الكمي النسيجي المزمن عضلة القلب عائق في الجرذان

ملخص

يعتمد تقييم ما بعد الوفاة لاحتشاء عضلة القلب (MI) في القوارض على القياس الكمي للاحتشاء على أقسام القلب الملطخة. نصف طريقة دقيقة لتحديد حجم الاحتشاء باستخدام أخذ عينات منهجية من قلوب الفئران المحصودة من القاعدة إلى القمة وتحليلات الصور للأقسام النسيجية الملطخة بالألوان ثلاثية الألوان.

الملخص

يعرف احتشاء عضلة القلب بأنه موت عضلة القلب بسبب نقص التروية لفترات طويلة ؛ استجابة التهابية وتكوين ندبة (تليف) تتبع الإصابة الإقفارية. بعد المرحلة الحادة الأولية ، تؤدي إعادة التشكيل المزمنة للبطين الأيسر (LV) إلى تعديل بنية القلب ووظيفته. تم استخدام ربط الشريان التاجي الدائم في الصغيرة على نطاق واسع كنموذج مرجعي لنموذج مزمن من MI. يتطور ترقق الجدار المحمي تدريجيا إلى التليف العابر. يتم إجراء التقييم النسيجي لحجم الاحتشاء بشكل شائع. ومع ذلك ، فإن توحيد طرق القياس الكمي مفقود. في الواقع ، عادة ما لا يتم وصف الجوانب المنهجية المهمة ، مثل عدد الأقسام التي تم تحليلها وطرق أخذ العينات والقياس الكمي ، وبالتالي تمنع المقارنة عبر التحقيقات. في كثير من الأحيان ، يتم إجراء القياس الكمي على قسم واحد تم الحصول عليه على مستوى العضلات الحليمي. نظرا لأن الاستراتيجيات الجديدة التي تهدف إلى الحد من توسع الاحتشاء وإعادة تشكيله قيد التحقيق ، فهناك حاجة مهمة لتوحيد بروتوكولات أخذ عينات القلب الدقيقة. نصف طريقة دقيقة لتحديد حجم الاحتشاء باستخدام أخذ عينات منهجية من قلب الفئران المحصودة وتحليلات الصور للأقسام النسيجية الملطخة ثلاثية الألوان التي تم الحصول عليها من القاعدة إلى القمة. نقدم أيضا دليلا على أن حساب مؤشر التمدد (EI) سمح بتقييم حجم الاحتشاء ، مع مراعاة التغيرات في البطين الأيسر طوال عملية إعادة التشكيل.

المقدمة

احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب التاجية هي السبب الرئيسي. MI ينتج عن نقص التروية التوالي للأحداث التاجية مثل انسداد. عندما لا يتم تنفيذ ضخه داخل ساعة 6 الأولى، نقص تروية عضلة القلب يدفع نخر لا رجعة فيه. في المرضى، وتوصيف MI يعتمد على أدوات التشخيص المختلفة، بما في ذلك العلامات السريرية، تخطيط القلب الكهربائي، وتقييم مستويات البلازما من المؤشرات الحيوية، وضربات القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي، والنسيجية ويحلل ^1. تصنف MI الحادة والمزمنة كما مرحلتين المختلفة للإصابات وفقا لتوقيت نخر عضلة القلب بالنسبة للوقت انسداد الشريان التاجي. المرحلة الحادة، والتي تحدث خلال 7 أيام الأولى، ويرتبط مع فقدان الخلايا العضلية، والتهاب واسعة النطاق، وتجنيد الخلايا الليفية. المرحلة شبه الحادة، التي تتميز شفاء الأنسجة القلبية وتشكيل ندبة، يحدثبين 1 و 4-6 أسابيع. توسيع احتشاء، رقيق البطين الجدار، وتوسع البطين تميز المرحلة المزمنة. إعادة عرض واسعة من البطين الأيسر النتائج تدريجيا في فشل القلب الحاد ^2.

MI الناجمة عن الدائمين الأمامي الأيسر النازل الشريان (LAD) ربط يمثل نموذج القوارض القياسية من احتشاء عضلة القلب المزمن. يقلد الربطة التاجية وانسداد الشريان التاجي. حجم احتشاء يعتمد على موقع ضمد. يتم إجراء توصيف الإصابة الدماغية عضلة القلب في نموذج القوارض كلاسيكي باستخدام مستويات البلازما العلامات البيولوجية، مثل تروبونين الأول وT ^3، تخطيط صدى القلب، التصوير بالرنين المغناطيسي، والأنسجة ^4،5. وترتبط مستويات المؤشرات الحيوية مع حد الموت cardiomyocyte. تخطيط صدى القلب يقيم الأيسر ضعف وظيفة البطين الناتجة عن تشوهات جدار الحركة الإقليمية. وبالإضافة إلى ذلك، وتقنيات التصوير غير الغازية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو عالية الدقةتخطيط صدى القلب، والسماح للتقييم الانخفاض في حركة الجدار، وحجم منطقة الندبة مع انخفاض التروية وعضلة القلب قابلة للحياة، وترقق الجدار. تسمح أبعاد LV تقييم دقيق لحجم احتشاء. وأخيرا، فإن تقدير حجم عضلة القلب قابلة للحياة ومات لا يمكن أن يؤديها بعد الوفاة باستخدام بقع محددة من المقاطع النسيجية من قلوب حصادها ويسمح التحقق من حجم احتشاء (IS). ميزة أخرى مهمة هي تقييم مؤشر التوسع احتشاء (EI) ^6. ويرتبط EI مع احتشاء ويبدأ بطريق ضمن أول 3 أيام. يتميز EI من قبل التخفيض التدريجي في سمك الجدار، وزيادة في حجم تجويف LV، والتغيرات اللاحقة في شكل LV.

من أجل تقييم فعالية العلاج من العلاجات الجديدة - على وجه الخصوص، استراتيجيات التجدد على أساس الخلايا، المصفوفات، والجينات التسليم دقيقة تقييم MI في القوارض هو أمر بالغ الأهمية.عندما يقاس على شريحة واحدة حصلت على مستوى العضلات الحليمية، قد يكون متحيزا حجم ويرجع ذلك إلى التنوع الكبير الموجود في تطوير احتشاء التالية ربط الغلام، واحتشاء مهيمنة يمكن بعد ذلك تحجبها. الأهم من ذلك، وقد وصفت منهجيات أكثر دقة لتحديد حجم MI للفئران ^7-9 أو الفئران ^10. على الرغم من ذلك، هو غير كافية لتحديد بدقة LV إعادة عرض أو أدى إلى انخفاض علاجيا (أو المنع) من التجديد. في الواقع، هو ما يعبر عنه عادة كنسبة مئوية من إجمالي حجم LV المقررة على المقاطع العرضية للقلب. على الرغم من أن هذه الطريقة صالحة لMI الحاد، وترقق الجدار LV التي تحدث خلال إعادة عرض ما زال تحت تقييمها ^11،12. تقدير كمي المورفولوجية كاملة من حجم احتشاء والتغيرات الهيكلية يجب تحديد حجم العديد من المعلمات، مثل أطوال شغافية والنخابية وبأقطار، فضلا عن احتشاء والمناطق الصحية. نحن تصف appr المنهجيoach إلى تقييم دقيق MI وإعادة عرض في نموذج الفئران المزمن.

البروتوكول

وتلقى جميع الحيوانات الرعاية الإنسانية في الامتثال للاتفاقية الأوروبية لرعاية الحيوان. تم إجراء العمليات الجراحية وفقا لقانون حماية الحيوان السويسري بعد الحصول على إذن من مكتب الدولة للطب البيطري، فريبورغ، التي وافق عليها المكتب الاتحادي السويسري البيطري، سويسرا.

حصاد 1. القلب

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التدخلات الجراحية تحت التخدير الأيزوفلورين. وقد بذلت جهود لتقليل معاناة الحيوانات. على وجه الخصوص، تلقى جميع الحيوانات الحقن تحت الجلد من 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين قبل التخدير. بروتوكول الجراحية لضمهم احتشاء عضلة القلب وقد وصفت سابقا في أماكن أخرى ^(13).

1. إجراء القص على حيوان محتشية myocardially تحت التخدير (حيوان تنبيب، 2.5٪ الأيزوفلورين والتخدير المناسبة أكد مخلب قرصة لا ارادي).
   1. فتح الحيوان عن طريق قطع الجلد ثم العضلاتمع مقص جراحي. قطع الأضلاع على اليسار واليمين، ثم قم بإزالة الصدر.
   2. إزالة التصاقات المتبقية بعد الجراحة السابقة (LAD ربط). قطع الشريان الأورطي وإزالة القلب. وضع الأنسجة في 1 م بوكل (في برنامج تلفزيوني)، ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني.

2. الأنسجة التحضير

1. وضع القلب محتشية طوليا في الاكريليك مصفوفة قلب فأر. يبقيه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. قطع القلب مباشرة في المصفوفة باستخدام شفرة حلاقة مع مستعرضة. ضمان كل شريحة هو 2 مم. قطع ما يقرب من 5-7 شرائح لكل قلب (استنادا إلى مستوى إعادة)؛ وهذا ما يسمى أخذ العينات بطريقة منهجية.
3. في هذه الخطوة، وأداء تلطيخ 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) هو اختياري (الحفاظ على التوجه للشرائح القلب قاعدة للقمة).
   1. احتضان في 1٪ عقاري في برنامج تلفزيوني لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية. احتضان في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة إلى 1 ساعة. وضع المقاطع بين هذا وذاكن لوحين من الزجاج مع الفواصل 2 ملم والتقاط الصور مع المجهر stereological إلى جانب وجود كاميرا في 15X التكبير.
      الحذر! امتصاص العرق هي سامة.
4. تجميد الشريحة (1 الخيار ^{الواحد)}
   1. وضع كل شريحة في قالب من البلاستيك (10 × 10 × 5 مم) مع تصاعد المتوسطة لcryotomy (أفضل درجة حرارة القطع، أكتوبر)، والحفاظ على التوجه (وضع الجانب الموجهة APEX-القسم أسفل على الجزء السفلي من القالب). تجميد الكتل مع الأبخرة 2-methylbutane تحت النيتروجين السائل لتبريد 10-15 دقيقة. وأخيرا، وتخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية.
5. Paraffinization (2 الخيار ^{الثاني)}
   1. وضع كل شريحة في تضمين أشرطة (الحفاظ على التوجه عن طريق وضع الجانب الموجهة للقمة للقسم الأسفل على الجزء السفلي من الكاسيت) ثم في 4٪ PFA لمدة 24 ساعة. وضعها في جهاز معالج الأنسجة بين عشية وضحاها.
      1. احتضان في الايثانول 70٪ لمدة 2 ساعة. احتضان في إيثانرأ 95٪ لمدة 2 ساعة. احتضان في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 ساعة. احتضان في زايلول لمدة 4 ساعة. احتضان في البارافين (المنصهر في 60 درجة مئوية في الفرن) لمدة 5 ساعة. وأخيرا، وجعل الكتل عن طريق دمج كل شريحة القلب في البارافين.

3. ماسون-Goldner ثلاثي الألوان تلطيخ

1. جعل أقسام الأنسجة من كتل البارافين مع مشراح اليدوي (سمك: 5 ميكرون) أو من كتل أكتوبر مع ناظم البرد المقرر أن -18 درجة مئوية (سمك: 7 ميكرون).
2. وصمة عار شريحة واحدة من كل جزء القلب لكل الفئران (3-4 أقسام مستعرضة لكل شريحة) مع ماسون-Goldner ثلاثي الألوان تلطيخ (انظر المرفق).
   ملاحظة: بدء من هذه الخطوة للأقسام البارافين.
   1. تذوب الشرائح عند 60 درجة مئوية في الفرن. تحت غطاء الدخان، deparaffinize لهم في زايلول مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما. ترطيب لهم في الإيثانول بنسبة 100٪، و 95٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول، والماء المقطر لمدة 3 دقائق لكل منهما.
      ملاحظة: بدء من هذه الخطوة لcryosectionالصورة.
   2. اصلاحها في بوين الحل بين عشية وضحاها. ثم، شطف لهم في ادارة مياه الصنبور ل10-15 دقيقة. شطف في الماء المقطر. احتضان لهم في الهيماتوكسيلين ماير لمدة 3 دقائق.
   3. إزالة الشرائح وتركهم في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. ثم، احتضان لهم في الحامض بالفوكسين-الشقائقية لمدة 5 دقائق. شطف لهم في حامض الخليك 1٪ لمدة 1 دقيقة.
   4. بعد ذلك، احتضان لهم في حمض الفسفومولبديك أورانج G لمدة 1 دقيقة. شطف لهم في حامض الخليك 1٪ لمدة 1 دقيقة، احتضان لهم في صبغ الضوء الأخضر لمدة 10 دقيقة، وشطف لهم في حامض الخليك 1٪ لمدة 1 دقيقة.
   5. يذوى منهم في 70٪ من الإيثانول (30 ثانية)، و 95٪ من الإيثانول (30 ثانية)، والإيثانول٪ 100 (5 دقائق). وضع قطرة واحدة من وسط تصاعد راتنجية على أقسام الأنسجة، وغطاء لهم coverslips، والسماح لهم الجافة.

4. عائق تحليل الحجم

1. الحصول على صورة واحدة من كل شريحة على مجهر تشريحي (15X التكبير) إلى جانب وجود الكاميرا. تصوير الحاكم مع نفس الإعدادالصورة.
2. استخدام صورة برامج التحليل لقياس سمك ندبة في منتصف احتشاء، وسماكة الحاجز، منطقة تجويف البطين الأيسر (LV)، ومنطقة احتشاء، ومنطقة الأنسجة LV استخدام.
   1. تعيين المقياس مع الصورة الحاكم (الشكل 1A).
      1. انقر على القياسات ثم حدد مجموعة معامل التحويل. رسم خط على شريط المعايرة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وانقر على معايرة النهاية. لاحظ القيمة شريط، ومن ثم انقر فوق موافق.
   2. حدد LV من الصورة القلب الملون (الشكل 1B). استخدام أداة شريحة متعددة. حدد LV نقطة بنقطة، وانقر ثم انقر بزر الماوس نسخ / لصق في أي مكان.
   3. قياس ندبة والحاجز سمك باستخدام أداة قياس قطعة واحدة (الشكل 1C ).
   4. كشف تلقائيا LV تجويف، احتشاء، والمناطق LV باستخدام أداة قياس مساحة التلقائي في وضع RGB (1D الشكل).
      1. انقر على الأداة. تفعيل فقط حدود و متجاورة في وضع RGB. وأخيرا، انقر داخل المنطقة من الفائدة لكشفها. إذا لزم الأمر، واستخدام الأدوات الدقيقة.
3. حساب حجم احتشاء كنسبة من منطقة احتشاء إلى منطقة LV.
4. حساب مؤشر التوسع على النحو التالي: [LV منطقة تجويف / كامل منطقة LV] / [سمك احتشاء / سماكة الحاجز]، مع منطقة LV بأكملها بما في ذلك كل من تجويف LV ومناطق الأنسجة LV.
5. وأخيرا، وحساب "متوسط" لكل قلب على النحو التالي: [لمتوسط ​​مؤشر توسع من الشرائح محتشية] * [عدد الشرائح محتشية / مجموع عدد من الشرائح].

النتائج

ستة أسابيع بعد LAD ربط، تم حصاد قلوب من الفئران لويس. وقد تم الحصول على أقسام الأنسجة 2 ملم من قمة إلى القاعدة. تم تنفيذ إجراء تلطيخ TTC لتصور منطقة احتشاء، والذي يظهر باللون الأبيض، وعضلة القلب السليم، والذي يظهر باللون الأحمر (الشكل 2). اعتمادا على موقع الربط من الفتى، وحجم احتشاء يختلف. لMI كبير، لوحظت عوائق بطريق من قمة إلى قاعدة (الشكل 2A). قدمت عوائق أصغر الأنسجة محتشية البيضاء مرئية من قمة إلى منتصف القسم من...

المناقشة

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

الأنسجة التليفية يمكن تقييمها بدقة في نموذج الفئران MI المزمن باستخدام أخذ العينات المنتظمة للقلب حصاد وصورة تحليلات أقسام النسيجية ثلاثي الألوان الملطخة تم الحصول عليها من قاعدة للقمة. خطوتين أهمية خاصة لتنفيذ بروتوكول ناجحة. أولا، استخدام بوكل لحصاد القلب يسمح للعضلة القلب ليتم الاحتفاظ في حالة استرخاء. هذه الخطوة مهمة لإجراء مقارنات ذات أبعاد احتشاء من قلوب مختلفة....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصفوفة قلب الفئران الاكريليك 2 مم	72-5015	هارفارد أبارتوس
انسبيرا جهاز التنفس الصناعي المتقدم الذي يتم التحكم فيه بالحجم	هارفارد	557058
قسطرة إنسيت 14 جم	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	سيجما ألدريتش
ماير هيماتوكسيلين	MHS32-1L	سيجما ألدريتش
حمض فوشين CI 42685	F8129-50G	سيجما ألدريتش
بونسو زيليدين CI 16150	P2395-25G	سيجما ألدريتش
أورانج G CI 16230	O3756-100G	سيجما ألدريتش
أخضر فاتح CI 42095	L5382-25G	سيجما ألدريتش
KCl	P9333-500G	سيجما ألدريتش
زيلول	10315083	هاني ويل
إيثانول 10303990 المطلق		هاني ويل
2-ميثيل بوتان	M32631-1L	سيجما ألدريتش
مجهر	مجسم SM2800	نيكون
فورمالديهايد	99340	كاسيت تضمين Reactolab
	K113.1	برنامج
Bersoft	Bersoft.com	برنامج مرخص

جهاز قياس الصور Carl Roth