يصف هذا البروتوكول تحريض نموذج نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) على الجلد الأذن الماوس باستخدام المغناطيس لقط. باستخدام نموذج التصوير حيوي داخلي مبنية خصيصا، ندرس في الاستجابات الالتهابية الجسم الحي بعد ضخه. الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية هو توسيع نطاق فهم كيفية استجابة الكريات البيض إلى إصابة الأشعة تحت الحمراء الجلد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حمل إصابة نقص التروية ضخه في الجلد الأذن ماوس لحيوي داخلي Multiphoton التصوير من الاستجابات المناعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحدث إصابة
إصابة التروية (IRI) عندما يكون هناك نقص الأكسجة العابر بسبب إعاقة تدفق الدم (نقص التروية) متبوعا بإعادة أكسجة الأنسجة اللاحقة (إعادة التروية). في الجلد ، يعد نقص تروية التروية (IR) العامل الرئيسي المساهم في الفيزيولوجيا المرضية لتقرحات الضغط. في حين أن سلسلة الأحداث التي أدت إلى الاستجابة الالتهابية قد تمت دراستها جيدا ، فإن الاستجابات المكانية والزمانية للمجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا المناعية لإصابة الأشعة تحت الحمراء ليست مفهومة جيدا. النماذج الحالية للأشعة تحت الحمراء التي تستخدم تقنية التثبيت على جناح الجلد شديدة التوغل وغير مناسبة لدراسة الاستجابات المناعية للإصابة ، في حين أن دراسات لقط المغناطيس غير الغازية المماثلة في جناح الجلد أقل من مثالية لدراسات التصوير داخل الحيوية. في هذا البروتوكول ، نصف نموذجا قويا للأشعة تحت الحمراء غير الغازية تم تطويره على جلد أذن الفأر ، حيث نهدف إلى تصور الاستجابة الخلوية للخلايا المناعية في الوقت الفعلي بعد إعادة التروية عبر التصوير متعدد الفوتون داخل الحياة (MP-IVM).
المقدمة
تحدث إصابة نقص التروية ضخه (IRI) عندما يكون هناك نقص الأكسجة عابرة بسبب انسداد تدفق الدم (نقص التروية)، يليه إعادة الأوكسجين اللاحق للأنسجة (ضخه). في الجلد، ويعتقد أن نقص التروية ضخه (IR) ليكون واحدا من العوامل التي تسهم في الفيزيولوجيا المرضية لقرحة الضغط، حيث الراحة في الفراش لفترات طويلة يهيئ المرضى في المستشفيات على المدى الطويل للإصابة. في هؤلاء المرضى، ويتعرض كل من الجلد والعضلات الأساسية باستمرار للضغط الوزن المبذولة على مناطق من بروز عظمي، مما أدى إلى وقوع إصابات المترجمة التي، إذا ما تركت دون علاج، يمكن أن تصبح نخرية 1.
الأضرار تشارك في المعهد الجمهوري الدولي ذات شقين. خلال نقص التروية، وانسداد الأوعية الدموية يؤدي إلى انخفاض حاد في وصول الأكسجين إلى الأنسجة. وهذا يؤدي إلى انخفاض ATP ودرجة الحموضة، والذي يعطل ATPases تشارك في الأيض الخلوي. بدوره، مستويات الكالسيوم الخلوية السنبلة، وأكدت أو ألحقت أضرارا جملتعلمي اللغة اإلنكليزية الخضوع موت الخلايا المبرمج أو نخر 2. الافراج عن محتويات الخلايا أو الضرر المرتبطة أنماط الجزيئية (الخام)، مثل HMGB1، ويسهم في الاستجابة الالتهابية 3. وتحدث هذه الإهانة الثانية خلال ضخه. على الرغم من أن تتم استعادة مستويات الأوكسجين ودرجة الحموضة أثناء ضخه، وهذا يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الأمر الذي يؤدي إلى أكسدة الدهون داخل الخلايا، والحمض النووي، والبروتينات. ونتيجة لذلك، يتم تنشيط وسطاء الموالية للالتهابات، والذي ينطلق من الاستجابة الالتهابية الثانوية ينطوي على تجنيد الخلايا المناعية لموقع التهابات 2. في حين أن سلسلة من الأحداث البيوكيميائية التي أدت إلى استجابة التهابية وصفت بشكل جيد، والتنظيم المكاني والزماني للأنشطة الخلايا المناعية ليست مفهومة جيدا.
هنا، نحن تصف نموذج IR قوي على الجلد الماوس الأذن باستخدام بسيط المغناطيس لقط. إلى جانب التصوير multiphoton حيوي داخلي (MP-IVM)، ونحنأقامت نموذجا للدراسة في الجسم الحي الاستجابات الالتهابية التي تحدث بعد يأخذ ضخه مكان. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو محاولة لفهم كيفية استجابة كل من خلايا الخلالية والتسلل إلى الأشعة تحت الحمراء في الوقت الحقيقي.
النماذج الحالية من الأشعة تحت الحمراء باستخدام تقنية تحامل على الجناح الجلد هي الغازية للغاية، كما أنها تتطلب زرع جراحيا من ألواح الصلب في الجهة الجلد، مما يجعلها أقل من مثالية للدراسات المناعية 4. وقد وصفت تقنية تحامل غير الغازية مماثلة في 5،6 الماوس الجلد الجناح. ومع ذلك، بسبب إدراج عنصر التصوير حيوي داخلي في هذه الطريقة، ونحن بدلا من ذلك اختارت الجلد الأذن كموقع الأشعة تحت الحمراء المستهدفة، كما تلتف الحركات بسبب التنفس ويوفر الاستقرار أثناء التصوير 7،8. وعلاوة على ذلك، مجموعات فرعية الكريات البيض التي تمتد الخلالي متطابقة بين الجلد الأذن والجهة الجلد، على الرغم من أنقد تختلف الأرقام والنسب قليلا 9. وبالتالي، يمثل الجلد الأذن موقع التصوير المثالي.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم البيانات التي تم استردادها من هذه النماذج IRI محدودة لتقييم العيانية (الدرجات من القرحة) والتحليلات المجهرية من نقطة النهاية مؤشرات التهابات 10. استخدام هذا النموذج، يتم تمكين الوقت الحقيقي التصور من الاستجابة الخلوية العدلات بعد ضخه في جلد الفأر مراسل الفلورسنت. ويستخدم نموذج التصوير الأذن حيوي داخلي نشرت سابقا 8 مع تعديلات إضافية (الشكلان 1 و 2).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت التجارب على التعامل مع الحيوانات الحية وفقا لكل استخدام الحيوانات ذات الصلة والمبادئ التوجيهية واللوائح الرعاية.
1. اختيار الفئران مراسل فلوري
- استخدام منذ 12 أسابيع 6- لLysM-EGFP 11 الفئران (أي تفضيل للذكور أو إناث).
ملاحظة: استخدام مختلف الفئران مراسل فلوري خلية محددة يمكن التصور من الخلايا المناعية المختلفة في الجسم الحي. في هذه السلالة، وتعميم العدلات (خلايا GFP مرحبا)، وتعميم حيدات (خلايا GFP لو)، والضامة عن طريق الجلد (خلايا GFP لو) يمكن تصور. مع المعلمات التصوير المستخدمة، وسيتم الكشف فقط إشارات مضيئة من العدلات GFP إيجابية.
ملاحظة: قائمة سلالات الفلورسنت مراسل الماوس المناعي خلايا محددة مناسبة لهذا النوع من الدراسة التصوير الجلد يمكن العثور عليها في المرجع 8.
ملاحظة: ينصح بشدة أن يتم استخدام الفئران البيضاء للتصوير، كما pigmenالفئران تيد هي أكثر عرضة للphotodamage. وذلك لأن الجلد المصطبغ الأذن هو أكثر من ذلك بكثير حساسية لالتنقيط التي يسببها الليزر (يدل على حرق الأنسجة). ونتيجة لذلك، التوظيف العدلة وتراكم يمكن ملاحظة حتى في حالة مستقرة 8،12. - الحفاظ على الفئران في (SPF) شروط معينة خالية من مسببات المرض مع دورات ضوء الظلام 12 ساعة.
