مقالة منهجية

المناعية الأقسام مملوءة Biocytin والمجهزة لالكيميائية العصبية علامات

DOI:

10.3791/54880

⸱

ديسمبر 31, 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لاسترداد المورفولوجية من الخلايا العصبية مصححة خلال التسجيلات الكهربية باستخدام ملء biocytin وتحليل نتائج المناعى لاحق. وتبين لنا أن أقسام مليئة biocytin السميكة التي كانت ملطخة وcoverslipped يمكن restained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية أو أشهر في وقت لاحق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمحت التسجيلات الكهربية للخلايا باستخدام تقنية المشبك التصحيح لتحديد أنواع الخلايا العصبية المختلفة استنادا إلى أنماط اطلاق النار. إدراج biocytin / neurobiotin في القطب تسجيل يسمح الانتعاش خاصة بعد من التفاصيل الشكلية، والتي هي ضرورية لتحديد تشجر شجيري والمناطق المستهدفة من قبل محاور الخلايا العصبية المسجلة. ومع ذلك، ونظرا لوجود الخلايا العصبية مشابهة شكليا مع الهويات وظائف الكيميائية العصبية واضحة، وتلطيخ المناعى للبروتينات الخلية من نوع معين ضروري لتحديد نهائيا الخلايا العصبية. للحفاظ على الاتصال بالشبكة، يتم إعداد أقسام الدماغ للتسجيلات فسيولوجية في سمك 300 ميكرون أو أكبر. ومع ذلك، هذا السمك غالبا ما يعوق تحليل نتائج immunohistological بسبب القضايا مع اختراق الأجسام المضادة، مما استلزم resectioning من الأنسجة. Resectioning من شرائح هي فن تحديا، وغالبا ما بالنتيجهتينغ في فقدان الأنسجة والتشكل من الخلايا التي تم الحصول على بيانات الكهربية، مما يجعل البيانات غير صالحة للاستعمال. منذ استعادة التشكل من شأنه أن يحد فقدان البيانات ودليل في اختيار من علامات العصبية، فقد اعتمدنا استراتيجية لاستعادة شكل الخلية الأولى، تليها المناعية الثانوية. ونحن نقدم نهج عملي لbiocytin ملء خلال التسجيلات الفسيولوجية والمناعية التسلسلي لاحق لاسترداد التشكل، تليها restaining الفروع لتحديد هوية الكيميائية العصبية. نفيدكم أن المقاطع التي كانت مليئة biocytin ثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA)، الملون، وcoverslipped يمكن إزالة وrestained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية في وقت لاحق. وتنطوي هذه restaining إزالة ساترة، وغسل المقاطع في حل العازلة، واحتضان الأجسام المضادة الأولية والثانوية للكشف عن هوية الكيميائية العصبية. هذه الطريقة مفيدة للقضاء على داتخسارة بسبب عدم القدرة على استعادة التشكل ولتضييق علامات الكيميائية العصبية التي سيتم اختبارها على أساس التشكل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المعروف أن الدماغ التنوع في الخصائص الهيكلية والوظيفية من عناصر الخلايا العصبية الفردية لها. فهم الأدوار من أنواع الخلايا العصبية واضحة في وظيفة الدماغ وعلم الأمراض يتطلب توصيف وتحديد واضح للالخلايا العصبية. هيكليا، وملامح شكلية محددة حسب الموقع somato-شجيري تحدد المدخلات المحتملة التي تتلقى الخلايا العصبية معينة، في حين أن نمط تشجر محور عصبي ويحدد الأهداف بعد المشبكي المحتملة. كما تم تقدير التنوع الهيكلي من الخلايا العصبية منذ أيام الدراسات النسيجية المنوية رامون كاجال ذ ل 1. وكشف ظهور تقنيات التسجيل وحيدة الخلية أن الخلايا العصبية متميزة هيكليا تظهر أيضا اختلافات في أنماط اطلاق النار وخصائص متشابك. التنوع في هيكل وعلم وظائف الأعضاء واضح بشكل خاص في GABAergic الخلايا العصبية المثبطة 2،3. وبالإضافة إلى ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن structurallيمكن أن الخلايا العصبية مماثلة ص التعبير عن علامات الكيميائية العصبية المختلفة وعرض المقابلة الاختلافات 4 الوظيفية. وبالمثل، يمكن أن الخلايا العصبية مع نفس علامات العصبية الكيميائية لديها هياكل ووظائف 5-10 متميزة. وهكذا، في الممارسة العملية، وتحليل الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية ودورها في شبكة يستلزم تحديد كل من الهويات المورفولوجية والكيميائية العصبية. حتى مع ظهور خطوط الماوس مراسل تستهدف علامات الكيميائية العصبية محددة، غالبا ما يكون من الضروري تحديد التشكل والهوية النوع الفرعي على أساس immunohistology 11.

الطريقة القياسية المستخدمة في وصف الخلايا المسجلة في شرائح الدماغ الحادة هو لملء هذه الشواغر مع biocytin أو neurobiotin أثناء التسجيل، وتحديد المقاطع في امتصاص العرق (PFA) بعد التسجيلات، واستخدام المناعية للكشف عن التشكل والكيمياء العصبية. منذ سمك أقسام لعلم وظائف الأعضاء شريحة وعادة ما تكون 300 ميكرونأو أكثر، وذلك لأن معظم الأجسام المضادة تفشل في اختراق على طول الطريق من خلال هذا العمق، تحتاج إلى شرائح لإعادة مقطوع إلى 60 ميكرون أو أقل للسماح المناعية وقت واحد لbiocytin وعلامات الكيميائية العصبية 12-14. للأسف، resectioning هي شاقة. مخاطر فقدان الأنسجة أثناء باجتزاء. ويمكن أن يؤدي إلى التفاضلية انكماش الأنسجة، وتعقيد عمليات إعادة البناء الصرفي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن معرفة مسبقة التشكل تساعد تضييق علامات المرشح التي من المحتمل أن يتم التعبير عنها من قبل الخلايا. لقد قمنا بتعديل البروتوكولات immunohistology biocytin القياسية للسماح معالجة التسلسلي أقسام أولا لاسترداد التشكل ومن ثم لتحديد علامات الكيميائية العصبية المحتملة.

المناعية هو دراسة توزيع مستضد في الأنسجة أو الخلايا ويمكن تصور باستخدام انزيم، والعلامات الفلورية، والعناصر المشعة، أو جزيئات الذهب الغروي 15. ط الداخليnvolves باستخدام الأجسام المضادة الأولية لوضع علامة على وجه التحديد وتضخيم واحد أو أكثر تحديدا مولدات المضادات، تليها استخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية استهداف الأجسام المضادة الأولية التصور. نظرا للحاجة للتمييز بين أطياف مضان من كل الأجسام المضادة الثانوية دون تداخل، يمكن فحص سوى عدد محدود من مولدات المضادات في وقت واحد. وهكذا، يمكن معرفة مسبقة التشكل يكون مفيدا في اختيار العلامات الكيميائية العصبية مرشح لتصنيف الخلايا. من الناحية النظرية، ويستند الأساس المنطقي وراء معالجة التسلسلي أقسام ملطخة بالفعل على فرضية أن immunolabeling للبروتين واحد أو الببتيد لا ينبغي أن تتداخل مع استضداد وimmunolabeling لاحق لالببتيد مستقلة هيكليا 16. وهذا الافتقار إلى التدخل من المقرر أن الربط من الأجسام المضادة لبروتين حاتمة محددة على مستضد ويسمح لتلطيخ المتزامن لمستضدات متعددة في نفس النسيج بالتالي. عدد مستضدات revealeد كتبها المناعية محدودة بسبب الحاجة إلى أطياف غير متداخلة من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية والحاجة لاستهداف مستضدات الفردية مع الأجسام المضادة التي أثيرت في الأنواع المختلفة وذلك للقضاء عبر التفاعل 17،18. في حين أن هذا هو السبب وراء وضع العلامات المسلسل بدلا من المتزامن مع اثنين من الأجسام المضادة المميزة التي قد تتفاعل، على حد علمنا، المناعية للمستضد الثانية التي لم يتم الإبلاغ عنها بعد الانتهاء من immunolabeling للمستضدات واحد أو أكثر من الفروع التي شنت. هنا، نحن تصف طريقة لالمناعية التسلسلي أقسام الملون سابقا والتي شنت. في حين أننا التفاصيل هذه العملية لإجراء immunolabeling التسلسلي لاسترداد مورفولوجيا تليها تلطيخ لعلامات بروتين / الببتيد في أبواب سميكة، ونفس الإجراءات التي يمكن استخدامها في مستوى والأقسام النسيجية رقيقة أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف نهجا عمليا لملء الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin وعملية لإزاحةالقطب من الخلية عند الانتهاء من التسجيلات لتحسين ملء محور عصبي والعرش الجذعية من الخلايا العصبية، كما وردت في منطقتنا 6،8 العمل مؤخرا.

الميزة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو موضح هنا هي أن مورفولوجية الخلية سجلت يمكن استردادها بالكامل وتصوير قبل محاولة استئصال أو immunostain شرائح. على الرغم من القضايا مع تغلغل بعض الأجسام المضادة قد تجعل من الضروري شرائح استئصال لالمناعية الثانوية، فإن الإجراءات المفصلة هنا تلغي الحاجة إلى إعادة بناء الخلايا العصبية المعقدة من مقاطع متعددة، وسوف تتجنب القضايا بسبب فقدان الأنسجة وتقلص الفارق الذي يمكن أن تمس إعادة الإعمار بعد resectioning. ميزة إضافية هي أن هذه العملية سوف تقلل التكلفة والوقت والجهد، والأجسام المضادة مكلفة عن طريق الحد من المناعية وإعادة باجتزاء إلى شرائح التي يتم استرداد الخلايا العصبية مليئة biocytin. الجانب الأكثر عملية هو الإعلانالمناعية المشروط التي يمكن القيام بها على أقسام ملطخة أشهر قبل استخدام هذه التقنية المذكورة آنفا. على وجه الخصوص، فإن التعافي من مورفولوجيا تقلل إلى حد كبير من إمكانية أن البيانات الفسيولوجية من الخلايا يتم تجاهل نظرا لعدم القدرة على الحصول على التوصيف المورفولوجي الأساسية من نوع من الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biocytin الحشوة خلال الكهربية

ملاحظة: يمكن للقراء الرجوع إلى مصادر بديلة للتقنيات الأساسية التصحيح، المشبك تسجيل والأجهزة 19-22، والتي لا ترد تفاصيلها هنا. تفترض الخطوات المفصلة هنا أن المعدات والإجراءات للحصول على تسجيلات التصحيح المشبك تنشأ بالفعل، وسوف يقتصر على وصف لتفاصيل تتعلق biocytin، وملء المناعية بعد خاص. تم إجراء جميع التجارب المذكورة في هذه المخطوطة على الفئران.

  1. باستخدام vibratome، وإعداد أقسام الدماغ حية للمنطقة المطلوبة في سمك 300-350 ميكرون 23.
  2. يعد حل داخلي تحتوي على 0.2٪ biocytin بإضافة 2 ملغ من biocytin إلى 1 مل من محلول داخلي 6. للحصول على أفضل النتائج، يصوتن الحل الداخلي ل10-15 دقيقة حتى يذوب biocytin تماما. المقبل، تحميل حل داخلي في حقنة 1 مل مزودة 0.2 &# 160؛ ميكرون المسام مرشح حجم البولي بروبلين طرف تعلق على microloader. الحفاظ على هذا حقنة تحميل على حزمة الباردة للحفاظ على استقرار المغنيسيوم ATP ونا GTP في حل داخلي.
    ملاحظة: حل داخلي تحتوي على غلوكونات البوتاسيوم (126 ملي K-غلوكونات، 4 ملي بوكل، 10 ملي HEPES، 4 مم المغنيسيوم، ATP، 0.3 ملي نا-GTP، و 10 فسفوكرياتين ملم) هو الأمثل لاسترداد بعض علامات الكيميائية العصبية، بما في ذلك parvalbumin، خلال immunolabeling. في تجربتنا، وذلك باستخدام cesium- والحلول الداخلية القائمة على كلوريد يقلل من القدرة على استرداد المناعية لبعض العلامات الكيميائية العصبية. Neurobiotin أو، قابل للتثبيت، التتبع القطبي خلايا impermeant الجمع بين اليكسا Fluorophore مع biocytin يمكن أن تستخدم كبديل للbiocytin.
  3. تحت الأشعة تحت الحمراء على النقيض تدخل الفرق، تصور الخلية المناسبة للتسجيل. للحد من أي اختلال عصبي، الاقتراب من خلايا الجسم عن طريق خفض ماصة على طول محورها باستخدام "نهج" ومرهم متوفرة في معظم micromanipulators. إنشاء تسجيلات خلية كاملة تحت التفاضلية الأشعة تحت الحمراء تدخل التباين باستخدام التصحيح، المشبك بروتوكولات علم وظائف الأعضاء 19-22.
    ملاحظة: تجنب الاقتراب من خلية من اتجاه محور عصبي المفترضة، كما أنه سيتم قطع محور عصبي، تصور على أنها فقاعة في نهاية قطع (السهم الأخضر في الشكل 1). أيضا، وتجنب الضغط إيجابية عالية لماصة تسجيل في حين تقترب من خلية للحد من التسرب من biocytin، الأمر الذي سيؤدي في تلوين الخلفية عالية.

figure-protocol-1
الشكل 1. اقترح طائرة لمقاربة خلايا لBiocytin فلس. وتوضح الصورة خلية الحبيبة (GC) ملء مع biocytin أثناء التسجيل التي تم تجهيزها للكشف عن biocytin (باللون الأحمر باستخدام streptavidin 594 مترافق). القيادة العامة لديها التشعبات الموجه نحو في الطائرة س ص. لاحظ الخلية الحبيبية قطعتمحور عصبي (السهم الأخضر) بسبب حركة ماصة على طول الطائرة XY. لاحظ أنه من المثالي لتناول هذه الخلايا العصبية على طول الطائرة XZ. شريط الحجم: 50 ميكرون.

  1. في التكوين المشبك الجهد، وتحديد السعة خلية كاملة والمقاومة سلسلة في استجابة للمشاريع الصغيرة (5 فولت)، وجيزة (30 مللي) الجهد الخطوات باستخدام باستخدام اختبار وظيفة الغشاء في وضع الحمام في الحصول على البيانات الكهربية وبرامج التحليل. وهذا يضمن تهيئة الظروف تسجيل خلية كاملة للسماح biocytin-التعبئة.
  2. إجراء التسجيلات الفسيولوجية في وضع إما current- أو الجهد المشبك حسب الحاجة. الحد الأدنى من الوقت تسجيل> 10 دقيقة في 34 ° C مثالي.
    قد تكون هناك حاجة أوقات أطول تسجيل للدراسات أجريت في درجة حرارة الغرفة: ملاحظة.
  3. عند الانتهاء من التسجيلات الفسيولوجية، وإعادة تأسيس التكوين التصحيح، المشبك عن طريق تحريك ببطء ماصة تسجيل في خطوات صغيرة، بالتناوب أعلى (على طول المحور Z) والخارج (على طول المحور السيني) في وضع الجهد المشبك.
  4. في نفس الوقت مراقبة السعة وإدخال المقاومة باستخدام وظيفة "غشاء اختبار" لتصور فقدان العابرين بالسعة وانهيار الاستجابات الحالية للخط مستقيم، مما يدل على إعادة الختم للخلية وإنشاء خارج-الملتحقين التصحيح في الطرف ماصة. وعقد الخلية في إمكانية استقطابها (-40 بالسيارات) تسهيل عملية ختم إعادة.
    ملاحظة: هذا الإجراء لإزالة خلية عادة يضمن الشفاء التام من سوما والتشعبات. لا تنطبق ضغط إيجابي على ماصة تسجيل خلال هذا الإجراء أو أثناء فصل الخلية من ماصة. تصور سوما الخلية المسجلة في شريحة يشير فك الارتباط الناجح. وجود الحطام الخلوي أو التصحيح الغشاء في نهاية غيض فصل يشير عادة خلع سوما ولن تسفر عن التشكل الخلوي الكامل.
  5. الخلفإيه فصل ماصة من الخلية، الإبقاء على شريحة في غرفة تسجيل ل3-5 دقيقة لضمان النقل للصباغة إلى شجيري القاصي وعمليات محور عصبي.
  6. نقل شرائح لوحة 24-جيدا تحتوي على 4٪ PFA لتثبيت.
    تنبيه: PFA غير مسرطنة، ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات وقناع الوجه، يجب أن تستخدم لتجنب تهيج الجلد والاستنشاق. PFA غير قابلة للاشتعال ويجب أن يبقى بعيدا عن متناول النار. PFA أبدا التخلص منها في استنزاف ويجب جمع مثل النفايات الكيميائية. يجب أن تكون معزولة PFA تثبيت من المناطق تستخدم لإعداد شريحة مباشرة لتجنب التلوث من الإعداد علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك ماصات نقل.
  7. 24 - 48 ساعة بعد PFA تثبيت، نقل شرائح إلى 0.1 مخزنة الفوسفات-M المالحة (PBS) للتخزين قبل المناعية.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، biocytin الانتعاش والمناعية وأفضل عندما يقوم بعد تثبيت قريبا، على الرغم من أن في تلطيخ شكلت ضمن 7 أيام من عوائد تثبيت نتائج جيدة. يمكن الحفاظ على الشرائح في برنامج تلفزيوني مع 0،02-0،05٪ أزيد الصوديوم لتلطيخ يؤديها وتصل إلى أكثر من 90 يوما بعد التثبيت. على الرغم من تثبيت بين عشية وضحاها في PFA يعمل بشكل جيد بالنسبة لمعظم الأجسام المضادة، فمن الممكن أن بعض الأجسام المضادة تعمل بشكل أفضل عندما يتم تخفيض مدة الحضانة في تثبيتي. تثبيت في منهاج العمل لأكثر من 48 ساعة يقلل من توافر المضادات ويقلل من فرص المناعية الثانوية الناجح للعلامات الكيميائية العصبية.
    تنبيه: أزيد الصوديوم خطرة للغاية ومهيجة على تماس مع الجلد أو العينين أو على الابتلاع أو الاستنشاق. شديد الإفراط في التعرض يمكن أن ينتج في الموت. ليست معروفة على السرطنة وطفرات من المجمع. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات والنظارات الواقية البداية، معطف المختبر، وجهاز تنفس الغبار. لم يتم التخلص أزيد الصوديوم في استنزاف ويجب جمع مثل النفايات الكيميائية.
e_title "> 2. تلطيخ للالابتدائية الضد الأول وBiocytin

(اليوم 1)
ملاحظة: الإجراء المناعية التالية لأقسام التعويم الحر ويتطلب المستمر اهتزاز في سرعة منخفضة (2 الثورات / دقيقة، ودورة في الدقيقة) على شاكر لجميع الخطوات الحضانة.

  1. غسل 3X الأنسجة لمدة 10 دقيقة في كل من 0.1 M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
    ملاحظة: 0.1 M برنامج تلفزيوني يمكن شراؤها تجاريا أو مصنوعة في المختبر على النحو التالي (يجعل 1 L): 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من بوكل، 1.44 غرام من نا 2 هبو 4، و 0.24 غرام من KH 2 PO 4 في 1 L من 2 درهم 0.
    ملاحظة: إذا كان يعرف علامة الكيميائية العصبية المطلوب، تلطيخ لبروتين / الببتيد يمكن القيام بها في وقت واحد مع التلوين biocytin (الخطوات 2،2-2،4). إذا تلطيخ لbiocytin فقط، انتقل إلى الخطوة 2.5.
  2. اختياري: كتلة مع 10٪ حجب المصل (BS، العادي مصل الماعز (خ ع) المخفف في 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة عند RT).
    ملاحظة: كل يجب أيضاتلقي نفس الحجم من الحل. حجم الموصى بها هي بين 250-500 ميكرولتر / جيد. ويستند اختيار المصل الحجب على الأنواع التي ينشأ فيها الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، يتم استخدام NGS لصبغ مترافق الماعز المضادة (أنواع الأجسام المضادة الأولية منها)). إذا دعت الحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي أثيرت في الأنواع المختلفة لimmunostain أقسام، تشمل 10٪ من كل مصل طبيعي في عرقلة الخطوة (2) و 3٪ من كل المصل العادي للخطوات الأجسام المضادة حضانة الابتدائية والثانوية.
  3. (اختياري) احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الأولية، CB 1 R (بولكلونل، خنزير غينيا) مع 0.3٪ تريتون X-100، و 3٪ بكالوريوس في 0.1 M برنامج تلفزيوني في RT O / N. يستخدم CB 1 R لتحديد الحشيش نوع مستقبلات 1 التعبير.
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وليس مطلوبا للكشف عن ملء biocytin. ويوضح الشكل 2 القسم المسمى لbiocytin وCB 1 R أثناء عملية تلطيخ الأولى. O / N incubation في RT كافية لمعظم الأجسام المضادة الأولية. ومع ذلك، فإن بعض الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك بناء القدرات 1 R، تتطلب 3-5 د من الحضانة. إذا كانت الحضانة يجب أن يكون أطول من 1 د، فمن المستحسن أن احتضان عند 4 درجات مئوية بسبب تريتون X-100 يمكن permeabilize شرائح ويمكن أن يؤدي إلى تفكك الأنسجة أثناء حضانة طويلة في درجة حرارة الغرفة. تشمل السيطرة السلبية التي تفتقر إلى الأجسام المضادة الأولية في قسم واحد على الأقل لكل سلسلة من التجارب كعنصر تحكم لخصوصية الأجسام المضادة الثانوية. لضوابط السلبية، تم حذف الأجسام المضادة الأولية، ولكن 0.3٪ تريتون X-100 في 0.1 M برنامج تلفزيوني وBS تضاف.

figure-protocol-2
الشكل 2. نجاح CCK تلطيخ 1 أسبوع بعد استرداد Biocytin تلطيخ وC annabinoid مستقبلات النوع 1 (CB 1 R) - <قوي> وضع العلامات. (A - C) وصور متحد البؤر في 60X تظهر الخلايا العصبية مليئة biocytin (A) وCB 1 R مناعية (B)، التي أشار إليها رأس السهم. تم تجهيز القسم نفسه لالمناعية CCK بعد 1 أسبوع (C). يظهر تراكب الصور في التطوير. وقد كشفت CCK مناعية باستخدام النطاق الأحمر والملونة الزائفة في السماوي. (E) إعادة البناء الصرفي للخلية مليئة biocytin في A. ملاحظة أن biocytin وCB 1 R تلطيخ جلية حتى بعد المناعية CCK الثاني. لاحظ أيضا توزيع المتوقع سي بي 1 R وأنماط المناعية CCK. (F - H) صورة مكبرة من محور عصبي من الخلية، كما في ألف، وتظهر وثيقة شارك في توطين biocytin وCB 1 R في محاور (رؤساء السهم). مقياس شريط: 50 ميكرومتر (A - D)، و 100 ميكرون (E)، و 10 ميكرون ( وآخرون. 2015 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

(يوم 2)

  1. غسل الدماغ أقسام 3X لمدة 10 دقيقة في كل من 0.1 M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
  2. احتضان المقاطع في streptavidin المترافقة صبغة حمراء (تركيز: 1: 1000، الإثارة: 594 نانومتر مع الانبعاثات في الطيف الأحمر المرئي) مع 0.3٪ تريتون X-100 و 3٪ بكالوريوس في 0.1 M برنامج تلفزيوني في 4 درجات CO / N في الظلام (ملفوفة في رقائق الألومنيوم) للكشف عن biocytin. اختياري: وتشمل الأجسام المضادة الثانوية، عنزة خنزير مكافحة غينيا (تركيز: 1: 500، الإثارة: 488 نانومتر، والانبعاثات باللون الأخضر)، مع حضانة أعلاه إذا بعد الحضانة الأولية الاختيارية في الخطوة 2.3.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية سوف تكون هناك حاجة فقط إذا أجري اختياري الأجسام المضادة الأولية تلطيخ (خطوة 2.3). لتصور biocytin، وتعزيز بنية الشعويوصى المكورات ptavidin-fluorophore مع طيف الانبعاث باللون الأحمر، لأنها تساعد على تصور محاور الدقيقة في التفاصيل ومع أفضل النقيض من ذلك (الشكلان 1-3). خلال المناعية ضعفين أو ثلاثة أضعاف، من أجل تجنب انتقال تفاعل الأجسام المضادة الثانوية مع بعضها البعض، إضافة الأجسام المضادة الثانوية واحدا تلو الآخر على نحو تسلسلي (2 ح الفاصلة بين الإضافات المسلسل من الأجسام المضادة غير كافية). ويوضح الشكل 3A خلية مليئة biocytin معالجتها دون اختياري الأجسام المضادة الأولية تلطيخ وتصويرها قبل resectioning.

figure-protocol-3
الشكل 3. المناعية الثاني الناجح في أعقاب انتعاش Biocytin الصرف وResectioning. (A1) متحد البؤر صورة 300 ميكرون شريحة تظهر انتعاش التشكل شجيري خلية مليئة biocytin. (<قوية> A2) آثار غشاء الجهد من الخلايا العصبية في استجابة ل+500 و-100 حقن الجارية للسلطة الفلسطينية. (ب) استرداد سوما مليئة biocytin في 50 ميكرون القسم تم الحصول عليها بعد resectioning القسم 300 ميكرون (في A1) بعد تصاعد والتصوير. (B2) المناعية اللاحقة من قسم رقيقة كشف colocalization من سوما مليئة biocytin (اللوحة اليمنى) مع CCK (لوحة المتوسطة). ويتضح الصورة المدمجة في اللوحة اليمنى. شريط الحجم: 50 ميكرون. ويرد وحة A2 بإذن من يو وآخرون. في الصحافة 25. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

(يوم 3)

  1. 3X أقسام الدماغ غسل لمدة 10 دقيقة في كل من 0.1 M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
  2. لحماية مضان ولتسهيل إعادة تلوين في المستقبل، جبل ثانيةستعقد في المتوسطة المتزايدة على أساس مائي وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة.
    ملاحظة: فمن الأفضل أن restain أقسام في أقرب وقت ممكن لتجنب الصعوبات في إزالة طلاء الأظافر من الشريحة، والعفن الإصابة، وجفاف الأنسجة بسبب تسرب المتوسطة المتزايدة من شريحة زجاجية. التلوث الميكروبي يمكن الوقاية منها باستخدام 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: أزيد الصوديوم عالية السمية وقابل للاشتعال عندما يكون في اتصال مع الماء. يرجى الرجوع إلى إجراءات التشغيل الموحدة لمعالجة والتخلص من المواد الكيميائية الخطرة.
    (أيام 4-7)
  3. أداء التصوير متحد مع الإثارة في 594 و 488 نانومتر، وفي التكبير من 20X أو 40X للكشف عن الخلايا العصبية مليئة biocytin في علامات حمراء والكيميائية العصبية (CB 1 R) باللون الأخضر. تقييم colabeling (الشكل 2).
  4. تعيين تعرض الكاميرا إلى أقل من 100 مللي ثانية إلى تجنب photobleaching من وobtaفي مداخن صورة مبائر من العرش محور عصبي وشجيري من الخلايا العصبية بأكملها. استخدام مبائر مداخن صورة والعصبية تتبع حزم البرمجيات لإعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية.

3. تلطيخ من الأجسام المضادة الأولية الثانية

ملاحظة: على الرغم من أن خطوة المناعية الثانية لا يمكن أن يؤديها 90 د بعد تلطيخ الأول، ويتحقق تلطيخ الأمثل إذا أجري الثاني تلوين الأجسام المضادة الأولية داخل 7-10 د.

(بعد 7-90 د)

  1. تطبيق الأسيتون إلى قطعة من القطن وتجريد طلاء الأظافر الخروج من شريحة زجاجية.
  2. إزالة ساترة بعناية باستخدام ملقط غرامة طرف ووضع بضع قطرات من 0.1 M برنامج تلفزيوني على الأقسام.
  3. بعناية إزالة مقاطع من الشريحة باستخدام فرشاة الطلاء الجميلة وغسلها في 0.1 M برنامج تلفزيوني لمدة 24 - 48 ساعة على شاكر مغطاة بورق الألومنيوم في ضوء انخفاض في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم جدا لتغطية الفروع معاحباط luminum لتجنب photobleaching من.
  4. لضمان إزالة كاملة من المتوسطة المتزايدة، وغسل أقسام 1 - 2X في اليوم التالي في 0.1 M برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
  5. المضي قدما في حضانة في الأجسام المضادة الأولية الثانية (على سبيل المثال، كوليسيستوكينين، ونيوروبيبتيدي وجدت في بعض interneurons GABAergic (CCK، تركيز: 1: 1000، الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة)) لمدة 1 د (الشكل 2).
    ملاحظة: هذا الإجراء يشبه إلى الخطوة 2.3 ولكن يستخدم الأجسام المضادة المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، تم حذف خطوة حجب خلال إعادة تلوين.
  6. غسل أقسام الدماغ ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل من 0.1 M برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
  7. وصمة عار مع الثانوية الضد الماعز المضادة للماوس fluorophore مترافق (تركيز: 1: 500، الإثارة الطول الموجي: 647 نانومتر)، والتأكد من أن أطياف الإثارة الانبعاثات من الأجسام المضادة الثانوية لا تتداخل مع streptavidin (تركيز: 1: 1000. الإثارة الطول الموجي: 594 نانومتر) والمناعي مسبقالبقع.
  8. جبل الأقسام في وسط تصاعد مائي وختم حواف الغطاء زلة مع طلاء الأظافر واضحة.
    ملاحظة: تخزين المقاطع في 4 درجات مئوية في صندوق تخزين مبهمة لحماية مضان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند الانتهاء بنجاح، تحتفظ أقسام التعبئة biocytin وimmunolabeling أجريت في الخطوة 2 ويمكن تصوير باستخدام متحد البؤر أو المجهري epifluorescence. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أقسام معالجتها تظهر أيضا المناعية للمستضد المسمى أثناء معالجة لاحقة في الخطوة 3. في قسم موضح في الشكل رقم 2، تم الكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية مليئة biocytin في قسم سميكة (300 ميكرون) باستخدام streptavidin تصور في الحمراء والأول الابتدائي (CB 1 R) تصور ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

ملء الخلية مصححة مع biocytin هي الخطوة الأكثر أهمية لضمان الشفاء التام من التشكل. لتحقيق الانتعاش الكامل للخلية، لا بد من تحديد اتجاه شريحة الأمثل للحد من فك عمليات تشريح خلال. هذا التوجه قد تختلف على أساس الدائرة وخلية نوع قيد البحث والدراسة. بعد ذلك، لا بد من إتاحة الوقت الكافي لbiocytin أن ينتشر إلى التشعبات والمحاور. بعض الأصباغ، مثل neurobiotin، ويمكن أيضا اختراق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS R01 NS069861 وNJCBIR CBIR14IRG024 لاحقا!

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومسيجماS7653Immunostaining
KClFluka60129Immunostaining
Na2HPO4 SigmaS7907Immunostaining
KH2PO4 سيجما229806Immunostaining
Triton X-100SigmaT8787Immunostaining
خنزير غينيا المضاد ل CB1 & nbsp ؛SigmaAf530-1Immunostaining
Mouse Anti CCKCure ، جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوسبإذن من G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin ، Alexa Fluor ConrupgateMolecular ProjectesS11227Immunostaining
Normal الماعز المصل (NGS)SigmaG9023Immunostaining
Vectashield Vector LabsH-1000
الأجسام المضادة الثانويةالمناعية المجسات الجزيئيةالفيتوجين Alexa Fluor المترافقةImmunostaining
Labnet مدار شاكر منخفض السرعةBioexpressS-2030-LSتلطيخ المناعة
دومون11231-30مجلدات شرائح التلوين
المناعيEMS71520Immunostaining
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066الفيزيولوجيا الكهربية
Multiclamp 700B مكبر للصوتالأجهزة الجزيئيةMulticlamp 700Bالفيزيولوجيا الكهربية
pCLAMP 10 برامجالأجهزة الجزيئيةpCLAMP 10 & nbsp ؛الفيزيولوجيا الكهربية
أجهزة التحويلالرقميDigidata 1440 محول الأرقامالفيزيولوجيا الكهربية
نصائح المرشحNalgene171-0020الفيزيولوجيا الكهربية
Sonicatorفيشر العلمي15-335-100الفيزيولوجيا الكهربية
اللوادرالدقيقة Eppendorf930001007الفيزيولوجيا الكهربية
BiocytinSigmaB4261الفيزيولوجيا الكهربية
ملقط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553(2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109(2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17(2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109(2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة