ويرد بروتوكول للقياس المباشر لتوزيع حجم الجسيمات في الحلول المركزة باستخدام ديناميكية المجهر تشتت الضوء.
مقالة منهجية
ويرد بروتوكول للقياس المباشر لتوزيع حجم الجسيمات في الحلول المركزة باستخدام ديناميكية المجهر تشتت الضوء.
حجم الجسيمات هو أحد أهم الخصائص الأساسية للمحاليل الغروية والبوليمر. يتم استخدام العديد من التقنيات لقياس حجم الجسيمات. يمكن قياس أحجام الجسيمات البالغة 1.0 ميكرومتر أو أكبر مباشرة باستخدام المجهر البصري. بالنسبة للجسيمات الأصغر ، يتم استخدام تقنيات بديلة ، مثل حيود الليزر أو المجهر الإلكتروني أو مجهر القوة الذرية2،3. تشتت الضوء الديناميكي هو تقنية شائعة الاستخدام لقياس توزيعات حجم الجسيمات في المحاليل4. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية ليست مشتقة من صور الجسيمات ولكن من الوقت المميز للتقلبات في شدة الضوء المتناثرة. تنشأ هذه التقلبات من الحركة البراونية التي تتميز بثابت الانتشار. يتم الحصول على توزيع الحجم من توزيع ثوابت الانتشار باستخدام معادلة أينشتاين ستوكس. نظرا لبساطته ، يستخدم تشتت الضوء الديناميكي على نطاق واسع للتقييم الروتيني للحلول ، مثل الدهانات وغرويات الطعام.
المعالجة المسبقة مطلوبة لمعظم التقنيات المستخدمة لقياس حجم الجسيمات لعينات المحلول. في حالة الفحص المجهري الإلكتروني والفحص المجهري للقوة الذرية ، يجب تحليل العينة في ظروف الفراغ. لذلك ، من الصعب ملاحظة العينات في أشكالها الأصلية. علاوة على ذلك ، بالنسبة للحيود بالليزر وتشتت الضوء الديناميكي ، يمكن قياس العينات المخففة فقط الخالية من التشتت المتعدد وامتصاص الضوء. للتغلب على هذه الصعوبة ، تم اقتراح العديد من التقنيات الجديدة لقياس تشتت الضوء الديناميكي من المحاليل المركزة غير المخففة ، مثل التحليل الطيفي للارتباط المتبادل5،6 ، تشتت الضوء الديناميكي منخفضالتماسك 7،8 ، التحليل الطيفي للموجات المنتشرة9،10 ، والفحص المجهري الديناميكي التفاضلي11،12.
لقد طورنا جهازا جديدا يسمى مجهر تشتت الضوءالديناميكي 1. يمكننا هذا الجهاز من قياس العينات العكرة دون تخفيف عن طريق نظام بصري متحد البؤر يتم فيه التخلص من التشتت المتعدد باستخدام ثقب. ومع ذلك، فإن إجراءات القياس وتحليل البيانات أكثر تعقيدا قليلا من إجراءات الأدوات المتاحة تجاريا. يشرح هذا الفيديو إجراء القياس وتحليل البيانات بالتفصيل باستخدام تحليل البوليمر المستجيب لدرجة الحرارة ، بولي (N-isopropylacrylamide) ، كمثال.
التحضير 1. عينة
2. حجم الجسيمات قياس مع الإنارة الديناميكي التشتت مجهر
. هنا، الأول (ر) هو شدة الضوء المتناثرة في الوقت t و (•••) T حان الوقت المتوسط. الوقت تسوس سيكون ما يقرب من 0.1 مللي ثانية. تم قياس في نقاط الاتصال المختلفة، كما هو مبين في الشكل 2 (أ): وظائف وقت الارتباط من شدة الضوء المتناثرة لتعليق البوليسترين اللاتكس (50 نانومتر الجسيمات دائرة نصف قطرها). تم تحويل هذه الوظائف ارتباط في وظائف توزيع نصف قطرها الهيدروديناميكية بواسطة معكوس تحويل لابلاس (انظر الشكل 2 (ب) و (ج)). باستخدام نفس الإجراء، تم الحصول على وظائف علاقة الوقت وظائف توزيع نصف قطرها الهيدروديناميكية من الحل PNIPA عند 25 درجة مئوية و 35 درجة مئوية، على التوالي. الأرقام 3 (أ) و (ب) تظهر وظائف الساعة ارتباط من شدة الضوء المتناثرة وظائف توزيع حجم المقابلة من الحل PNIPA أدناه (25 درجة مئوية) وفوق (35 درجة مئوية) وLCST. تم الحصول على وظائف توزيع حجم من قبل معكوس لابلاس تحول تليهاتصحيح مغايرة جزئي. متوسط نصف قطر الهيدروديناميكية تحت LCST هو عدة عشرات من نانومتر، وهو الأمر المعهود عن حلول البوليمر. في المقابل، فإن نصف قطر الهيدروديناميكية فوق LCST حوالي 1.0 ميكرون. هذه النتيجة تتفق مع حقيقة أن الحل هو عكر فوق LCST. الخطوط الحمراء والزرقاء في الشكل (3) تمثل توزيع حجم حلول PNIPA التي تم الحصول عليها مباشرة بعد و20 دقيقة بعد الحل أصبح العكرة، على التوالي. الشكل (3) (ب) يشير بوضوح الى نمو التجميع.

الشكل 1. مخططات من الحيوي المجهر تشتت الضوء. الثقب (PH)، شعاع الخائن (BS)، المستقطب (بولندا)، والثنائي الضوئي سيل (الهادئ). الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. ممثل النتائج لتعليق البوليسترين اللاتكس. (أ) وظائف ارتباط وقت شدة الضوء المتناثرة لتعليق البوليسترين اللاتكس. في دائرة نصف قطرها الاسمي هو 50 نانومتر، وتركيز 0.1٪ بالوزن. تم الحصول على مجموعتين من البيانات من نقاط نثر مختلفة. (ب) و (ج) المقابلة وظائف توزيع حجم لتعليق البوليسترين اللاتكس التي حصل عليها معكوس لابلاس تحول من (أ). الخط الأحمر يتوافق مع وظيفة الارتباط الوقت الذي ما يقرب من 1.0 السعة الأولي، والخط الأزرق يقابل ذلك مع اتساع الأولية أن ما يقرب من 0.2. تم حساب المحور الأفقي دون (ب) و مع (ج) النظر في تأثير heterodyning جزئية (PHD) عندما و<< . 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. ممثل النتائج عن حل PNIPA. (أ) وظائف ارتباط وقت شدة الضوء المتناثرة من أجل حل PNIPA. (ب) المقابلة وظائف توزيع حجم من أجل حل PNIPA التي حصل عليها معكوس لابلاس تحول من (أ). تم حساب المحور الأفقي النظر في تأثير heterodyning جزئية لكل مجموعة البيانات. يمثل خط أسود على البيانات التي تم الحصول عليها عند 25 درجة مئوية. يمثل خطا أحمر البيانات التي تم الحصول عليها بعد تحول حل عكر (35 درجة مئوية). يمثل الخط الأزرق البيانات التي تم الحصول عليها بعد قياس 20 دقيقة من الخط الأحمر./54885/54885fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
السعة الأولية للدالة الارتباط الوقت يعتمد بشكل كبير على نقطة محورية، كما هو مبين في الشكل 2 (أ). هذا على ما يبدو يتناقض مع حقيقة أن الحل هو متجانس (باستثناء طبقة رقيقة على واجهة) 8. ويعزى هذا الاختلاف في السعة الأولية إلى التباين في كمية الضوء المنعكسة. جزئية نظرية مغايرة 16 تتنبأ بأن السعة الأولية، A، شدة الضوء المتناثرة، والصورة، وشدة الضوء المنعكس، وص، تلبية المعادلة التالية 1

وتظهر هذه المعادلة أن أكبر I ص يصبح، يصبح أصغر حجما. لذلك، ويتم تقليل من خلال تحديد موقف البؤري على مقربة من واجهة. نشر الواضح D المستمر وكاليفورنيان الحصول عليها عن طريق تركيب دالة الارتباط الوقت في حالة حلول monodisperse:

أين
. هنا، n هو معامل الانكسار من المذيب (الماء، 1.33)، θ هي الزاوية متفرقة (180 درجة)، وλ هو الطول الموجي للضوء (514.5 نانومتر). منذ طبقنا الهندسة ارتداد مبعثر، ويحدد قيمة ف. ومع ذلك، يتم حل هذه النقطة باستخدام موجات مختلفة من الضوء. يرجى ملاحظة أن أي نوع من مصدر ليزر الموجة المستمرة متاح لبناء المجهر DLS. بفضل حجم المشع صغير، ويقدر عامل تماسك 17 أن يكون أكثر من 0.99 ولا يكاد يذكر. عن حلول polydisperse، يتم الحصول على وظيفة توزيع D A عن طريق معكوس تحويل لابلاس. عشر مغايرة جزئيةيتوقع eory أيضا أن D وليس هو نفسه كما نشر الفعلي D المستمر. هذه الثوابت نشر اثنين من تلبية المعادلة التالية:

يتم تحويل D ثابت نشر في الهيدروديناميكية دائرة نصف قطرها R ح باستخدام معادلة اينشتاين ستوكس 4. عندما أ = 1، تصبح هذه العلاقة D A = D. في هذه الحالة، فإن عملية تحويل البيانات هي نفسها التي لتشتت الضوء الديناميكي المشترك. الخط الأحمر هو مبين في الشكل 2 (ب) يتوافق مع هذه الحالة. في المقابل، تصبح هذه العلاقة D A = 0.5 D في الحد من A → 0. لذلك، ويقدر حجم ليكون ضعفي حجم الفعلي عندما وصغيرة (أي عمليا وأقل من 0.2)، كما هو موضح من قبل الخط الأزرق في الشكل 2 (ب) (أ) هو صغير إلى حد كبير، والمحور الأفقي يمكن تحويل، كما هو مبين في الشكل 2 (ج). من حيث المبدأ، يمكننا تحويل D وإلى D لأي قيمة A. في الممارسة العملية، ومع ذلك، فمن الأفضل لتعيين السعة الأولية أصغر من 0.2، منذ بسيط تقريب D A ~ 0.5 D يصدق.
وقد أظهرت السمات البارزة للتقنية نثر المجهر دينامية الخفيفة باستخدام محلول PNIPA. وقد تمت دراسة التشكل من PNIPA أسفل وأعلى LCST على نطاق واسع باستخدام النيوترونات زاوية صغيرة نثر 15،18. في المقابل، لم تستغل تشتت الضوء الحيوي لتحليل PNIPA فوق LCST بسبب تعكر 19 منه. يتم حل هذه المشكلة عن طريق الحيوي المجهر تشتت الضوء، كما هو مبين في الشكلين 3 (أ) و (ب). حجم هذه المجاميع هو عدة و# 181؛ م، والتي لا يمكن الحصول عليها إما صغيرة زاوية الأشعة السينية / تشتت النيوترونات أو تقنيات تشتت الضوء التقليدية. قياسات وقت حل باستخدام هذا النظام يعطي معلومات عن عملية التجميع خلال التغير في درجة الحرارة.
ويتضح العيب من الحيوي المجهر تشتت الضوء أيضا في الشكل (3). للنتيجة دون LCST، وظيفة ارتباط الوقت يتأثر بشدة كمية صغيرة جدا من الغبار الحاضر (الخطوط السوداء في الشكل 3). على سبيل المثال، فإن وظيفة ارتباط الوقت لا يتحلل تماما، حتى في زمن ارتباط في ترتيب 1.0 ثانية. وذلك لأن حجم المشع مع هذا الجهاز (ما يقرب من 1.0 ميكرون) هو أصغر بكثير من أن المشع مع جهاز تشتت الضوء الحيوي المعتاد (حوالي 100 ميكرون). في الحالات التي يكون فيها شدة الضوء المتناثرة ضعيفة، تحجب إشارة من الضوضاء، مثل تلك التي تسببها الصورةكميات مول الغبار في الحل. ولذلك، فإن القمم الثلاث هو مبين في الشكل (3) (ب) لا يجوز أن يكون الأهمية الكمية على الرغم من أن النظام العام للحجم هو مفيد. لاحظ أن هذا المشتت الضعيف يمكن أن يقاس جهاز تشتت الضوء الحيوي التقليدي.
لقد أثبتنا أن دينامية المجهر تشتت الضوء تمكننا من قياس العينات سواء شفافة وعكر مع نفس الإعداد. ومنذ مدة مسار بصري في العينات غير قصيرة، ويمكن تطبيق هذه التقنية لعينات امتصاص الضوء القوية، مثل تعليق أنابيب الكربون 20. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لدقة مكانية عالية، ويمكن تطبيق هذه التقنية على الخلايا البيولوجية. لتطبيقه على الأحياء، ويمكن أيضا هذه الطريقة تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الأخرى، مثل مضان والتصوير رامان. وبالتالي، فإننا نعتقد أن دينامية المجهر تشتت الضوء هو أداة قوية لمجموعة واسعة من المجالات البحثية.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل Grants-in-Aid for Research Research من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (رقم 25248027 إلى MS).
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| N< / em>-isopropylacrylamide ، 98٪ | طوكيو للصناعة الكيميائية المحدودة | I0401 | |
| تولوين ، 99٪ | واكو للصناعات الكيميائية النقية ، المحدودة. | 201-01876 | |
| الأثير البترولي ، درجة حرارة التقطير 30 ~ 60 درجة ؛ سي | واكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة | 169-22565 | |
| < م > ن ، ن ، ن ، ن < / م > رباعي ميثيل إيثيلين ديامين ، 99 ٪ | سيجما | T9281 | |
| بيرسلفات الأمونيوم ، 98 ٪ | سيجما | 248614 | |
| تعليق اللاتكس البوليسترين ، 1 بالوزن ، | ديوك ساينتيك كوربوريشن | 3500 أمبير | |
| أرجون | كويكي سانسو كوجيو المحدودة | نقاء > 99.999 vol.٪ | |
| تجويف الشريحة | ماتسونامي الزجاج المحدودة | 83-0336 | |
| المجهر المقلوب | نيكون Instech المحدودة | ECLIPSE Ti-U | |
| Thermo Plate | Tokai Hit CO.، Ltd | TP-108R-C | |
| ليزر الحالة الصلبة | متماسك | OBIS 488LX | |
| الثنائي الضوئي الانهيار | الجليدي ALV-GmbH ALV-GmbH | ALV-High Q.E. الانهيار | |
| الثنائي | المرتبط ALV-GmbH | ALV-5000 / EPP |
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن