAP5 C الأجل S الببتيد PreProt X2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a أمبير سائل النظافة لا

الجدول 4: قائمة المتاحة المتجهات LAP / TAP مع المروجين المتغير-علامات حاتمة، ودوكس محرض قدرات التعبير عن N أو C-محطة البروتين توصيف. تتوفر تجاريا ناقلات. البكالوريا الدقة يشير إلى علامة مقاومة الجراثيم، مام الدقة يشير الثدييات خلية علامة المقاومة، تيت ريج؟ يشير إلى ما إذا التعبير هو تيت / دوكس regulatable.

ناقلات إلى الأمام تسلسل التمهيدي عكس التسلسل التمهيدي
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 "
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 "
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 "
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 "
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 " 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 "

الجدول 5: إلى الأمام وعكس التسلسل الاشعال لpGLAP المتجهات.

المناقشة

يصف بروتوكول الخطوط العريضة لاستنساخ الجينات في المصالح في ناقلات العنونة LAP، وجيل من خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP محرض، وتنقية البروتين المجمعات الموسومة LAP لتحليل البروتين. وفيما يتعلق بالنهج LAP / TAP وضع العلامات الأخرى، وقد تم تبسيط هذا البروتوكول لتكون متوافقة مع النهج الإنتاجية العالية لرسم خريطة توطين البروتين والبروتين البروتين التفاعلات داخل أي مسار الخلوي. وقد تم تطبيق هذا النهج على نطاق واسع على توصيف وظيفي من البروتينات الهامة للتقدم دورة الخلية، الجمعية المغزل الإنقسامية، المغزل قطب التوازن، وتكون الأهداب على سبيل المثال لا الحصر، وقد ساعد على فهم كيفية misregulation من هذه البروتينات يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب الإنسان 15، 16،19،20. على سبيل المثال، لدينا مجموعة استخدمت مؤخرا هذا النظام لتحديد وظيفة وتنظيم كينيسين STARD9 الإنقسامية (هدف السرطان مرشح) في الجمعية المغزل 15،21، لتحديدرابط جزيئي جديد بين سلسلة Tctex1d2 داينين ​​ضوء وقصيرة المتلازمات ضلع كثرة الأصابع (SRPS) 19، وتحديد وجود صلة جزيئي جديد لفهم كيفية تحور اليوبيكويتين يغاز Mid2 يمكن أن يؤدي إلى الإعاقة الذهنية المرتبطة X 16. وأيضا تطبيق غيرها من المختبرات بنجاح هذه الطريقة، بما في ذلك واحدة هي التي تحدد أن Tctn1، المنظم من الماوس القنفذ الإشارات، وكان جزء من مجمع البروتين المرتبط ciliopathy أن الهدبية ينظم تكوين الغشاء وتكون الأهداب في الطريقة التي تعتمد على الأنسجة 22،23. لذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتشريح أي مسار الخلوي.

خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو اختيار خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP التي تقاوم هيغروميسين. وينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان أن جميع الخلايا في لوحة التحكم لقوا حتفهم قبل اختيار بؤر في لوحة التجريبية لتضخيم. هيغروميسين ويمكن اضافتهاد خلال زراعة الخلايا الروتينية من خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP لزيادة التأكد من أن جميع الخلايا تحافظ على الجينات الموسومة LAP من الفائدة في موقع FRT. ونحن نحذر من أن ليس كل البروتينات الموسومة LAP سوف تكون وظيفية، وأنه من المهم أن يكون فحوصات في المكان التي يمكن استخدامها لاختبار وظيفة البروتين. وتشمل الأمثلة على المقايسات استخدامها لاختبار وظيفة البروتين إنقاذ الظواهر التي يسببها سيرنا وفي المقايسات النشاط في المختبر. لمعالجة أي مشاكل محتملة مع إضافة كبيرة LAP العلامة، ونحن قد ولدت من قبل ناقلات TAP العلامة المتوافقة مع هذا النظام التي تحتوي على علامات أقل، مثل FLAG، والتي هي أقل عرضة للتحول دون وظيفة وتوطين البروتين من الفائدة 4. وبالإضافة إلى ذلك، توجد ناقلات العنونة LAP لتوليد البروتينات الموسومة LAP C-محطة أو البروتينات الموسومة TAP C-الطرفية التي تتوافق مع هذا النظام، والتي يمكن استخدامها في الحالات التي لا يمكن تحمله على LAP / TAP العلامة في ن -terminus من البروتين. بالإضافة إلى ذلك، الالبريد الملح والمنظفات تركيزات مخازن المياه (LAPX N) يمكن تعديلها لزيادة أو تقليل التشدد تنقية إذا لوحظ شيء أو الكثير من التفاعلات. وبالمثل، فإن إجراء تنقية تقارب جنبا إلى جنب هو أكثر صرامة من الإجراءات تنقية وinteractors ضعيفة واحد يمكن أن تضيع، وبالتالي يمكن استخدام نظام تنقية واحد عندما يتم تحديد قليلة أو معدومة interactors.

من المهم أن نلاحظ أن النهج GFP حاتمة علامات أخرى موجودة التي تسمح على نطاق واسع البروتين GFP وضع علامات لتوطين البروتين وتنقية دراسات 24،25. وتشمل هذه النهج BAC TransgenOmics التي تستخدم الصبغيات الاصطناعية البكتيرية للتعبير عن الجينات GFP الموسومة من الاهتمام من بيئتها الأصلية التي تحتوي على جميع العناصر التنظيمية، التي يحاكي التعبير الجيني الذاتية (24). وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت CAS9 / RNA واحد موجهة (sgRNA) المجمعات بروتين نووي ريبوزي (RNPs) لإنهاءعلامة ogenously الجينات في المصالح مع نظام تقسيم GFP التي تسمح للتعبير عن الجينات GFP الموسومة من مواضع الجيني الذاتية الخاصة بهم 25. على الرغم من أن كلا من هذين النهجين تمكين التعبير عن البروتينات الموسومة تحت الظروف المحلية، مقارنة مع بروتوكول LAP وضع العلامات الموصوفة هنا، أنها لا تسمح للتعبير عن محرض والانضباطي من الجينات ذات الكلمات الدلالية المصالح. بالإضافة إلى ذلك، لديهم حتى الآن ليتم تطبيقها على حاتمة جنبا إلى جنب علامات للالتونسية. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن أنظمة العلامات الأخرى كما يمكن تعديلها لتصبح متوافقة مع النظام المذكور هنا لتوليد خطوط الخلايا مستقرة الموسومة حاتمة محرض. على سبيل المثال، قد حصل على تحديد البيوتين التي تعتمد على القرب (BioID) اهتماما كبيرا نظرا لقدرتها على تحديد العلاقات المكانية والزمانية بين البروتينات التفاعل 26. هذه التقنية تستغل اندماج البروتين لسلالة منحل للالاشريكية القولونية البيوتين يغاز البيرة، التي biotinylateق أي البروتين داخل ~ 10 نانومتر دائرة نصف قطرها من الانزيم. البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثم يتم تقارب تنقيته باستخدام القبض على البيوتين تقارب وتحليلها لتكوين بواسطة مطياف الكتلة. سوف البيرة biotinylate أي بروتين على مقربة، حتى عابر، الأمر الذي يجعل من مناسبة خاصة للكشف عن شركاء ضعف التفاعل داخل مجمع (27). بالإضافة إلى ذلك، لا يستلزم نظام تنقية أن الذاتية تفاعلات البروتين البروتين لا تزال سليمة ويمكن تنفيذها في ظل ظروف تغيير طبيعة، وبالتالي تقليل معدل من ايجابيات كاذبة. ضمن البروتوكول الحالي لدينا، يمكن الاستعاضة عن ناقلات pGLAP1 بواسطة ناقل البيرة وضع العلامات تحويل هذا النظام من تحديد تفاعلات البروتين البروتين على أساس التقارب إلى كشفها على أساس القرب. ومن شأن هذا النظام أن يكون مفيدا للغاية للكشف عن التفاعلات البروتينية عابرة كما هو الحال بين كثير من التفاعلات الانزيم الركيزة ولرسم خرائط الزمانية المكانية الأسواق العالمية ضغطها البروتين البروتينractions داخل هياكل محددة كما نفذت لالجسيم المركزي وأهداب 26،28.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم NSF-MCB1243645 (JZT) ، وأي آراء ونتائج واستنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Flp-In T-REx Core KitInvitrogenK6500-01Kit لتوليد خطوط الخلايا التي تحتوي على موقع FRT وتعبير TrtR
PETG, 5xNunc, Inc. 73520-734زجاجة أسطوانية للخلايا المتنامية
PETG، 2.5xNunc، Inc. 73520-420زجاجة أسطوانية للخلايا المتنامية
مكدسات الخلاياCorning CellSTACK3271مكدس الخلايا للخلايا المتنامية
500 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية Corning  ؛431123أنابيب لحصاد الخلايا
الأجسام المضادة المضادة ل GFPInvitrogenA11122الأرانب المضادة للجسم المضاد GFP
Affiprep Protein A حباتBiorad156-0006تستخدم كمصفوفة لتصريف الأجسام المضادة ل GFP
ثنائي ميثيل بيميليميديت (DMP) ThermoFisherScientific21667تستخدم لاقتران الأجسام المضادة المضادة ل GFP إلى حبات البروتين
A TLA100.3Beckman349622Tubes لتحلل البروتين بالطرد المركزي أثناء خطوة المقاصة
TEV proteaseInvitrogen12575-015تستخدم لشق علامة GFP من البروتينات التي تحمل علامة LAP الطرفية N
Precession ProteaseGE Healthcare27-0843-01تستخدم لشق علامة GFP من البروتينات ذات العلامات LAP الطرفية C
S-protein agaroseNovagen69704تستخدم كمصفوفة تقارب ثانية أثناء تنقية مجمعات البروتين الموسومة ب LAP
QIAquick DNA gel kitQiagen28704/28706للاستخدام في تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من هلام الاغاروز
BP clonase IIInvitrogen11789020يستخدم لاستنساخ منتجات ORF PCR في ناقل المكوك pDONR221
LR clonase IIInvitrogen11791020تستخدم لاستنساخ ORF للجين المعني في ناقل علامات pGLAP1 LAP
ccdB< em> Survival 2 T1R E. coliInvitrogenA10460يستخدم لترويج نواقل المكوك وناقلات pGLAP الفارغة
Fugene 6PromegaE2691كاشف التعدي لنقل النواقل إلى الخلايا البشرية
TetracyclineInvitrogenQ100-19دواء للحث على تعبير البروتين المحفز Dox / Tet   ؛
دوكسيسيكلينClontech631311دواء للحث على تعبير البروتين المحفز Dox / Tet  
عقار Hygromycin BInvitrogen10687010لاختيار مواد التكاملات المستقرة الموسومة
LAP KanamycinCorning61-176-RGدواء لاختيار المستعمرات البكتيرية المقاومة للكاناميسين
AmpicillinFisherBP1760-5دواء لاختيار المستعمرات البكتيرية المقاومة للأمبيسلين
4-20٪ Tris Glycine SDS-PAGE المواد الهلاميةBiorad4561094تستخدم لفصل عينات البروتين وتنقية علامة LAP النهائية لإزالة
Stain Plus KitBiorad1610449تستخدم لتلوين الفضة ومواد التقشير والعينات التي تم جمعها طوال عملية التنقية & nbsp ؛
Coomassie Blue stainInvitrogenLC6060يستخدم لتلوين المواد الهلامية SDS-PAGE لرؤية التنقية الموسومة ب LAP والاستغناء عن نطاقات البروتين ، ناقل المكوك المتوافق مع قياس الطيف الكتلي
pDONR221Invitrogen12536017ناقل المكوك لاستنساخ ORFs للجينات ذات الأهمية
Flippase التي تعبر عن ناقلات pOG44InvitrogenV600520المتجه الذي يعبر عن إعادة تركيب Flippase لدمج الجينات الموسومة ب LAP في جينوم موقع FRT الذي يحتوي على خطوط الخلايا
Platinum Taq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific10966018 يستخدم لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل ORFs للجينات ذات الأهمية
4x عازلة عينة LaemmliBiorad1610747عينة عازلة لتصفية مجمعات البروتين المنقاة الموسومة ب LAP من وسائط مصفوفة الخرزة
مرق لوريا (LB)فيشرBP9723-2يستخدم لزراعة DH5 & alpha البكتيريا
مجموعة الحمض النووي miniprepPromegaA1222تستخدم لصنع الحمض النووي بلازميد minipreps
وسائط DMEM / F12HycloneSH30023.01لزراعة خلايا Hek293
البشرية FBS التي تفتقر إلى TetAltanta BiologicalsS10350تستخدم لصنع وسائط -Tet DMEM / F12 لتوليد وتنمية خطوط الخلايا المستقرة المحفزة الموسومة بعلامة LAP
TrypsinHycloneSH30042.01لرفع بؤر خلية Hek293 من الألواح أقراص
مثبطات البروتيازRoche11836170001تستخدم لصنع مخازن بروتوكولية خالية من EDTA
10٪ نونوكسي بولي إيثوكسي إيثانول   ؛Roche11332473001تستخدم لصنع مخازن بروتوكول
PBSCorning21-040-CMتستخدم لصنع مخازن البروتوكول
Tween-20FisherBP337-500تستخدم لصنع مخازن البروتوكول
بورات الصوديومفيشرS249-500تستخدم لصنع مخازن البروتوكول
حمض البوريكفيشرA78-500تستخدم لصنع مخازن البروتوكول
الإيثانولامينكالبيوتشيم34115يستخدم لصنع مخازن البروتوكول
NaClFisherP217-3يستخدم لصنع مخازن البروتوكول
KClFisherBP358-10يستخدم لصنع مخازن البروتوكول
Dithiothreitol (DTT) FisherBP172-25يستخدم لصنع مخازن البروتوكول
MgCl2< / sub>FisherM33-500تستخدم لصنع المخازن المؤقتة للبروتوكول
قاعدة تريسفيشرBP152-5تستخدم لصنع المخازن المؤقتة للبروتوكول
ب Silver

المراجع

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  3. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
  4. Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
  5. LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
  6. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
  7. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
  8. ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
  9. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
  10. Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
  11. Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
  12. Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
  14. Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
  15. Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
  16. Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
  17. Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
  18. Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
  19. Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
  20. Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
  21. Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
  22. Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
  23. Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
  24. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
  25. Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
  26. Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
  27. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
  28. Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HEK293 SDS PAGE
محرض الموسومة LAP خطوط الخلية مستقرة للتحقيق في وظيفة البروتين، الزمانية المكانية التعريب وشبكات التفاعل البروتين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.