مقالة منهجية

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

DOI:

10.3791/54902

⸱

أبريل 11, 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم مؤخرا تطوير عدد من أجهزة الاستشعار الحيوية للقوة القائمة على FRET ، مما يتيح الدقة الخاصة بالبروتين للقوة داخل الخلايا. في هذا البروتوكول ، نوضح كيف يمكن استخدام أحد هذه المستشعرات ، المصمم لرابط البروتين المركب Nesprin-2G للهيكل النووي والهيكل الخلوي (LINC) لقياس قوى actomyosin على مركب LINC النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم افتراض أن مركب LINC هو الهيكل الحرج الذي يتوسط في نقل القوى الميكانيكية من الهيكل الخلوي إلى النواة. Nesprin-2G هو مكون رئيسي لمركب LINC الذي يربط الهيكل الخلوي للأكتين ببروتينات الغشاء (بروتينات مجال SUN) في الفضاء المحيط بالنواة. تتصل بروتينات الغشاء هذه بالصفائح داخل النواة. في الآونة الأخيرة ، تم استنساخ مسبار قوة نقل طاقة الرنين Förster (FRET) في mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (مستشعر التوتر)) واستخدم لقياس التوتر عبر Nesprin-2G في الخلايا الليفية NIH3T3 الحية. تصف هذه الورقة عملية استخدام Nesprin-TS لقياس قوى LINC المعقدة في الخلايا الليفية NIH3T3. لاستخراج معلومات FRET من Nesprin-TS ، يتم أيضا تقديم مخطط تفصيلي لكيفية فك الصور الطيفية الأولية طيفيا في قنوات فلورية مستقبلة ومانحة. باستخدام برنامج مفتوح المصدر (ImageJ) ، تتم معالجة الصور مسبقا وتحويلها إلى صور نسبية. أخيرا ، يتم تقديم بيانات FRET الخاصة ب Nesprin-TS ، جنبا إلى جنب مع استراتيجيات كيفية مقارنة البيانات عبر مجموعات تجريبية مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قوة الحساسة، وقد ظهرت أجهزة الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا في الآونة الأخيرة بوصفها أداة هامة لقياس القوى القائم على الشد في الخلايا الحية، وتوفير نظرة ثاقبة كيف القوات الميكانيكية يتم تطبيقها عبر البروتينات 1، 2، 3، 4. مع هذه الأدوات، يمكن للباحثين صورة غير جراحية القوات داخل الخلايا في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية. تتكون هذه المجسات من الحنق الزوج (المانحة والفلورسنت متقبل البروتينات، في معظم الأحيان متبرع الأزرق والأصفر متقبل) مفصولة الببتيد مرنة 3. وعلى النقيض من C- أو علامات N-الطرفية، يتم إدخال هذا الاستشعار إلى موقع داخلي من البروتين لقياس قوة ميكانيكية تنتقل عبر البروتين، ويتصرف باعتباره قياس الضغط الجزيئي. زيادة التوتر الميكانيكية عبر نتائج الاستشعار عن زيادة المسافة بين الحنق فالهواء، مما أدى إلى انخفاض الحنق 3. ونتيجة لذلك، يرتبط الحنق عكسيا مع قوة الشد.

وقد وضعت هذه المجسات على أساس الفلورسنت للبروتينات التنسيق التصاق (فينكولين 3 و تالين 4)، والبروتينات هيكل الخلية (α-actinin 5)، والبروتينات خلية خلية تقاطع (E-كادهيرين 6 و 7 و VE كادهيرين 8، وPECAM 8). ومن المعروف رابط مرونة الأكثر استخداما وتتميز بشكل جيد في هذه المستشعرات الحيوية كما TSmod ويتكون من سلسلة متكررة من 40 الأحماض الأمينية، (GPGGA) 8، والتي كانت مستمدة من سوطي الشكل العنكبوت بروتين الحرير. وقد تبين TSmod أن يتصرف باعتباره الخطي مرنة نانو الربيع، مع الاستجابة الحنق إلى 1-5 السندات الإذنية من قوة الشد 3. أطوال مختلفة من سوطي الشكل يمكن استخدامها لتغيير دينامية صآنج من حساسية TSmod الحنق القوة 9. بالإضافة إلى سوطي الشكل، إسبكترن يكرر 5 و villin خوذة الببتيد (المعروف باسم HP35) 4 وقد استخدمت مثل الببتيدات مرنة بين الحنق أزواج في أجهزة الاستشعار قوة مماثلة 4. وأخيرا، أظهر تقرير صدر مؤخرا أن TSmod يمكن أيضا أن تستخدم لكشف قوات الضغط 10.

نحن وضعت مؤخرا جهاز استشعار القوة لرابط للنواة-الهيكل الخلوي (لينك) بروتين معقد Nesprin2G باستخدام TSmod إدراجها في بروتين Nesprin2G اقتطاع التي سبق وضعها المعروفة باسم مصغرة Nesprin2G (الشكل 2C)، الذي يتصرف على نحو مماثل لالذاتية Nesprin-2G 11. يحتوي المجمع ينك البروتينات المتعددة التي تؤدي من الخارج إلى داخل النواة، ربط الهيكل الخلوي حشوية إلى الصفيحة النووية. Nesprin-2G هو البروتين الهيكلي ملزمة لكل منالهيكل الخلوي الأكتين في السيتوبلازم والبروتينات SUN في الفضاء حول النواة. باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي لدينا، كنا قادرين على إظهار أن Nesprin-2G يخضع لتوتر تعتمد على أكتوميوزين في الخلايا الليفية NIH3T3 2. وكانت هذه هي المرة الأولى التي تقاس تلك القوة مباشرة عبر البروتين في مجمع ينك النووي، وأنه من المرجح أن تصبح أداة هامة لفهم دور القوة على نواة في ميكانيكا الأحياء.

وينص البروتوكول أدناه منهجية مفصلة لكيفية استخدام جهاز استشعار القوة Nesprin-2G، بما في ذلك تعبير عن التوتر استشعار Nesprin (Nesprin-TS) في خلايا الثدييات، فضلا عن اقتناء وتحليل الصور الحنق من الخلايا معربا عن Nesprin- TS. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة للكشف الطيفي، وصفا لكيفية قياس الانبعاثات توعية الحنق تستخدم unmixing الطيفي ويرد ratiometric التصوير الحنق. الصور ratiometric الانتاج يمكن ان تستخدم في صنع منه النسبيمقارنات القوة ntitative. في حين يركز هذا البروتوكول على التعبير عن Nesprin-TS في الخلايا الليفية، وقابل للتكيف بسهولة لخلايا الثدييات الأخرى، بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول من حيث صلته الحصول على الصور وتحليلها الحنق يمكن بسهولة أن تتكيف مع أجهزة الاستشعار القوة القائم على الحنق الأخرى التي تم وضعها للبروتينات أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحصول Nesprin-2G الاستشعار DNA وغيره من البلازميد DNA

  1. الحصول Nesprin-2G TS (جهاز استشعار التوتر) السيطرة، Nesprin-2G HL (بلا رأس)، mTFP1، فينوس، وTSmod من مصدر تجاري. نشر جميع البلازميدات DNA وتنقيتها باستخدام معيار E. سلالات القولونية، مثل DH5-α، كما هو موضح سابقا 12 و 13.

2. خلايا Transfect مع Nesprin-2G وغيره من البلازميد DNA

  1. تنمو NIH 3T3 الخلايا الليفية إلى خلايا 70-90٪ التقاء في 6 جيدا طبق زراعة الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية القياسية مع درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وتنظيم CO 2 (5٪). على المدى المتوسط ​​نمو الخلايا، استخدم Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
  2. في غطاء ثقافة الخلية، وإزالة المتوسطة وشطف كل جيدا مع ما يقرب من 1 مل من وسيلة خلية خفض المصل. إضافة 800 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل إلى كل بئرووضع غرفة 6 جيدا في الحاضنة.
  3. ماصة 700 ميكرولتر من خلية متوسطة خفض المصل في أنبوب 1.5 مل مع 35 ميكرولتر من محلول الدهون الناقل لتشكيل "lipomix". مزيج من قبل pipetting. تسمية الأنبوب مع "L."
  4. جمع ست أنابيب 1.5 مل وتسمية لهم من 1 إلى 6. ماصة 100 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل في كل أنبوب.
    1. عن طريق تركيز الحمض النووي البلازميد من الخطوة 1، ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin 2G-TS في أنابيب 1 و 2. ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin-HL في أنابيب 3 و 4. ماصة 1 ميكروغرام من mTFP في أنبوب 5. ماصة 1 ميكروغرام من mVenus في أنبوب 6. لا إعادة استخدام نصائح ماصة عندما pipetting لأنواع مختلفة من الحمض النووي.
  5. ماصة 100 ميكرولتر من lipomix من أنبوب "L" في كل أنبوب المسمى (1-6)، ومزيج من قبل pipetting المتكررة. استخدام ماصة نظيفة لكل أنبوب. احتضان لمدة 10-20 دقيقة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من كل أنبوب المسمى لبئر في غرفة 6 جيدا مع متموجة 70-90٪الخلايا. تسمية الجزء العلوي من كل بئر مع DNA المقابل المضافة. مكان الغرفة 6 جيدا في حاضنة لمدة 4-6 ساعة.
  7. نضح المتوسطة وإضافة 1-2 مل من المتوسط ​​خلية خفض المصل لشطف. نضح المتوسطة خلية انخفاض مصل، إضافة 2 مل من التربسين إلى كل بئر، ووضع صحن 6 جيدا في الحاضنة (5-15 دقيقة).
  8. في حين فصل الخلايا في الحاضنة، ومعطف 6 الزجاج أسفل يشاهدون أطباق بطبقة من فبرونيكتين في تركيز 20 ميكروغرام / مل حل في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS). السماح للأطباق لطلاء السطح في الخلية هود الثقافة (حوالي 20 دقيقة).
  9. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM مرة يتم فصل الخلايا.
  10. نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وصفت وتدور باستمرار في 90 x ج لمدة 5 دقائق في يتأرجح الطرد المركزي الدوار. نضح طاف وإعادة تعليق كل بيليه خلية في 1000 ميكرولتر من DMEM بواسطة ماصة الاختلاط.
  11. نضح الخليط فبرونيكتين منأطباق الزجاج وماصة 1000 ميكرولتر من كل تعليق الخلية على أطباق الزجاج.
  12. بعد تسوية الخلايا في الجزء السفلي من الأطباق الزجاجية (~ 15 دقيقة)، إضافة 1 مل أخرى من DMEM + 10٪ FBS + 1٪ القلم بكتيريا على كل جانب ومكان في حاضنة الخلية. السماح للخلايا لنعلق والتعبير عن الاستشعار عن 18-24 ساعة على الأقل.
    و transfected الخلايا باستخدام الموجبة الكواشف ترنسفكأيشن الدهون التجارية (انظر جدول المواد): ملاحظة. بدلا من ذلك، خطوط الخلايا مستقرة يمكن اختيار باستخدام البلازميد مع الجينات التي تمنح مقاومة السم (متوفرة على موقع على شبكة الانترنت DNA مستودع البلازميدات pcDNA لNesprin-TS و-HL (انظر جدول المواد) توفير الخلايا معربا عن المقاومة geneticin ). بالإضافة إلى ذلك، طرق العدوى الفيروسية (الفيروسة البطيئة، الارتجاعي، أو اتش) يمكن استخدامها للتعبير عن جهاز استشعار في الخلايا التي يصعب ل transfect.
  13. بالإضافة إلى Nesprin-TS، transfect خلايا إضافية مع HL Nesprin صفر لالسيطرة م، كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،12. ويمكن أيضا أن تستخدم TSmod كعنصر تحكم صفر القوة وينبغي أن يحمل الحنق على غرار Nesprin-HL.
  14. خلايا Transfect مع mTFP1 وفينوس لتوليد البصمات الطيفية (راجع الخطوة 4).
    ملاحظة: mTFP1 وفينوس تعبير عن عادة عند مستويات أعلى من Nesprin-TS، وعلى هذا النحو، قد تحتاج إلى transfected لتحقيق مستويات التعبير مماثلة كميات أقل من الحمض النووي.

3. التحقق من ترنسفكأيشن الكفاءة

  1. ما يقرب من 18-24 ساعة بعد الانتهاء من ترنسفكأيشن، استخدام المجهر الفلورسنت المقلوب لفحص كفاءة ترنسفكأيشن بمقارنة عدد الخلايا الفلورسنت إلى العدد الكلي للخلايا في عرض (عادة 5-30٪).
    1. استخدام المجهر الفلورسنت مجهزة تردد الإثارة قرب 462 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس) وتصفية الانبعاثات تركزت قرب 492 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، سوف GFP تصفية مجموعات التقاط مجموعة من mTFP1 وهاءانبعاثات جامعة سنغافورة الوطنية، وسيسمح للتأكيد على كفاءة ترنسفكأيشن.
  2. صورة الخلايا الحية خلال 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
    1. بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق (في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لمدة 5 دقائق، ومتجر في برنامج تلفزيوني، وعرض بعد 48 ساعة 8.
      ملاحظة: ما وراء 48 ساعة، وجودة الإشارة والقوة يضمحل. تحديد الخلايا يحافظ على دولتهم، بما في ذلك الحنق الذي أعرب 8؛ ومع ذلك، ينبغي تصوير الخلايا فقط في برنامج تلفزيوني، وتصاعد المتوسطة قد تؤثر الحنق 14. لا يمكن إلا أن خلايا ثابتة يمكن مقارنة الخلايا الثابتة الأخرى، كما قد يكون هناك تغيير في التعبير.
      تحذير: امتصاص العرق هي سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

4. التقاط الطيفي بصمات mTFP1 والزهرة Fluorophores للالطيفي Unmixing

  1. في غطاء ثقافة الخلية، استبدل المتوسطة الخلية مع جامعة المدينة العالمية التصويرم (HEPES مخزنة) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني.
  2. ضع الأطباق عرض في (37 ° C) المرحلة المجهر مبائر التحكم في درجة حرارته.
  3. وضع صحن زجاج العرض مع خلايا transfected mTFP1 على مدى الهدف النفط في 60X التكبير مع الفتحة العددية 1.4.
    ملاحظة: يستخدم زيت على المجهر الليزر على الهدف 60X تشبه عن كثب معامل الانكسار الركيزة الزجاج. يوضع الزيت على أعلى عدسة الهدف، ويأتي في اتصال مباشر مع ساترة الزجاج.
  4. حدد موقع mTFP1 معربا عن الخلايا مع مصدر الإثارة 458 نانومتر وعامل تصفية ممر الموجة الانبعاثات تركزت في 500 نانومتر.
  5. مع خلية الفلورسنت في مجال الرؤية، تحديد وضع الكشف الطيفي ( "لامبدا الوضع" في البرمجيات المستخدمة هنا) والتقاط الصورة الطيفية (الشكل 3-1). يشمل جميع الترددات وراء 458 نانومتر باستخدام 10 بزيادات نانومتر (الشكل 3-3). حدد fluoresc مشرقمنطقة الأنف والحنجرة (ROI) على الخلية (20 بكسل نصف القطر).
    ملاحظة: الشكل الطيفي للmTFP1، معربا عن ROI يجب أن تبقى ثابتة نسبيا عبر الخلية. إذا كان شكل اختلافا كبيرا، وإعادة ضبط الليزر والحصول على إعدادات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  6. إضافة ROI الفلورسنت يعني، وكثافة طبيعية لقاعدة البيانات الطيفية بالنقر على "حفظ الأطياف إلى قاعدة البيانات."
  7. تحسين قوة الليزر واكتساب بحيث يتم التوصل إلى جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سوف تختلف إعدادات لمعدات مختلفة. استخدام غير الفلورسنت، وخلايا untransfected كمرجع الخلفية، وزيادة الربح والسلطة حتى الخلايا مشرقة، ولكن ليس خارج النطاق الديناميكي للكشف (نقطة التشبع). لا ينبغي أن يكون خلايا خلفية مضان كشفها بعد المتوسط.
  8. كرر العملية للخلايا transfected فينوس مع الاستثناءات التالية:
    1. تأكد من أن وتيرة الإثارة هو في 515 نانومتر، وأن ممر الموجة مرشح هو مntered قرب 530 نانومتر عند تحديد خلايا فينوس، معربا عن.
    2. في "وضع الطيفي"، استخدم تردد الإثارة من 515 نانومتر بدلا من 458 نانومتر.

5. التقاط صور غير المخلوطة

  1. تبديل وضع الالتقاط إلى "الطيفي Unmixing".
  2. إضافة بصمات طيفية من فينوس وmTFP1 في القنوات unmixing (الشكل 3، ارو 2).
  3. تعيين الليزر الإثارة مرة أخرى إلى مصدر الأرجون 458 نانومتر.
  4. ضع صحن عرض Nesprin-TS فوق الهدف النفط 60X.
  5. بعد التركيز على خلية الفلورسنت مع التعبير مشرق بما فيه الكفاية، وضبط الكسب وقوة الليزر لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    ملاحظة: منذ كفاءة الحنق من Nesprin-TS بالقرب من 20٪، ويجب أن تكون الصورة فينوس غير مخلوطة باهتة إلى حد كبير من الصورة mTFP1 غير مخلوطة. مرة واحدة وقد تم تحديد ووضع السلطة والمكاسب مقبول تكرارا، يجب أن تظل هذه المعايير المستمر لجميع صور الكابتنمحكم.
  6. القبض على ما لا يقل عن 15-20 الصور خلايا Nesprin-TS مع سطوع مماثل نسبيا، وتجنب الإفراط في التشبع بكسل (تتم إزالة كافة بكسل المشبعة خلال معالجة الصور).
  7. تكرار عملية التقاط صورة مع خلايا Nesprin-HL باستخدام معلمات التصوير متطابقة.

تجهيز 6. صورة ونسبة تحليل الصور

  1. استخدام المصدر المفتوح يماغيج (فيجي) والبرمجيات (http://fiji.sc/)، وفتح شكل صور أصلية باستخدام BioFormats القارئ.
  2. قبل عملية الصور وحساب نسبة الصور باستخدام البروتوكولات المعمول بها سابقا 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد بروتوكول أعلاه، تم الحصول عليها DNA البلازميد من مستودع DNA وتحويلها إلى خلايا E. القولونية. وقد تم اختيار E. القولونية التعبير عن DNA استشعار من LB / لوحات الأمبيسلين وتضخيمها في مرق LB السائل. بعد التضخيم من ناقلات، وتنقية البلازميدات DNA إلى عازلة تريس، EDTA باستخدام معيار، وهي متاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وكميا DNA تنقيته الى تركيز القياسية من ميكروغرام / مل (الشكل 1A، أي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طريقة ومظاهرة من تصوير الخلايا الحية من التوتر الميكانيكية عبر Nesprin-2G، وهو بروتين في مجمع ينك النووي، وقد ورد أعلاه. قبل هذا العمل، تقنيات مختلفة، مثل الطموح micropipette، المغناطيسي حبة الخلوي، والمجهري ليزر الاجتثاث، وقد استخدمت لتطبيق الضغط على نواة الخلية وقياس خصائص المواد حجمها 16 و 17 و 18. ومع ذلك، حتى عملنا مؤخرا، قد تظهر عدم وجود دراسات مباشرة أن القوات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل توماس F. وكيت ميلر جيفريس ميموريال ترست (لDEC) وNIH منح R35GM119617 (لDEC). تم إجراء التصوير المجهر متحد البؤر في مرفق جامعة فرجينيا كومنولث المواد النانوية توصيف الأساسية (NCC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Nesprin-TS DNAAddgene68127استرجاع من https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128استرجاع من https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNAAddgene54613استرجاع من https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNAAddgene27793استرجع من https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNAAddgene26021استرجاع من https://www.addgene.org/26021/
الخلايا المختصةBiolineBIO-85026
السائل LB MediaThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
ألواح الثقافة البكتيرية LB الصلبةSigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
AmpicillinSigmaA9518
مقياس الطيف الضوئيBiorad273 BR 07335SmartSpec Plus
كوفيت كوفيتبيوراد1702504
لمجموعة عزل الحمض النوويMacherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
طبق ثقافة الخلايا ذو 6 آبارFalcon-Corning353046طبق ثقافة البوليسترين متعدد الآبار 6 آبار
Dulbecco's Modified Eagle Medium ، (DMEM) وسائط الخليةGibco11995-065DMEM (1x) Bovine
Serum LifeTechnologies 16170-078
وسائط خلايا المصل المخفضةGibco31985-070متوسط المصل المخفض ، "optimem"
الدهون كاشف الدهون من Carrier Solutioninvitrogen11668-019، "Lipofectamine 2000"
1.5 مل أنبوب بلاستيكي معقمDenvillec2170
TrypsinGibco25200-0560.25٪ Trypsin-EDTA (1x)
عرض المجهر ذو القاع الزجاجيفي المختبر ScientificD35-20-1.5-N35 مم مع 20 مم بئر سفلي # 1.5 زجاج
فيبرونكتينThermoFisher33016015بروتين فيبرونيكتين البشري ، البلازما
فوسفات المحلول الملحي المخزن (PBS)Gibco14190-144Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 مل أنبوب الطرد المركزي المعقمGreiner bio-one188261
طرد مركزي دوار متأرجح   ؛الإلكترون الحراريCentra CL2المتأرجح الدوار الحراري الإلكترون 236
غطاء السلامة الحيوية لثقافة الخليةForma Scientific1284
حاضنة ثقافة الخلايا التي يتم التحكم فيها بالمناخThermoFisher3596
مجهر الفلورسنت LED المقلوب تقنياتالحياةEVOS FL
Clear HEPES وسائط التصوير المخزنةالمجسات الجزيئيةA14291DJ
مصل الجنين10437-028
التحكم في درجة الحرارة مقلوبة متحدة البؤر مع مصادر ليزر 458 و 515 نانومتر   ؛Zeiss  LSM 710-w / كاشف
Outgrowth MediaNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 FibroblastsATCCCRL-1658
SmartSpec Plus طبق جهاز تقنيات البقري META الطيفي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247(2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET 2 Nesprin 2G ImageJ NIH 3T3

مقالات ذات صلة