مقالة منهجية

المناعية الأقسام مملوءة Biocytin والمجهزة لالكيميائية العصبية علامات

DOI:

10.3791/54880

⸱

ديسمبر 31, 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لاسترداد المورفولوجية من الخلايا العصبية مصححة خلال التسجيلات الكهربية باستخدام ملء biocytin وتحليل نتائج المناعى لاحق. وتبين لنا أن أقسام مليئة biocytin السميكة التي كانت ملطخة وcoverslipped يمكن restained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية أو أشهر في وقت لاحق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمحت التسجيلات الكهربية للخلايا باستخدام تقنية المشبك التصحيح لتحديد أنواع الخلايا العصبية المختلفة استنادا إلى أنماط اطلاق النار. إدراج biocytin / neurobiotin في القطب تسجيل يسمح الانتعاش خاصة بعد من التفاصيل الشكلية، والتي هي ضرورية لتحديد تشجر شجيري والمناطق المستهدفة من قبل محاور الخلايا العصبية المسجلة. ومع ذلك، ونظرا لوجود الخلايا العصبية مشابهة شكليا مع الهويات وظائف الكيميائية العصبية واضحة، وتلطيخ المناعى للبروتينات الخلية من نوع معين ضروري لتحديد نهائيا الخلايا العصبية. للحفاظ على الاتصال بالشبكة، يتم إعداد أقسام الدماغ للتسجيلات فسيولوجية في سمك 300 ميكرون أو أكبر. ومع ذلك، هذا السمك غالبا ما يعوق تحليل نتائج immunohistological بسبب القضايا مع اختراق الأجسام المضادة، مما استلزم resectioning من الأنسجة. Resectioning من شرائح هي فن تحديا، وغالبا ما بالنتيجهتينغ في فقدان الأنسجة والتشكل من الخلايا التي تم الحصول على بيانات الكهربية، مما يجعل البيانات غير صالحة للاستعمال. منذ استعادة التشكل من شأنه أن يحد فقدان البيانات ودليل في اختيار من علامات العصبية، فقد اعتمدنا استراتيجية لاستعادة شكل الخلية الأولى، تليها المناعية الثانوية. ونحن نقدم نهج عملي لbiocytin ملء خلال التسجيلات الفسيولوجية والمناعية التسلسلي لاحق لاسترداد التشكل، تليها restaining الفروع لتحديد هوية الكيميائية العصبية. نفيدكم أن المقاطع التي كانت مليئة biocytin ثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA)، الملون، وcoverslipped يمكن إزالة وrestained مع الثانية أيام الأجسام المضادة الأولية في وقت لاحق. وتنطوي هذه restaining إزالة ساترة، وغسل المقاطع في حل العازلة، واحتضان الأجسام المضادة الأولية والثانوية للكشف عن هوية الكيميائية العصبية. هذه الطريقة مفيدة للقضاء على داتخسارة بسبب عدم القدرة على استعادة التشكل ولتضييق علامات الكيميائية العصبية التي سيتم اختبارها على أساس التشكل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المعروف أن الدماغ التنوع في الخصائص الهيكلية والوظيفية من عناصر الخلايا العصبية الفردية لها. فهم الأدوار من أنواع الخلايا العصبية واضحة في وظيفة الدماغ وعلم الأمراض يتطلب توصيف وتحديد واضح للالخلايا العصبية. هيكليا، وملامح شكلية محددة حسب الموقع somato-شجيري تحدد المدخلات المحتملة التي تتلقى الخلايا العصبية معينة، في حين أن نمط تشجر محور عصبي ويحدد الأهداف بعد المشبكي المحتملة. كما تم تقدير التنوع الهيكلي من الخلايا العصبية منذ أيام الدراسات النسيجية المنوية رامون كاجال ذ ل 1. وكشف ظهور تقنيات التسجيل وحيدة الخلية أن الخلايا العصبية متميزة هيكليا تظهر أيضا اختلافات في أنماط اطلاق النار وخصائص متشابك. التنوع في هي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biocytin الحشوة خلال الكهربية

ملاحظة: يمكن للقراء الرجوع إلى مصادر بديلة للتقنيات الأساسية التصحيح، المشبك تسجيل والأجهزة 19-22، والتي لا ترد تفاصيلها هنا. تفترض الخطوات المفصلة هنا أن المعدات والإجراءات للحصول على تسجيلات التصحيح المشبك تنشأ بالفعل، وسوف يقتصر على وصف لتفاصيل تتعلق biocytin، وملء المناعية بعد خاص. تم إجراء جميع التجارب المذكورة في هذه المخطوطة على الفئران.

  1. باستخدام vibratome، وإعداد أقسام الدماغ حية للمنطقة المطلوبة في سمك 300-350 ميكرون <....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند الانتهاء بنجاح، تحتفظ أقسام التعبئة biocytin وimmunolabeling أجريت في الخطوة 2 ويمكن تصوير باستخدام متحد البؤر أو المجهري epifluorescence. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أقسام معالجتها تظهر أيضا المناعية للمستضد المسمى أثناء معالجة لاحقة في الخطوة 3. في قسم موضح في الشكل رقم 2، تم الكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية مليئة biocytin في قسم سميكة (300 ميكرون) باستخدام streptavidin تصور في الحمراء والأول الابتدائي (CB 1 R) تصور .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

ملء الخلية مصححة مع biocytin هي الخطوة الأكثر أهمية لضمان الشفاء التام من التشكل. لتحقيق الانتعاش الكامل للخلية، لا بد من تحديد اتجاه شريحة الأمثل للحد من فك عمليات تشريح خلال. هذا التوجه قد تختلف على أساس الدائرة وخلية نوع قيد البحث والدراسة. بعد ذلك، لا بد من إتاحة الوقت الكافي لbiocytin أن ينتشر إلى التشعبات والمحاور. بعض الأصباغ، مثل neurobiotin، ويمكن أيضا اختراق.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS R01 NS069861 وNJCBIR CBIR14IRG024 لاحقا!

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومسيجماS7653Immunostaining
KClFluka60129Immunostaining
Na2HPO4 SigmaS7907Immunostaining
KH2PO4 سيجما229806Immunostaining
Triton X-100SigmaT8787Immunostaining
خنزير غينيا المضاد ل CB1 & nbsp ؛SigmaAf530-1Immunostaining
Mouse Anti CCKCure ، جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوسبإذن من G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin ، Alexa Fluor ConrupgateMolecular ProjectesS11227Immunostaining
Normal الماعز المصل (NGS)SigmaG9023Immunostaining
Vectashield Vector LabsH-1000
الأجسام المضادة الثانويةالمناعية المجسات الجزيئيةالفيتوجين Alexa Fluor المترافقةImmunostaining
Labnet مدار شاكر منخفض السرعةBioexpressS-2030-LSتلطيخ المناعة
دومون11231-30مجلدات شرائح التلوين
المناعيEMS71520Immunostaining
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066الفيزيولوجيا الكهربية
Multiclamp 700B مكبر للصوتالأجهزة الجزيئيةMulticlamp 700Bالفيزيولوجيا الكهربية
pCLAMP 10 برامجالأجهزة الجزيئيةpCLAMP 10 & nbsp ؛الفيزيولوجيا الكهربية
أجهزة التحويلالرقميDigidata 1440 محول الأرقامالفيزيولوجيا الكهربية
نصائح المرشحNalgene171-0020الفيزيولوجيا الكهربية
Sonicatorفيشر العلمي15-335-100الفيزيولوجيا الكهربية
اللوادرالدقيقة Eppendorf930001007الفيزيولوجيا الكهربية
BiocytinSigmaB4261الفيزيولوجيا الكهربية
ملقط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة