دراسة مقارنة بين المخدرات طرق التسليم المستهدفة إلى الأذن ماوس الداخلية: Bullostomy مقابل بطريق غشاء الطبل حقن

ملخص

تم وصف نهجين للجراحة المجهرية لتوصيل الدواء الموضعي إلى الأذن الداخلية هنا ومقارنتين من حيث التأثير على معلمات السمع والبنية الخلوية للقوقعة والتعبير عن علامات الالتهاب.

الملخص

نقدم اثنين من التقنيات المجهرية التنظيرية في القوارض لتسليم المخدرات محددة في الأذن الوسطى بحيث قد تصل إلى الأذن الداخلية. يتكون الإجراء الأول من ثقب في الفقاعة الطبلية، ووصف bullostomy. والثاني هو حقن بطريق غشاء الطبل. كلا محاكاة الإجراءات داخل الطبلة السريرية البشرية.

استخدمت الشيتوزان-سكرولي (CGP) وRinger's عازلة اللاكتات (RL) كوسائل حيويا لتسليم المخدرات المحليين. CGP هو بوليمر قابلة للتحلل سامة تستخدم على نطاق واسع في التطبيقات الصيدلانية. وهو سائل لزج في RT لكنها تجميده إلى مرحلة شبه صلبة في درجة حرارة الجسم. RL هو الحل متساوي التوتر المستخدمة في الإدارات عن طريق الوريد في البشر. يتم وضع كمية صغيرة من هذه المركبات بدقة على مكانة جولة النافذة (RW) عن طريق bullostomy. وحقن بطريق غشاء الطبل يملأ الأذن الوسطى ويسمح أقل سيطرة ولكن الوصول الأوسع إلى الأذن الداخلية.

الصورة = "jove_content"> تم دراسة ملامح سلامة كل من التقنيات ومقارنة باستخدام الاختبارات الوظيفية والشكلية. سماع تم تقييمها من قبل تسجيل جذع الاستجابة السمعية (ABR) قبل وعدة مرات بعد جراحة. تمت دراسة مستوى التهندس الخلوي والحفاظ على الهياكل قوقعة من خلال تقنيات النسيجية التقليدية في ثابت لامتصاص العرق وdecalcified عينات القوقعة. في موازاة ذلك، وتم أخذ عينات قوقعة غير المثبتة وتجمد فورا لتحليل ملامح التعبير الجيني من علامات للالتهابات التي كتبها الكمي عكسي الناسخ تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR QRT-).

كلا إجراءات مناسبة وسائل إيصال المخدرات إلى الماوس الأذن الوسطى، على الرغم من حقن بطريق غشاء الطبل أثبت أنه أقل الغازية مقارنة bullostomy.

المقدمة

ضعف السمع هو العجز الحسي البشري الأكثر شيوعا ويؤثر على 5.3٪ من السكان في جميع أنحاء العالم، و 30٪ من الأفراد فوق سن ال 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en ، تحديث 2016). فقدان السمع يؤثر على اكتساب اللغة لدى الأطفال وتسارع التدهور المعرفي لدى كبار السن. لذلك، بل هو مشكلة الرعاية الصحية كبيرة مع آثار اجتماعية واقتصادية هائلة. يمكن أن يكون سبب عيوب وراثية وعوامل بيئية أو مزيج من الاثنين معا ^1، والتي في النهاية إحداث ضرر وموت خلايا الشعر والخلايا العصبية في قوقعة الأذن. هذه الخلايا لا تجديد في الثدييات، وبالتالي فقدان الخلوية وفقدان السمع يصاحب ذلك لا يمكن عكسها. تستند خيارات السريرية على الأجهزة التعويضية، بما في ذلك السمع والقوقعة والأذن الوسطى وزرع العظام التوصيل ^2. للأسف، لا توجد trea التصالحية طبي محددوتتركز tments لضعف السمع، وبالتالي العديد من خطوط الأبحاث على تطوير علاجات وقائية وتعويضية. وتشمل خيارات علاجية جديدة الجينات وعلاجات الخلايا وكذلك تطوير جزيئات صغيرة للعلاج الدوائي ^2.

واحدة من أهم التحديات في العلاج الدوائي القوقعة هو تسليم المخدرات. العلاجات الجهازية محدودة الفاعلية في القوقعة بسبب حاجز الدم متاهة ^3، البطانة مستمرة في اتصال مع الأوعية الدموية القوقعة، الذي يعمل بمثابة حاجز مادي والكيمياء الحيوية للحفاظ الداخلي التوازن الأذن السائل، وبالتالي الحد من مرور المخدرات إلى الأذن الداخلية. ومن منفذة فقط إلى جزيئات صغيرة ذواب في الشحوم، على الرغم من نفاذية يمكن زيادة خلال التهاب القوقعة، وأيضا مع استخدام مدرات البول أو وكلاء الاسموزي. حجم المخدرات التي تصل في نهاية المطاف إلى القوقعة بعد تخفيض الإدارة النظامية.وبالتالي، هناك حاجة جرعات عالية قد يسبب سمية العضوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الاستقلاب الكبدي من المخدرات تنتج نواتج سامة أو غير نشطة ^{4، 5، 6، 7.} في المقابل، تدخلات محلية تسمح للوضع كمية محدودة معروفة من المخدرات في الأذن الوسطى أو الداخلية من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها ^{4، 7، 8، 9.} في الممارسة السريرية الحالية، والإدارات داخل الطبلة تقتصر على بعض الأمراض قوقعة، مثل جنتاميسين في مرض مينيير ^10، القشرية في الصمم المفاجئ، مرض مينيير، محصنة بوساطة والضوضاء التي يسببها فقدان السمع، ^{11، 12، 13، 1}عامل النمو الذي يشبه الانسولين 4 ^{و 15} و 1 (IGF1) في الصمم المفاجئ ^{4 و 16 و 17.}

يجب أن الصياغات للإدارة المحلية الحفاظ على التوازن الحساس (درجة الحموضة والأسمولية) من السوائل القوقعة. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا للحفاظ على عقم في جميع مراحل عملية لتجنب التلوث الجرثومي من السائل المخي الشوكي. وسواغ تستخدم لتوصيل الدواء يجب أن يكون حيويا، nonototoxic ومن الاتساق المناسب. ينصح حلول السائلة لحقن intracochlear، ولكن ليست مناسبة للمسار داخل الطبل نظرا للتخليص من خلال القناة السمعية. في هذه الحالة، وعادة ما تقوم العقاقير التي كتبها المواد الهلامية شبه صلبة لزيادة بقائها في الأذن الوسطى ^{4 و 18 و 19.} بديل التنفسي تسليممللي تستخدم ناقلات لزيادة مرور المخدرات إلى الأذن الداخلية هي الجسيمات النانوية ²⁰ والفيروسات الغدية ²¹ هنا قارنا سيارتين: CGP وحل RL. CGP هو هيدروجيل التي شكلتها الشيتوزان، وهو السكاريد خطية مؤلفة من D الجلوكوزامين وN-أسيتيل-D الجلوكوزامين تم الحصول عليها من قذائف القشريات، وβ-سكرولي، البوليول التي تشكل درعا من المياه في جميع أنحاء سلاسل الشيتوزان ويحافظ عليه في شكل سائل. CGP هو للحرارة ويمكن أن يتحلل من الليزوزيم، والسماح لإطلاق سراح المخدرات مستمر في الأذن الوسطى ^{22، 23، 24، 25.} الهلاميات المائية الشيتوزان قاعدة هي وسائل مناسبة للتطبيقات السريرية مثل تسليم المخدرات نظرا لعدم وجود المناعة وعدم تفعيل التفاعلات الالتهابية المحلية ^{23، 24.} على الغيرإيه ناحية، عازلة RL هو حل متساوي التوتر غير بالبيروجينات (273 ملي أوزمول / L ودرجة الحموضة 6.5) المخصصة للإدارة عن طريق الوريد في البشر كمصدر للمياه والشوارد، وخاصة في فقدان الدم أو صدمة أو حرق إصابات بسبب تركات التمثيل الغذائي اللاكتات في الكبد مواجهة الحماض.

نحن هنا وصف ومقارنة بين الأساليب الجراحية التي تم صقلها لتسليم المخدرات المحليين على الماوس الأذن الداخلية. تم تقييم درجة الأمان لكلا تقنيات باستخدام الاختبارات الوظيفية، المورفولوجية والجزيئية. السمع وتقييمها باستخدام استجابة الدماغ السمعية (ABR) ^{26، 27} التي أجريت قبل وبعد جراحة في أوقات مختلفة. واستخدمت الإجراءات نقطة النهاية لتشريح القوقعة ومقارنة تأثير التشريحية، الخلوية والجزيئية لهذه الإجراءات المجهرية اثنين.

البروتوكول

تأكد من أن إجراءات التعامل مع الحيوانات تتفق مع القوانين الدولية والوطنية. بروتوكول يتبع الجماعة الأوروبية 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والإسباني RD 53/2013 المبادئ التوجيهية، على التوالي.

المناولة 1. الحيوان العام

1. الفئران تغذية libitum الإعلانية مع اتباع نظام غذائي القياسية ومياه الشرب. الصحة السيطرة ورفاه باتباع الاتحاد للمختبر الحيوان جمعيات العلوم (FELASA) توصيات.

تقييم 2. السمع

ملاحظة: مسار وظيفي تأثير الإجراءات المجهرية عن طريق اختبار السمع قبل ومرات عديدة بعد الجراحة (في هذا العمل 2 و 7 و 14 و 28 د postmicrosurgery) مع الإجراءات غير الغازية مثل ABR ^9.

1. لاختبار ABR، تخدير الفئران مع بروتوكولات تأثير مدة قصيرة أي حقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم (BW) وزيلازين (10ملغم / كغم، BW). بدلا من ذلك، نفذ سماع الاختبارات تحت التخدير نشوق.
   ملاحظة: منذ المعلمات ABR يمكن أن تتأثر بروتوكول مخدر ^28، استخدام نفس واحدة في كافة مراحل التجربة.
2. تحقق من عمق التخدير عن طريق اختبار رد الفعل إصبع القدم قرصة.
   ملاحظة: عندما يختفي منعكس الانسحاب، وصلت الحيوان عمق مناسب من التخدير لإجراء الاختبار السمعي.
3. حماية العينين من الجفاف والجاف القرنية الثانوي من قبل إدارة الموضعية المكملات المسيل للدموع، مثل المواد الهلامية على أساس ميثيل هيدروكسي.
4. الحفاظ على الماوس في درجة حرارة الفسيولوجية (37،5 حتي 38 درجة مئوية) خلال الإجراء بأكمله. لتفادي أي تشويش الكهربائية، واستخدام الدافئة مضخة المياه والتدفئة وسادة. مراقبة درجة حرارة الجسم مع تحقيقات المستقيم. دائما الحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الحيوان.
   ملاحظة: نوصي تنظيف لوحة التدفئة مع مطهر السطح بين الفئران.0؛ لتحريض التخدير والإنعاش، ومنصات التدفئة الكهربائية، والمتوهجة أو أضواء الأشعة تحت الحمراء يمكن استخدامها.
5. الإجراء ABR
   ملاحظة: للحصول على تسجيل ABR، استخدام محطة عمل الكمبيوتر مع بطاقة صوت نحو الداخل لخلق الطول الموجي (الرقمية إلى تناظرية، DA الإخراج، تحويل) ورقمنة الطول الموجي استجابة الكهربائية (التناظرية إلى الرقمية، ومدخلات م)، المخفف، الذبذبات و منخفضة مقاومة مكبر للصوت. محطات العمل السمعية الحديثة (أي تاكر ديفيس Techonologies) تشمل جميع هذه المكونات في نظام مدمجة واحدة.
   1. ضع الماوس تخدير في موقف المعرضة على منصات التدفئة داخل الغرفة، تخفيف الصوت لتفادي أي تشويش الضوضاء المحيطة وصدى (الشكل 1).
   2. تقديم المحفزات الصوتية في القناة السمعية الخارجية. استخدام المحفزات مسبقا أو إشارات جديدة مصممة مع البرنامج المناسب. ربط مخرجات محطة DA للمتكلم المحدد.
      ملاحظة: الصحائفيمكن أن تستخدم الإلكتروني الحقل أو الميدان إغلاق مكبرات الصوت إدراجها في القناة السمعية الخارجية. السابق هي المفضلة عند العمل مع الفئران بسبب صعوبة في إدراج التحقيق ومعايرة الصوت في أنظمة مغلقة. مكبرات الصوت الساحة خالية تحفيز كلتا الأذنين واستثارة رد فعل الأذنين. للحصول على ردود في الغالب بإذن مع مكبرات صوت الميدان الحر، والنشاط المقابل لابد من القضاء عليه من خلال انسداد (أي مع سدادات الأذن) أو عن طريق اخفاء الضوضاء.
      1. وضع رئيس الميداني مجانا على مسافة ثابتة (عادة 5-20 سم) التي تواجه الرأس أو الأذن المحدد مع مركز المتكلم تتماشى مع القناة السمعية الخارجية. ضمان عدم وجود عوائق ما بين المتكلم والأذن والتي يتم فتحها الصيوان تماما.
   3. وضع الفولاذ المقاوم للصدأ أقطاب إبرة تحت الجلد على النحو التالي: أ) نشط إيجابي) القطب (في فروة الرأس بين الأذنين (أكثر من قمة الرأس من الجمجمة)، والثاني) المرجع (سلبي) الكهربائي، في النكفيةالمنطقة تحت الصيوان، والثالث) القطب الأرض في الظهر أو الذيل أو هند منطقة الطرف (الشكل 1).
      1. تحقق من معاوقة في الأقطاب الموجبة والسالبة. تأكد من أن مقاومة أقل من 3 kOhm (مثالي 1 kOhm). إذا كان أعلى من ذلك، إعادة، نظيفة مع الكحول أو استبدال الأقطاب.
   4. للتسجيل ABR، تولد نقرات النطاق العريض وترددات لهجة نقية والحاضر في تقليل شدة 90-10 ديسيبل بالنسبة لمستوى ضغط الصوت (SPL) في 5-10 ديسيبل SPL الخطوات ^{27 و 29 و 30.}
      1. انقر موجز الحالي أو لهجة انفجر المحفزات (1-5 مللي ثانية) بدءا من مستوى عال (أي 80 أو 90 ديسيبل SPL) والحد من كثافة في 5-10 خطوات SPL ديسيبل. تسجيل استجابة الكهربائية في مللي ال 10 الاولى بعد التحفيز (أثار تظهر ردود ABR في 6-8 مللي ثانية).
         ملاحظة: لهذا السبب، ومعدلات التحفيزلا ينبغي أن يكون أعلى من 50 المحفزات / ثانية (المعدل الطبيعي 20-50).
   5. تضخيم وتسجيل ومتوسط ​​الاستجابة الكهربائية أثار لكل التحفيز وكثافة. استخدام مكبر للصوت مع انخفاض مستوى الضجيج وجيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وذلك لربط مدخلات م.
      ملاحظة: ABRs لها سعة منخفضة جدا، وعادة أقل من 1 μV (الذروة إلى الذروة) ويجب أن تكون مسجلة باستخدام مكبر للصوت مع ضوضاء منخفضة جدا. في الفئران السمع الطبيعي، وموجات ABR واضحة تظهر بعد في المتوسط 100-200 الردود، ولكن للحصول على تسجيلات عالية الجودة، أو في حالة ضعف السمع، ينصح أكثر من تكرار (750-1،000) ^27.
   6. تحديد بصريا عتبة ABR أثناء الاختبار.
      ملاحظة: عتبة ABR هو أقل كثافة المحفزات الصوت الذي يتسبب في ABR يمكن الاعتماد عليها مع تسجيل موجات من الأول إلى الرابع واضحة للعيان والمتوسطة الذروة إلى الذروة الجهد 2 SD فوق النشاط خلفية متوسط ^31. لابد من تأكيد هذه البيانات دوعصابة تحليل خارج الخط، جنبا إلى جنب مع غيرها من المعالم بما في ذلك الذروة وinterpeak الكمون، وموجة سعة.
   7. لتحليل البيانات إما يدويا أو تلقائيا.
      1. لتحليل اليدوي، وتحديد 4-5 موجات ABR (الأول والثاني والثالث ... الخ.) وعلامة من قمم (P1، P2، P3 ...) والوديان (N1، N2، N3 ...) لكل موجة. وبمجرد الانتهاء من التحليل، وتصدير البيانات إلى جدول بيانات أو ملف نصي.
         ملاحظة: برامج خاصة لتسجيل استجابة الكهربائية عادة ما يؤدي تحليل تلقائيا. قياسات إضافية يمكن تحديد في تسجيل ABR ردا على كثافة ثابتة (أي 70 أو 80 ديسيبل SPL) أو في كثافة نسبية على عتبات فوق الفردية (أي 15 ديسيبل SPL على عتبة).
6. أداء التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام برنامج ABR المناسب. اعتمادا على التصميم التجريبي، واستخدام معيار إقران تي اختبار أو تحليل التباين (ANOVA) لمقارنة parame ABR الرئيسيالنسب في مجموعات مختلفة ^{26، 30.}
   ملاحظة: في الدراسات الطولية، وتجمع العديد من البيانات الوظيفية من نفس الحيوان عند نقاط زمنية مختلفة (أي قبل وبعد الجراحة المجهرية). في هذه الحالة، ويقدم نموذجا المتكررة الخطي اختبار مقياس عام تحليلا مفصلا التباين.

3. إعداد سيارة

1. إعداد واستخدام الحلول السيارة تحت ظروف معقمة.
   ملاحظة: عادة ما تسوى حلول السائلة بسرعة من خلال القناة السمعية. ويمكن استخدام أنظمة تسليم عن طريق الحقن المختلفة لزيادة فترة بقاء الدواء في الأذن الوسطى، بما في ذلك الهلاميات المائية والجسيمات النانوية ^32.
   1. لإعداد CGP-هيدروجيل، حل 75٪ الشيتوزان deacetylated في 0.2 M حمض الخليك مما أسفر عن حل الشيتوزان 1.5-2٪ (وزن / وزن). إضافة 9٪ سكرولي (وزن / وزن) لهذا الحل ^7. إعداد الحلفقط قبل إدارة وتخزين هيدروجيل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: CGP-هيدروجيل هو لزج بشكل معتدل ولكن لا يزال عن طريق الحقن في درجة الحرارة هذه. أقل من 4 درجات مئوية فإنه يتحول إلى الحالة الصلبة، ومنع تطبيقها. بعد التطبيق، CGP يخضع لمرحلة انتقالية إلى مادة هلامية شبه صلبة في حوالي 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. قسامة (0.5 مل) عازلة RL التجاري وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

4. إجراءات المجهرية

1. حمل التخدير العام مع مجموعات الكيتامين أساس من المهدئات والمسكنات (أي الكيتامين 100 ملغ / كغ، medetomidine 0.05 ملغ / كغ وphentanile 0.025 ملغ / كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق، تليها كلاء نشوق (أي الأيزوفلورين).
   1. بعد إدارة وكلاء عن طريق الحقن، وضبط قناع مخدر إلى خطم الماوس وتوصيل التيار O ₂ لبخار الأيزوفلورين. الحفاظ على التخدير استنشاق خلالالمجهرية ورصد الطائرة التخدير مع منعكس إصبع القدم قرصة ونمط التنفس. بدء إعداد الجراحية عندما منعكس تلغ تماما، ويقدم الماوس التنفس العادي.
   2. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع منصات التدفئة خلال الإجراء بأكمله وحماية العينين من التهاب القرنية القرنية مع هلام القائم على ميثيل هيدروكسي.
2. إعداد المنطقة الجراحية النظيفة باستخدام الستائر العقيمة. تعقيم الأدوات المجهرية للتعقيم الزجاج حبة قبل الجراحة. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء العملية الجراحية كله (القفازات المعقمة، والستائر، والأدوات الجراحية، وما إلى ذلك).
3. المجهرية
   1. Bullostomy
      ملاحظة: Bullostomy هو إجراء من جانب واحد. تعمل أذن واحدة من الماوس واستخدام الأذن المقابل مثل السيطرة.
      1. ضع الماوس في موقف ضعيف استلقاء. اعداد منطقة الجراحية على السطح البطني من الرقبة باستخدام كليبرز لإزالة الفراء. تنظيف البشرة بمحلول مطهر البوفيدون اليود مقرها، وتغطية ذلك مع الستائر العقيمة.
      2. باستخدام مشرط، وجعل 2 سم شق طولي من الفك السفلي إلى الترقوة.
      3. تحت التكبير مع الميكروسكوب الجراحي، وتحديد الغدد تحت الفك السفلي وفصل كل من بالملقط. التراجع عن الغدد تحت الفك السفلي وتوطين أصل العضلة ذات البطنين والعصب الوجهي.
      4. إجراء شق في منشأ العضلة ذات البطنين مع مقص، وسحب ذلك من الناحية البطنية، وفضح الجانب الأساسي أقل شأنا-وسطي من الفقاعة الطبلية.
      5. جعل فتحة في الفقاعة من خلال حفر الى انه مع إبرة 27 G (الشكل 2A). توطين الشريان الركابي وRW غشاء الذيلية لها (الشكل 2B). تنظيف الدم من منطقة حفر مع الإسفنج الجيلاتين امتصاص.
      6. باستخدام 34 G القسطرة والمحاقن الزجاجية الصغيرة، وضخ ببطء 3-5 μL من حل السيارة (CGP-هيدروجيل أو RL) من خلال bullostomy مباشرة على مكانة RW، وملئه (الشكل 2C). ختم bullostomy مع 1-2 قطرات من مادة لاصقة الأنسجة.
      7. العودة الغدد تحت الفك السفلي إلى وضعها الأولي وإغلاق شقوق الجلد مع خياطة الجراحية 5-0 الحرير. تطبيق مطهر حول شق لتجنب العدوى الجرح القائم على الكلورهيكسيدين. ملاحظة: يمكن أن تستخدم الغرز للامتصاص وغير قابل للامتصاص. يجب إزالة الغرز غير قابل للامتصاص في 2 أسابيع. لا ينصح الحرير إغلاق الجلد منذ يرتبط استخدامه مع عدوى شق وردود الفعل النسيج المحلية.
   2. حقن بطريق غشاء الطبل الثنائي
      1. ضع الماوس في وضع استلقاء الجانبي وإعداد المنطقة الجراحية العقيم تحت الصماخ السمعي الخارجي كما هو موضح في 4.3.1.1.
      2. جعل شق 0.5 سم الطولي في الجزء الرأسي من القناة السمعية الخارجية على مقربة من الزنمة والصورةection حظيرة الجلدي الداخلي من الصيوان (اختياري).
      3. حدد موقع غشاء الطبل في نهاية قناة الأذن الخارجية باستخدام الميكروسكوب الجراحي (الشكل 2E) وتحديد بارس العليا الرخو وبارس أدنى الموتر، الذي ينقسم إلى الأمامية والخلفية المقاطع التي مقبض المطرقة (الشكل 2F) .
      4. جعل myringostomy صغيرة في الجزء الذيلية للالرخو بارس. إجراء شق إضافي في الموتر لفارس من الغشاء الطبلي، للسماح للإخلاء الهواء خلال حقن ^33. حقن بلطف 10-15 ميكرولتر من السيارة (CGP-هيدروجيل أو RL) حل مع حقنة زجاجية صغيرة متصلة 34 G القسطرة من خلال الجزء الرخو، على مقربة من مكانة RW حتى الأذن الوسطى هي كاملة بشكل واضح.
      5. إغلاق شقوق الجلد مع خياطة الجراحية 5-0 الحرير ونظيفة كما هو موضح في 4.3.1.7.
      6. ضع الماوس على جانبها الآخر، وأوبراأكل الأذن المقابل (الخطوات 4.3.2.1 ل4.3.2.5).
4. الحفاظ على الماوس على وسادة التدفئة حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
5. مراقبة حالة الجسم والنشاط ووجود علامات الألم أو التوتر. تقديم المسكنات إذا لزم الأمر (أي البوبرينورفين 0.05 مغ / كغ، كاربروفين 5-10 ملغ / كلغ). مراجعة الجروح يوميا وإزالة الإغلاق الجلد 7-14 أيام بعد العمل الجراحي بعد التحقق من أن الجرح قد تلتئم.

5. المورفولوجية تقييم القوقعة التهندس الخلوي

1. الموت ببطء الماوس في نهاية التجربة (في هذا العمل 28 يوما postmicrosurgery)، مع جرعة زائدة بنتوباربيتال داخل الصفاق (100 ملغ / كلغ) لدراسة الآثار طويلة المدى لعملية جراحية.
2. إجراء نضح transcardial مع البرد 0.1 M الفوسفات مخزنة-المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.5، تليها 4٪ (وزن / V) بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1 م برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.5 كما وصفها ^26.
   تنبيه: لامتصاص العرق شديد السمية. تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. تجنب استنشاق مسحوق خلال قياس وإعداد.
3. استخدام مجهر تشريحي لتشريح خارج الأذن الداخلية من العظم الصدغي كما هو موضح ^{34 و 35} دون فصل الدهليزي ومكونات القوقعة في الأذن الداخلية.
4. إصلاح الأذن الداخلية معزولة مع 4٪ (وزن / حجم) PFA في 0.1 M PBS، ودرجة الحموضة 7.5 في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة مع الهز لطيف. غسل 3X لمدة 5 دقائق مع 0.1 M PBS، ودرجة الحموضة 7.5.
5. يزيل الكلس العينات مع ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل بنسبة 10٪ (EDTA) التي أعدت في 0.1 M PBS، ودرجة الحموضة 6.5 في 4 درجة مئوية لمدة 10 د مع الهز المستمر، وتغيير الحل EDTA كل 3 د.
6. عندما تكتسب قوقعة الاتساق لينة، وإزالة EDTA ويغسل 3X لمدة 5 دقائق مع 0.1 M PBS، ودرجة الحموضة 7.5، وايعشر اهتزاز في RT.
7. تضمين العينات في شمع البارافين كما هو موضح ³⁴ وجعل 7 ميكرون أقسام قوقعة سميكة موازية لعماد القوقعة.
8. لتقييم التهندس الخلوي القوقعة والأقسام وصمة عار مع haematoxylin ويوزين (H & E) ³⁰ واستخدام المجهر الضوئي وصله بجهاز كاميرا رقمية لالتقاط الصور مع 4X و20X العدسات.

6. القوقعة التعبير الجيني

1. تنظيف سطح العمل والأدوات الجراحية مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
2. الموت ببطء الماوس كما هو موضح في 5.1 وبسرعة تشريح خارج الأذن الداخلية من العظم الصدغي باستخدام المجهر. تزج الأذن الداخلية في وعاء زجاجي يحتوي على وحمض النووي الريبي (RNA) حامية وكاشف استقرار.
3. إزالة العظم الصخري المتبقية مع ملقط صائغ وفصل بلطف القوقعة من الدهليز باستخدام مقص العين فانا ^35.
4. transf فوراإيه القوقعة في أنبوب مل microcentrifuge 2 مع 80 ميكرولتر RNA حامية واستقرار الحل وتجميد الأنسجة عن طريق وضع أنبوب في الثلج الجاف. الحفاظ على عينات قوقعة في -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. عزل الحمض النووي الريبي القوقعة كما هو موضح ³⁵ وتحديد نوعيته وكميته طيفيا.
6. توليد [كدنا قوقعة من كميات متساوية من الحمض النووي الريبي مجموع الماوس باستخدام النسخ عدة التجارية العكسية.
7. أداء QRT-PCR لتضخيم الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين التكميلي (كدنا]) في ثلاث نسخ لقياس النصوص الجين ^{35 و 36.}
   ملاحظة: في هذا الموالية العمل والنصوص الجينات المضادة للالتهابات من Il1b، Il6، Tgfb1، Tnfa، Il10 وDusp1 تم قياس.
8. حساب نسب التعبير النسبية عن طريق تطبيع عتبة الهدف دورة نسخة (ط) مستويات للمتوسط ​​الحسابي لمستوى الجينات المرجعية والكمي النسبي تطبيعمجموعة مشكلة مستويات النص إلى المتوسط الحسابي للمجموعة تدريج ^37.

النتائج

سماع تم اختبارها من قبل ABR قبل وفي عدة مرات بعد الدقيقة لتقييم تأثير على وظيفة السمع (الشكل 1A). أجريت سجلات ABR تحت التخدير لتجنب الحركة والجهد الحيوانية المصنوعات اليدوية، وبالتالي تحسين استنساخ ال ^27. تدار البريتونى مجموعات الكيتامين أساس أو الأيزوفلورين inhalatory كانوا يعملون عادة لتخدير الحيوانات أثناء الاختبارات ABR. وتوفر تركيبة الكيتامين / زيلازين ل(2-3 دقيقة) الحث قصير المفعول ومستقرة، مرحلة الصيانة الآمنة أثناء أداء سجلات ABR. وتجدر الإشارة إلى أن الأيزوفلورين يمكن أن تؤثر على حساسية قياس ABR ^38. لسجلات ABR، توضع الأقطاب الكهربائية تحت الجلد في أماكن معينة (الشكل 1B) ويتم قياس معاوقة. إذا كانت مقاومة هو 3 kOhm أو أعلى، القطب تحديد المواقع لابد من فحص لتجنب بديلإحداثها في ABR سعة الموجة.

يتم تنفيذ تسليم داخل الطبل في الفئران من قبل اثنين من إجراءات المجهرية (الشكل 2). تعرض الفقاعة خلال bullostomy ينطوي على التراجع من الغدد تحت الفك والعضلات ذات البطنين. ويتم هذا الإجراء من بحرص شديد لأن الشريان السباتي والعصب المبهم هي قريبة جدا (الشكل 2A). بعد ذلك، تم حفر الفقاعة في توطين الشريان الركابي والغشاء RW (الشكل 2B). لتجنب تكسير العظام، ويتم إجراء صغيرة الفتحة 0.5 ملم مع إبرة 27 G قبل الحفر. يتم توجيه G القسطرة 34 من خلال bullostomy نحو الغشاء RW وكمية صغيرة من السيارة وتسليمها على مكانة نافذة (الشكل 2C). يتم تنفيذ حقن بطريق غشاء الطبل من خلال شق في الجزء الرخو من الغشاء الطبلي مع إبرة 27 G؛ أكبر واحد يمكن أن تثير فيالأذن في الغشاء. قبل الحقن، نوصي إجراء شق إضافي في الموتر لبارس للسماح لتدفق الهواء أثناء الحقن المركبة (الشكل 2F). فمن الأهمية بمكان لتجنب تلف الشريان الركابي، وهو فرع من الشريان السباتي الداخلي، الذي من شأنه أن يؤدي إلى نزيف يهدد الحياة.

الفئران مع bullostomy أو بطريق غشاء الطبل جراحات الحفاظ على السمع في كافة مراحل التجربة، على غرار الضوابط غير تشغيلية (الشكل 3). لم عتبات ABR ردا على النقرات ورشقات نارية لهجة لم تتغير بشكل ملحوظ بعد جراحة مقارنة مع القيم الأساسية. لوحظ عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين bullostomy والنهج بطريق غشاء الطبل. أجريت الدراسات المورفولوجية لتأكيد تسليم السيارة الصحيح في الأذن الوسطى وتقييم التغييرات المحتملة الناجمة عن الإجراءات في التهندس الخلوي القوقعة. أيا من أهم قوقعة المناطق الصورةقدمت howed التعديلات الشكلية والحيوانات من كل الإجراءات التشكل مماثلة من جميع الهياكل قوقعة (الشكل 4A). وبالإضافة إلى ذلك، تم دراسة أيضا لمحات قوقعة للتعبير الجين السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات. وعلى الرغم من عدم وجود اختلافات وظيفية في البيانات ABR بين الإجراءين، تسبب bullostomy استجابة التهابية أقوى من نهج بطريق غشاء الطبل (الشكل 4B).

الشكل 1. تصميم التجارب وتقييم السمع. (A) رسم تخطيطي لإجراء التجارب. تم تقييم السمع مع ABR قبل وبعد جراحة. وقد تم الحصول على عينات من قوقعة بعد 28 يوما المجهرية. (B) الماوس تخدير في موقف المعرضة أكثر من لوحة التدفئة داخل غرفة-تخفيف الصوت، مع electrod تحت الجلدوفاق وضعها في فروة الرأس بين الأذنين على قمة الجمجمة (نشط، سواء كان إيجابيا)؛ في المنطقة النكفية تحت الصيوان (إشارة، سلبية) وفي الظهر (الأرض). يتم وضع مكبرات الساحة خالية على مسافة ثابتة (5 سم) التي تواجه الأذن اليمنى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. المجهرية للمركبة التطبيق. (أ) عرض بطني من الفقاعة الطبلية. يتم تنفيذ bullostomy الذيلية إلى العصب الوجهي مع إبرة 27 G. (ب) RWN والشريان الركابي يمكن ملاحظتها من خلال ثقب. يتم توجيه (C) ومجموعة القسطرة 34 من خلال bullostomy نحو محراب RW. (D) بعد شهر من bullostomy، وعظمي صغيرندبة موجودة في الموقع افتتاح (رأس السهم). (E) عرض جانبي الأذن، والتي تبين شق في قناة الأذن الخارجية والغشاء الطبلي (مربع). (F) التفاصيل من الغشاء الطبلي. وقدم ثقب في الربع العلوي الذيلية من الغشاء الطبلي باستخدام 27 إبرة G (النجمة السوداء، في الجزء الرخو)؛ تم حقن من خلال هذا الثقب باستخدام القسطرة 34 G. تم إجراء ثقب إضافي في الربع أدنى الجمجمة من الغشاء (النجمة البيضاء، في الموتر لبارس) قبل الحقن لتحقيق التوازن في الضغط الطبلي. (G) عرض لمجموعة القسطرة 34 من خلال ثقب في الغشاء الطبلي. (H) عرض من قوقعة المنطقة 24 ساعة بعد الجراحة المجهرية. شغل RWN مع حل السيارة (النجمة). اللات، الوحشي، رو، منقاري. القيام به، الظهرية. أماه، المطرقة، شارك، القوقعة. النساجون الشرقيون، نافذة البيضاوي. RWN، جولة نافذة المتخصصة. الحانات النطاق = 200 ميكرون في A، D، F، الحانات النطاق = 100 ميكرون في B، C، H، على نطاق والحانات = 1000 ميكرون في E، G. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. تقييم السمع. تطور عتبات ABR (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، في ديسيبل SPL) استجابة للنقر (A) وانفجار لهجة (ب) المحفزات، قبل و 7 و 14 و 28 يوما بعد الجراحة الصغرى في الذكور البالغ من العمر ثمانية أسابيع C57BL / 6J الفئران. Bullostomy (البرتقالي، ن = 11)؛ حقن بطريق غشاء الطبل (الأزرق، ن = 6)؛ غير تديرها (رمادي، ن = 11)، يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

JPG "/>
الشكل 4. القوقعة الصرف وتحليل التعبير الجيني. (A) مورفولوجية الهياكل قوقعة الرئيسية في قاعدة القوقعة. تلطيخ Haematoxilin يوزين من أقسام منتصف modiolar البارافين (7 ميكرون)، من آذان من الفئران غير تشغيلية، والفئران بعد شهر واحد تدخل المجهرية التي كتبها bullostomy أو حقن بطريق غشاء الطبل. مقصورة سائل الإعلام سكالا (أ، ب، ج) تقدم جميع المكونات الرئيسية. وترد تفاصيل كل من هذه الهياكل (الخانات) في صور لاحقة: العقدة الحلزونية (1)، جهاز كورتي (2)، الرباط الحلزوني (3) وعائي السطر (4). خلية الشعر الداخلية (النجمة). خلايا الشعر الخارجي (رأس السهم). الحانات النطاق = 100 ميكرون في أ، ب، ج، الحانات النطاق = 50 ميكرون في-1،2،3،4. (ب) التعبير قوقعة من علامات للالتهابات 28 د بعد جراحة. مقارنة بين bullostomy (برتقالي)، والحقن بطريق غشاء الطبل (الأزرق) والفئران غير تشغيلية (أبيض). *: تعمل غير مقابلجماعات تعمل. ^: المقارنة بين مجموعات تعمل. وتتمثل مستويات التعبير الجيني ك 2 ^{- ΔΔCt،} أو قدم ن أضعاف الفرق بالنسبة لgroup.Values غير مشغلة ويعني ± SEM من يثلث من عينات مجموعة من 3 الفئران في كل حالة. الدلالة الإحصائية: ** ص ≤0.01. *** ع ≤0.001. ^{^^} ص ≤0.01. ^^^ ص ≤0.001. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تسليم المخدرات المحليين إلى الأذن الداخلية يمكن أن يتم مباشرة عن طريق الحقن intracochlear أو غير مباشر من قبل الإدارة داخل الطبلة، ووضع الدواء في الأذن الوسطى ^{4، 19، 39.} إدارة Intracochlear يوفر التحكم وتوصيل الدواء الدقيق إلى القوقعة، وتجنب نشرها من خلال الأغشية النافذة،-القاعدية لقمية التدرجات تركيز والتخليص من خلال القناة السمعية. ومع ذلك، فإنه عادة ما يكون إجراء الغازية للغاية تتطلب جراحة معقدة وحساسة ^{7، 39.} في هذا السياق، وصناعة يتطور الجديدة، المغلفة، وزرع أجهزة لالمستدام الإفراج المخدرات ^{40 و 41.} من ناحية أخرى، والإدارة داخل الطبلة هو إجراء مينيملي والسهل القيام بها التي تسمح للحقن كميات أكبر من دالبساط في الأذن الوسطى، على الرغم من أن الدوائية ليست سهلة للسيطرة. يتم مسح معظم المخدرات عن طريق النفير وجزء المتبقية له على الانتشار عبر غشاء RW للوصول إلى القوقعة ^18. RW هو موقع امتصاص الحد الأقصى من المواد من الأذن الوسطى إلى طبلي قناة مليئة perilymph من القوقعة ^7. وهو نصف نافذ هيكل ثلاث طبقات، على الرغم من نفاذية لها تعتمد على خصائص المخدرات (الحجم، والتركيز، والذوبان والشحنة الكهربائية) وعلى أنظمة النقل عبر الغشاء (نشرها، النقل النشط أو البلعمة) ^42. نافذة بيضاوية وكبسولات الأذنية ومداخل بديلة ولكن أقل فعالية لالقوقعة ^{43 و 44.}

نحن هنا لشرح ومقارنة بين الطرق المجهرية لتسليم المستهدفة المخدرات في الماوس الأذن الوسطى: bullostomy وtranstympaإجراءات حقن شركة الاستثمارات الوطنية. الخطوات الحاسمة المشتركة بين هذه الإجراءات ما يلي: أ) تقييم السمع قبل وبعد الجراحة المجهرية، ب) إعداد الحل مركبة متجانسة تحت ظروف معقمة، ج) بالإشراف الدقيق على إجراء التخدير ومراقبة الحيوانات درجة حرارة الجسم والثوابت، والرابع ) وضع البطيء للحجم المناسب من المركبات التي تستهدف RW، والرابع) أخذ عينات قوقعة لاستكمال التحليل الجزيئي والصرفي.

وقد وصفت النهج خلف الأذن وبطني لbullostomy ^{7، 45.} استخدمنا تقريب بطني لأنه في تجربتنا أنه أدى في أقل معدلات الاعتلال وقدمت وصول أفضل إلى RW ^46. تتم الحقن بطريق غشاء الطبل عادة من خلال بارس الموتر من الغشاء الطبلي، الأمامي أو الخلفي للالمقبض المطرقة ^12. فيهذا العمل أجرينا تعديلا لهذه التقنية، وحقنة من خلال الرخو بارس خارج المطرقة مع ثقب إضافي السابق للالموتر بارس للسماح إخلاء الهواء أثناء الحقن.

كان حقن بطريق غشاء الطبل أقل الغازية من bullostomy، على الرغم من أن كلا microsurgeries كانت السريع (20 و 5 دقائق في الأذن لbullostomy ونهج بطريق غشاء الطبل على التوالي)، مع أوقات الاستجمام بعد الجراحة قصيرة ولا الاعتلال. الأهم من ذلك، حافظت كل من إجراءات الاستماع وكانت المعلمات ABR مماثلة لتلك التي تقرر قبل المجهرية. يأخذ نهج بطريق غشاء الطبل وقتا أقل من bullostomy ويمكن أن يؤديها في كلتا الأذنين من نفس الحيوان خلال نفس التدخل. مزايا حقن بطريق غشاء الطبل وبالتالي أنه لا يمكن أن يؤديها على المستوى الثنائي والمتكررة، إذا لزم الأمر. من ناحية أخرى، يوفر bullostomy الوصول البصري المباشر لغشاء RW، وتتيح للfilliنانوغرام من مكانة RW. في المقابل، حقن بطريق غشاء الطبل لا يسمح للسيطرة على وضع السيارة في محراب RW.

