يمكن أن يؤدي الإجهاد الميكانيكي إلى التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية ، مما يوفر نهجا علاجيا محتملا لإصلاح الغضروف الضعيف. نقدم بروتوكولا للحث على التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) باستخدام جاذبية الطرد المركزي (CG). يؤدي التنظيم الناجم عن CG ل SOX9 إلى تطوير أنماط ظاهرية غضروفية المنشأ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الغضروف الضعيف لا يمكن أن يشفى بشكل طبيعي. حاليا ، العلاج الأكثر تقدما لعيوب الغضروف هو زرع الخلايا الغضروفية المتمايزة عن الخلايا الجذعية باستخدام السيتوكينات. لسوء الحظ ، فإن التمايز الغضروفي الناجم عن السيتوكينات مكلف ويستغرق وقتا طويلا ويرتبط بمخاطر عالية للتلوث أثناء التمايز في المختبر. ومع ذلك ، فإن المحفزات الميكانيكية الحيوية تعمل أيضا كعوامل تنظيمية حاسمة لتكوين الغضروف. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الإجهاد الميكانيكي إلى تمايز غضروفي الخلايا الجذعية ، مما يشير إلى نهج علاجي محتمل لإصلاح الغضروف الضعيف. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن جاذبية الطرد المركزي (CG ، 2،400 × جم) ، وهو إجهاد ميكانيكي يتم تطبيقه بسهولة عن طريق الطرد المركزي ، أدى إلى تنظيم المنطقة المحددة للجنس Y (SRY) - المربع 9 (SOX9) في الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) ، مما تسبب في التعبير عن الأنماط الظاهرية الغضروفية. عبرت ASCs التي يتم طردها المركزي عن مستويات أعلى من علامات التمايز الغضروفي ، مثل aggrecan (ACAN) ، والكولاجين من النوع 2 alpha 1 (COL2A1) ، والكولاجين من النوع 1 (COL1) ، ولكن مستويات أقل من الكولاجين من النوع 10 (COL10) ، وهي علامة على الخلايا الغضروفية الضخامية. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ تكوين الركام الغضروفي ، وهو شرط أساسي لتكوين الغضروف ، في ASCs بالطرد المركزي.
المقدمة
عيوب في الغضروف المفصلي لا تلتئم بشكل طبيعي. ونتيجة لذلك، وقف وقد اقترح زرع الخلايا كنهج واعدة لإصلاح الغضروف ضعف. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب على حد سواء الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية وتحريض هذه الخلايا على الخضوع التمايز المولدة للغضروف. نخاع العظم (BM) وقد استخدم على نطاق واسع كمصدر للخلايا الجذعية، لكن العزلة خلية من BM اثنين من عيوب رئيسية هي: الغزو وعدم كفاية العائد. بسبب سهولة اقتناء والأنسجة الدهنية مصدرا مفضلا للخلايا الجذعية. وأظهرت دراسات سابقة إمكانية عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الدهنية ويحفز التمايز المولدة للغضروف في هذه الخلايا باستخدام السيتوكينات، مثل TGF-β1 1 و
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC16EAME0162) وإجراء فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. تم الحصول على جميع أنسجة مع الموافقة المسبقة عن مكتوب.
1. الطرد المركزي الجاذبية تحميل وبيليه الثقافة
- زراعة الخلايا والحصاد
- مخولا لصيانة طائرات الثقافة (P2-P3، انظر قائمة من المواد) في Dulbecco لتعديل المتوسطة انخفاض مست....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
خطورة الطرد المركزي تحرض على overexpression من علامات التمايز المولدة للغضروف في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.
لتحديد درجة قوة الجاذبية الطرد المركزي التي هي مناسبة للحث على تمايز المولدة للغضروف، وحفز مخولا لصيانة طائرات مع درجات مختلفة من CG (0، 300، 600، 1200، و 2400 x ج) لمدة 15 دقيقة. بعد التحفيز، وكانت المصنفة إعادة لمخولا لصيانة طائرات عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الدولة stemness الخلايا مهمة جدا ل overexpression الناجم عن CG-من SOX9. في دراستنا، يمكن أن يتسبب التعبير SOX9 التي كتبها CG في مخولا لصيانة طائرات المبكر مرور (2-3)، ولكن ليس في مخولا لصيانة طائرات في وقت لاحق-مرور. وقد أفيد أنه خلال زراعة، مخولا لصيانة طائرات تحتوي على CD34 + الخلايا حتى 3 مقاطع (16). مخولا لصيانة طائرات تميل الى فقدان التعبير عن CD34 كما و passaged الخلايا، مما أدى إلى استجابة منخفضة لCG.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
نعلن أنه ليس لدينا تضارب في المصالح مرتبط بهذا العمل.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكوري من خلال المعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI) ، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI14C2116) ومن قبل صندوق الأبحاث في مستشفى سيول سانت ماري ، الجامعة الكاثوليكية في كوريا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
ASC Culture Media Materials< / strong> البقري 354352 < td colspan = "4" >< قوي > المواد < / قوي الكاثوليكية
منها td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>أدوات بلاستيكية< / قوي | |||
| >100 مم طبق | TPP | 93100 | |
| 60 مم طبق | TPP | 93060 | |
| 50 مل أنبوب كورنيكال | SPL | 50050 | |
| 15 مل أنبوب كورنيكال | SPL | 50015 | |
| 10 مل ماصة يمكن التخلص | Falcon | 7551 | |
| 5 مل ماصة يمكن التخلص منها | Falcon | 7543< | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM تقنيات حياة الجلوكوز المنخفضة | 11885-084 | وسائط النمو | |
| الأساسية بنسيلين ستربتومايسين | سيجما ألدريتش | P4333 | 1٪ |
| تقنيات | مصل الجنين البقري16000-044 | 10٪ | |
| PBS / 1 ملي مولار EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| gondrogenic Differentiation Media Materials< / strong> | |||
| DMEM High | Glucose Life | Technologies 11995 | وسائط قاعدة التمايز الغضروفي |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D2915 | 100 نانومتر |
| بنسيلين ستربتومايسين | لايف تكنولوجيز | P4333 | 1٪ |
| تقنيات مصل الجنين | 16000-044 | 1٪ | |
| أسكوربات -2-فوسفات | سيجما ألدريتش | A8960 | 50 &# 956; جم / مل |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 &# 956; جم / مل لتر |
| BD | 1٪ | ||
| TGF البشري & بيتا ؛ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 نانوغرام / مل |
| > 18 مم غطاء زجاجي | متفوق | HSU-0111580 | |
| 4٪ Paraformaldyhyde | Tech & amp ابتكار | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| مختبر ناقلات | الألبومين الأبقار | SP-5050 | |
| الأجسام المضادة للكولاجين II | abcam ؛ | ab34712 | 1:100 |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 594 | المسبار الجزيئي | المترافق A-11037 | 1:200 |
| DAPI | المسبار الجزيئي | D1306 | |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان | Invitrogen | P36934 | |
| زجاج منزلق ، مطلي | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| الكلوروفورم | سيجما ألدريتش | 366919 | |
| إيزوبريبيل كحول | ميليبور | 109634 | |
| الإيثانول | دوكسان | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis | Kit Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| تحميل نجم | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 كيلو بايت (+) علامة سلم الحمض النووي | Enzynomics | DM003 | |
| الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (ASCs) الخلايا | الرئيسية | ||
المراجع
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
