مقالة منهجية

مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي

DOI:

10.3791/54934

⸱

فبراير 24, 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤدي الإجهاد الميكانيكي إلى التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية ، مما يوفر نهجا علاجيا محتملا لإصلاح الغضروف الضعيف. نقدم بروتوكولا للحث على التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) باستخدام جاذبية الطرد المركزي (CG). يؤدي التنظيم الناجم عن CG ل SOX9 إلى تطوير أنماط ظاهرية غضروفية المنشأ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغضروف الضعيف لا يمكن أن يشفى بشكل طبيعي. حاليا ، العلاج الأكثر تقدما لعيوب الغضروف هو زرع الخلايا الغضروفية المتمايزة عن الخلايا الجذعية باستخدام السيتوكينات. لسوء الحظ ، فإن التمايز الغضروفي الناجم عن السيتوكينات مكلف ويستغرق وقتا طويلا ويرتبط بمخاطر عالية للتلوث أثناء التمايز في المختبر. ومع ذلك ، فإن المحفزات الميكانيكية الحيوية تعمل أيضا كعوامل تنظيمية حاسمة لتكوين الغضروف. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الإجهاد الميكانيكي إلى تمايز غضروفي الخلايا الجذعية ، مما يشير إلى نهج علاجي محتمل لإصلاح الغضروف الضعيف. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن جاذبية الطرد المركزي (CG ، 2،400 × جم) ، وهو إجهاد ميكانيكي يتم تطبيقه بسهولة عن طريق الطرد المركزي ، أدى إلى تنظيم المنطقة المحددة للجنس Y (SRY) - المربع 9 (SOX9) في الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) ، مما تسبب في التعبير عن الأنماط الظاهرية الغضروفية. عبرت ASCs التي يتم طردها المركزي عن مستويات أعلى من علامات التمايز الغضروفي ، مثل aggrecan (ACAN) ، والكولاجين من النوع 2 alpha 1 (COL2A1) ، والكولاجين من النوع 1 (COL1) ، ولكن مستويات أقل من الكولاجين من النوع 10 (COL10) ، وهي علامة على الخلايا الغضروفية الضخامية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تكوين الركام الغضروفي ، وهو شرط أساسي لتكوين الغضروف ، في ASCs بالطرد المركزي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عيوب في الغضروف المفصلي لا تلتئم بشكل طبيعي. ونتيجة لذلك، وقف وقد اقترح زرع الخلايا كنهج واعدة لإصلاح الغضروف ضعف. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب على حد سواء الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية وتحريض هذه الخلايا على الخضوع التمايز المولدة للغضروف. نخاع العظم (BM) وقد استخدم على نطاق واسع كمصدر للخلايا الجذعية، لكن العزلة خلية من BM اثنين من عيوب رئيسية هي: الغزو وعدم كفاية العائد. بسبب سهولة اقتناء والأنسجة الدهنية مصدرا مفضلا للخلايا الجذعية. وأظهرت دراسات سابقة إمكانية عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الدهنية ويحفز التمايز المولدة للغضروف في هذه الخلايا باستخدام السيتوكينات، مثل TGF-β1 1 و 2. هذه الطرق فعالة لكنها باهظة الثمن.

باعتبارها أقل تكلفة البديل لالسيتوكينات، إجهاد يمكن استخدامها للحث على تمايز المولدة للغضروف. تحميل الميكانيكية يلعب دورا حاسما في الحفاظ على صحة الغضروف المفصلي 3، ويمكن أن تحدث الظواهر المولدة للغضروف في خلايا مختلفة. على سبيل المثال، الضغط الهيدروليكي يدفع الظواهر المولدة للغضروف في الخلايا الاولية المستمدة من الغشاء الزليلي عبر خطة عمل البحر المتوسط كيناز / JNK مسار 4، والضغط الميكانيكي يدفع تكون الغضروف في الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) من خلال upregulating الجينات chondrocytic 5. وبالإضافة إلى ذلك، إجهاد القص يساهم في التعبير عن ذات الصلة تكون الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) في اللجان الدائمة الإنسان 6. خطورة الطرد المركزي (م)، وإجهاد تطبيقها بسهولة والتحكم التي تم إنشاؤها بواسطة الطرد المركزي، يمكن أن تحفز التعبير الجيني الفرق في الخلايا 7. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الرئة الظهارية، وupregulated التعبير عن انترلوكين (IL) -1b بواسطة الطرد المركزي 8. تيherefore، باعتبارها إجهاد محرض تجريبيا، CG يمكن أن تستخدم للحث على التعبير الجيني chondrocytic في الخلايا الجذعية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت CG يمكن أن تحفز على تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف.

في هذه الدراسة، وجدنا أن CG يسببها upregulation من SOX9، المنظم الرئيسي لتكون الغضروف، في مخولا لصيانة طائرات الإنسان، مما أدى إلى overexpression من الجينات chondrocytic. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا مقارنة آثار CG على الغضروف مع تلك TGF-β1، وعامل النمو الأكثر شيوعا للحث في المختبر تكون الغضروف في الخلايا الجذعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC16EAME0162) وإجراء فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. تم الحصول على جميع أنسجة مع الموافقة المسبقة عن مكتوب.

1. الطرد المركزي الجاذبية تحميل وبيليه الثقافة

  1. زراعة الخلايا والحصاد
    1. مخولا لصيانة طائرات الثقافة (P2-P3، انظر قائمة من المواد) في Dulbecco لتعديل المتوسطة انخفاض مستوى السكر في النسر (DMEM-LG) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
    2. عندما تصل الخلايا 80٪ التقاء، تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملم EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
    4. اضغط على لوحة الثقافة بلطف، إضافة 4 مل من متوسطة جديدة، نقل الخلايا إلىأنبوب 15 مل المخروطية، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. الطرد المركزي الجاذبية تحميل
    1. بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.1.4)، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 10 مل من DMEM-LG مع FBS 10٪. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    2. الفريق الاستشاري للتحميل، ونقل 2.5 × 10 5 الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي في 2400 × ز لمدة 15 دقيقة.
  3. ثقافة بيليه
    1. مباشرة بعد الطرد المركزي، ونضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من يعرف متوسطة التمايز المولدة للغضروف (CDM، وارتفاع الجلوكوز DMEM تستكمل مع 1٪ FBS، 1٪ ITS + بريمكس، 100 نانومتر ديكساميثازون، 1X MEM غير الضرورية حل الأحماض الأمينية، 50 ميكروغرام / مل L-البرولين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). إضافة 50 ميكروغرام / مل من الطازجة حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات في كل تغيير المتوسط. كما تحكم إيجابية، لحث differentiati مكون للغضروفعلى الخلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
    2. وضع أنابيب توج فضفاضة تحتوي على الكريات في وضعية الوقوف واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
    3. تغيير المتوسط ​​كل يوم لمدة 3 أسابيع.
  4. ثقافة MICROMASS
    1. مباشرة بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.2.2، 2400 × ز لمدة 15 دقيقة)، ونضح طاف و resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
    2. لتشكيل MICROMASS، وضع الخلايا معلق في وسط بئر من 24 لوحة جيدا.
    3. بعد 2 ساعة، إضافة بعناية 1 مل من آلية التنمية النظيفة إلى البئر، pipetting لضد الجدار لوحة لتجنب تعطيل MICROMASS. كما تحكم إيجابية، نفذ ثقافة MICROMASS مع خلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
    4. احتضان MICROMASS عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
    5. تغيير إف المتوسطريها يوم لمدة 3 أسابيع.

2. عكسي الناسخ، البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للكشف الترانسكربتي Upregulation من مكون للغضروف التمايز علامات

  1. في يوم 14، واستخدام ماصة لنقل الكريات كروي لأنبوب جديد 1.5 مل وغسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج 9.
  3. توليف [كدنا من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الناسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم تعطيل انزيم على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
  4. أداء PCR مع الاشعال محددة للعلامات التمايز المولدة للغضروف 10.

3. تلطيخ للكشف عن overexpression من مكون للغضروف التمايز ماركر البروتينات

  1. الكريات خلية تضمين البارافين
    1. في يوم 21،استخدام ماصة للحصاد الكريات كروي وغسلها مع برنامج تلفزيوني 1X.
    2. إصلاح الكريات كروي عن طريق الغمر في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة.
      تحذير: لامتصاص العرق عالية السمية. تجنب ملامسة العينين والجلد، أو الأغشية المخاطية. تقليل التعرض وتجنب استنشاق أثناء التحضير. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    3. تجاهل تثبيتي، وشطف الكريات الخلايا مع الماء منزوع الأيونات (DW).
    4. وضع طبقة واحدة من الشاش على الكاسيت ونقل الكريات الثابتة باستخدام ماصة. تغطية بيليه عن طريق طي الشاش وإغلاق غطاء كاسيت.
    5. يذوى الكريات.
      1. تزج الكريات في 70٪ من الإيثانول (ETOH) لمدة 5 دقائق على RT.
      2. تزج الكريات في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
      3. تزج الكريات في 95٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
      4. تزج الكريات في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT. كرر مرتين.
      5. تزج الكريات في 100٪ الزيلين لمدة 15 دقيقة في RT. كرر التويم.
    6. تضمين الكريات خلية ثابتة في البارافين عند 56 درجة مئوية في القالب. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الكريات في البارافين باستخدام نظم معالجة الأنسجة الآلي المتخصصة.
    7. قطع 5 أقسام ميكرون سميكة من الخلية بيليه جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مشراح الدوارة.
    8. تعويم المقاطع في 50٪ ETOH ومن ثم نقلها إلى حمام الماء 50 درجة مئوية باستخدام الشرائح.
    9. ضع أقسام عائمة على الشرائح.
  2. سفرانين يا وتلطيخ الأزرق الألسيان
    1. ترطيب أقسام البارافين.
      1. تزج الشرائح في الزيلين لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين.
      2. تزج الشرائح في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
      3. تزج الشرائح في 90٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
      4. تزج الشرائح في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
      5. تزج الشرائح في 70٪ ETOH لمدة 5 دقائق، ثم غسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
    2. وصمة عار على أقسام ممهى مع 1٪ سفرانين يا حل و 3٪ الأزرق الألسيان ل30 دقيقة.
    3. تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
    4. وصمة عار على أقسام مع حل الهيماتوكسيلين / يوزين (مباين) لمدة 1 دقيقة.
    5. تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
    6. ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على ساترة تحتوي على المتوسطة المتزايدة.
    7. السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3 ساعة عند RT.
    8. التقاط الصور باستخدام المجهر مشرق الميدان (الآلي المجهر تستقيم، 50X و200X).
  3. المناعي فحص
    1. ترطيب أقسام كما هو موضح في القسم 3.2.1.
    2. تزج الشرائح في المخزن سيترات الصوديوم (10 ملي سيترات الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.0)، ثم الحفاظ عليها عند درجة حرارة الغليان الفرعية لمدة 10 دقيقة باستخدام الميكروويف.
    3. تبريد الشرائح لمدة 20 دقيقة في RT ثم غسلها بماء الصنبور.
    4. احتضان الشرائح في 3٪H 2 O 2 (في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل لهم ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة 11.
    5. منع الشرائح مع عازلة تمنع (10٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة.
    6. نضح عرقلة الحل، ومن ثم تطبيق الأجسام المضادة الأولية المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي على الشرائح.
    7. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    8. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    9. احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية-تألقي مترافق المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
    10. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في الظلام.
    11. احتضان الشرائح مع دابي (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل لهم مرتين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    12. ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على تصاعد المتوسط.
    13. السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3ساعة في الظلام في RT.
    14. تصور الشرائح باستخدام المجهر مضان (Rhod: 594 نانومتر، دابي: 340 نانومتر؛ 60X والتكبير 200X) 12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطورة الطرد المركزي تحرض على overexpression من علامات التمايز المولدة للغضروف في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.

لتحديد درجة قوة الجاذبية الطرد المركزي التي هي مناسبة للحث على تمايز المولدة للغضروف، وحفز مخولا لصيانة طائرات مع درجات مختلفة من CG (0، 300، 600، 1200، و 2400 x ج) لمدة 15 دقيقة. بعد التحفيز، وكانت المصنفة إعادة لمخولا لصيانة طائرات عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدولة stemness الخلايا مهمة جدا ل overexpression الناجم عن CG-من SOX9. في دراستنا، يمكن أن يتسبب التعبير SOX9 التي كتبها CG في مخولا لصيانة طائرات المبكر مرور (2-3)، ولكن ليس في مخولا لصيانة طائرات في وقت لاحق-مرور. وقد أفيد أنه خلال زراعة، مخولا لصيانة طائرات تحتوي على CD34 + الخلايا حتى 3 مقاطع (16). مخولا لصيانة طائرات تميل الى فقدان التعبير عن CD34 كما و passaged الخلايا، مما أدى إلى استجابة منخفضة لCG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعلن أنه ليس لدينا تضارب في المصالح مرتبط بهذا العمل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI14C2116) ومن قبل صندوق الأبحاث في مستشفى سيول سانت ماري ، الجامعة الكاثوليكية في كوريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

ASC Culture Media Materials< / strong> البقري 354352 < td colspan = "4" >< قوي > المواد < / قوي الكاثوليكية

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>أدوات بلاستيكية< / قوي
>100 مم طبقTPP93100
60 مم طبقTPP93060
50 مل أنبوب كورنيكالSPL50050
15 مل أنبوب كورنيكالSPL50015
10 مل ماصة يمكن التخلصFalcon7551
5 مل ماصة يمكن التخلص منهاFalcon7543<
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM تقنيات حياة الجلوكوز المنخفضة11885-084وسائط النمو
الأساسية بنسيلين ستربتومايسينسيجما ألدريتشP43331٪
تقنياتمصل الجنين البقري16000-04410٪
PBS / 1 ملي مولار EDTALife Technologies12604-039
gondrogenic Differentiation Media Materials< / strong>
DMEM HighGlucose LifeTechnologies 11995وسائط قاعدة التمايز الغضروفي
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Life Technologies11140-050
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD2915100 نانومتر
بنسيلين ستربتومايسينلايف تكنولوجيزP43331٪
تقنيات مصل الجنين16000-0441٪
أسكوربات -2-فوسفاتسيجما ألدريتشA896050 &# 956; جم / مل
L-prolineSigma AldrichP560750 &# 956; جم / مل لتر
BD1٪
TGF البشري & بيتا ؛ 1Peprotech100-2110 نانوغرام / مل
> 18 مم غطاء زجاجيمتفوقHSU-0111580
4٪ ParaformaldyhydeTech & amp ابتكارBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
مختبر ناقلاتالألبومين الأبقارSP-5050
الأجسام المضادة للكولاجين IIabcam   ؛ab347121:100
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 594المسبار الجزيئيالمترافق A-110371:200
DAPIالمسبار الجزيئيD1306
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتانInvitrogenP36934
زجاج منزلق ، مطليHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
الكلوروفورمسيجما ألدريتش366919
إيزوبريبيل كحولميليبور109634
الإيثانولدوكسان64-17-5
RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit Thermo ScientficK1622
i-Taq DNA PolymeraseiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
تحميل نجمDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 كيلو بايت (+) علامة سلم الحمض النوويEnzynomicsDM003
الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (ASCs) الخلاياالرئيسية
منها td colspan = "4" >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SOX9 2 O

مقالات ذات صلة