تصف الإجراءات التي أعلن عنها في هذا العمل كيفية إجراء تسليم السيارة المخدرات المحليين إلى الأذن الوسطى لتطبيقات ما قبل السريرية مثل تقييم تسميم أذني وتقييم فعالية في فقدان السمع. ووصف اثنان من الإجراءات المجهرية التي توفر طرق بديلة منها مزايا وعيوب محددة. كلا حفاظ على السمع ولا يؤدي إلى تغييرات شكلية. يوصف التهاب موضعي نتيجة مضاعفات محتملة من bullostomy. وصفت مجموعة من التقنيات التكميلية أيضا عن الإجراءات بعد الجراحة، بما في ذلك السمع والتقييمات التعبير علامة المورفولوجية والتهابات. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنيات لتقييم ما قبل السريرية لعلاجات جديدة لفقدان السمع، بما في ذلك النهج الوراثية الخلوية والدوائية، في النماذج الحيوانية. داخل الطبل administratأيونات ضمان وصول العلاج في الأذن الوسطى، في اتصال مع الغشاء النافذة المستديرة، وتسهيل مرور في perilymph دون الضرر القوقعة واضح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكيتامين (Imalgene)	Merial	# 2529	تنبيه: تجنب ملامسة الدواء للجلد أو العينين أو الحقن الذاتية العرضية
Xylacine (Xilagesic)   ؛	Calier	# 6200025225
جل زيوت التشحيم للعين (مصطنع) Angelini		# 784710
مضخة مياه	Gaymar	# TP472
مطهر السطح	Jos & eacute ؛ Collado SA	# CR-36
أقطاب إبرة تحت الجلد	Spes Medica	# MN4013D10SM
Headstage منخفض المعاوقة  (RA4LI)	تاكر ديفيس تكنولوجيز
(مكبر صوت مغناطيسي متعدد المجالات MF1)	تاكر ديفيس تكنولوجيز
3 محطة عمل محتملة استثارت	تقنيات تاكر ديفيس		يتكون النظام من: معالج RP2 ، محطة قاعدة RA16 ، مخفف PA5 ، مضخم SA1 ، مضخم ميكروفون MA3 ، مسرح مقاومة RA4LI ومكبر للصوت المسبق RA4A medusa   ؛
برنامج SigGenRP	Tucker-Davis Technologies
منصات الاحترار (منصات TP)	Gaymar	# TP3E
Statistics software (SPSS)IBM
Chitosan (deacetylated)	Sigma-Aldrich	# C3646
حمض الخليك (الجليدي)	VWR	# 20103.295	تنبيه: سائل قابل للاشتعال وتآكل الجلد والجهاز التنفسي والجلد محسس
جليسيروفوسفات	سيجما	# SLBG3671V
رينجر حاد ؛ s لاكتات عازلة	براون	# 1520-ESP
ميديتوميدين (دومتور)	إستيف	# 02400190
فينتانيل (فينتانيست)	كيرن فارما	# 756650.2	تحذير:     تجنب ملامسة الدواء للجروح المفتوحة أو الحقن الذاتية العرضية
Isoflurane (IsoVet)	Braun	# 469860	تنبيه: تجنب التعرض بتركيزات سقف أكبر من 2 جزء في المليون من أي عامل تخدير مهلجنة على مدى فترة أخذ العينات لا تتجاوز 1 ساعة.
المجهر الجراحي (OPMI pico)	ستارة زايس
معقمة (Foliodrape)	Hartmann	# 277546
Sterilizer	أدوات العلوم الدقيقة	# 18000-45
شفرة مشرط	سوان مورتون	# 0205	تحذير
مقبض مشرط	أدوات العلوم الدقيقة	# 91003-12
مطهر قائم على اليود بوفيدون (بيتادين)	ميدا فارما SAU	# M-12207
مقص Adventitia (SAS18-R8)	S & T	# 12075-12
مقص منحني	سم أداة	# AJ023-18
ملقط	CM أداة	# BB019-18
إسفنجة جيلاتين (Spongostan)	ProNaMAc	# MS0001
Microlance 27 G	Becton Dickinson	# 302200
حقنة ميكرولتر (701 RN SYR)	هاميلتون	# 80330
القسطرة (Microfil 34 G)	World Precision Instruments	# MF34G-5
لاصق الأنسجة (Vetbond)	حامل إبرة 3M	# 1469SB
(حامل إبرة مقبض دائري)   ;	أدوات العلوم الجميلة	# 12075-12
خياطة جراحية من الحرير (حرير مضفر 5/0)	أراغو	# 990011
كلورهيكسيدين (كريستالمينا)	سالفات	# 787341
Pentobarbital  (دوليتال)	Ventoquinol	# VET00040	الحذر:     تجنب ملامسة الدواء مع الجروح المفتوحة أو الحقن الذاتية العرضية
المجهر المجسم (لايكا)	أدوات ماير	# MZ75
Vannas Micro-dissecting (العين) مقص عمل الربيع	هارفارد	جهاز # 28483
صائغ ملقط s (Dumont)	أدوات العلوم الدقيقة	# 11252-00
محلول إزالة التلوث RNase  (RNaseZap)	Sigma-Aldrich	# R2020
حل تثبيت الحمض النووي الريبي  (الحمض النووي الريبي)	طقم الحمض النووي الريبي للتنقية من Thermo Fisher	Scientific # R0901
(RNeasy)	Qiagen	# 74104
(كدنا) طقم النسخ العكسي	للحرارة فيشر العلمي	# 4368814
مقايسة التعبير الجيني (مجسات TaqMan)	ثيرمو فيشر العلمي	Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 dusp1: Mm00457274_g1 hprt1: Mm00446968_m1
نظام PCR في الوقت الحقيقي (7900HT) الأنظمة	الحيوية	التطبيقية # 4329001
بارافورمالدهايد (PFA)	Merck	# 1040051000	سامة: PFA هو إمكانات   ؛ مادة مسرطنة
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	Merck	# 405491	تنبيه:   ضار إذا تم استنشاقه ، وقد يتسبب في تلف الجهاز التنفسي من خلال التعرض لفترات طويلة أو متكررة في حالة استنشاق .
محلول الهيماتوكسيلين	سيجما ألدريتش	# HHS16
Eosin Y	سيجما ألدريتش	# E4382	المخاطر: يسبب تهيجا خطيرا للعين