2. الماوس التخدير
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين-زيلازين (8 ميكرولتر ز -1 وزن الجسم)، ويتألف من خليط من 15 ملغ مل -1 الكيتامين و 1 ملغ مل -1 زيلازين الذائبة في الماء المعقم.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الداخلي الإعداد. تحقق للتخدير كافية من خلال مراقبة غياب منعكس قرصة أخمص قدميه.
ملاحظة: بعد الساعة الأولى، سوف تحتاج جرعات الربع اللاحقة من مخدر على أن تدار تحت الجلد لد- تستمر لحوالي 0.5 ساعة لكل منهما. قد يشير إلى حركة الشوارب أو الذيل أيضا أن التخدير والخفوت، وأنه لا بد من زيادة الرصيد. - استخدام مواد التشحيم العيون على العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. إزالة الشعر
- تطبيق بعناية كريم مزيل الشعر إلى الأعلى ثلثي الأذن ظهري الماوس باستخدام أدوات تطبيقها القطن طرف.
- انتظر 2-3 دقائق قبل إزالة كريم باستخدام الرطب تطبيقها القطن غيض بطريقة شاملة ولكن لطيف.
ملاحظة: لا تسمح لكريم إزالة الشعر للبقاء على الأذن الماوس لفترة طويلة جدا، لأنها قد تحفز التهاب 13،14.
4. تحريض نقص التروية وضخه إصابة
- استخدام مطلية بالذهب، N42 الصف المغناطيس النيوديميوم، مم 12 × 2 مم، ومع تصنيف غاوس ما يقرب من 3000 للحث على نقص التروية في الجلد الماوس الأذن.
ملاحظة: في هذه الحالة، ووجه مدمل من المغناطيس DENOقسم التدريب والامتحانات شمال القطب. - فتحة المغناطيس إلى أدلة البلاستيك الفردية.
ملاحظة: دليل البلاستيك يعمل على تخفيف التنسيب وفصل مغناطيس عالية القوة. بسبب القوة المغناطيسية القوية بعد انخفاض المقاومة للكسر، لا تضع المغناطيس الفردية على مقربة من بعضها البعض أو المعادن الأخرى. قد يحدث الكسر وانشقاق إذا كانت سحب تجاه بعضهم البعض. - ضع الأول (الظهرية) المغناطيس بحيث فقط حافة على اتصال مع الثاني (بطني) المغناطيس (الشكل 3A)
ملاحظة: يمنع هذا المغناطيس من التقاط معا قبل أن يتم وضعه بشكل صحيح. - وضع كل من المغناطيس بحيث المغناطيس بطني شقة تقع على الأذن (الشكل 3A).
ملاحظة: قبل أن يتم الناجم عن نقص التروية، وضمان أن يتم الاحتفاظ الماوس عند 37 درجة مئوية، ويتم الحفاظ على التخدير الكافي (راجع الخطوة 2.2). - مرة واحدة على استعداد، دعونا بعناية المغناطيس معا (الشكل 3A ).
ملاحظة: لأغراض التصوير، المشبك نصف فقط من الأذن بحيث الأشعة تحت الحمراء والمنطقة غير الأشعة تحت الحمراء ويمكن ملاحظة. - بعد 1.5 ساعة من نقص التروية، وإزالة المغناطيس قبل التواء المغناطيس بعيدا عن بعضها البعض باستخدام أدلة البلاستيكية، والسماح ضخه لتأخذ مكان.
يجب توخي الحذر لمنع الآذان من التجعيد عندما يتم وضع مغناطيس: مذكرة. نقص التروية ناقصة واضح إذا كانت الأوعية الدموية الرئيسية واضحة ظاهريا على اعادة يروي فورا (أي الدم يملأ السفن فورا) بعد إزالة المغناطيس. على الرغم من أن لا يحدث ضخه مباشرة بعد إزالة المغناطيس، وانسداد الأوعية الدموية عابرة فقط. على هذا النحو، لا بد من إعداد الأذن الماوس لتصوير بأسرع وقت ممكن.
5. حقن من وكلاء وصفها الأوعية الدموية
- مباشرة بعد إزالة المغناطيس وإدارة عن طريق الوريد (عبر الرجعية المداري أو ذيل حقن الوريد) ايفانز الأزرق (10 ملغ مل -1في برنامج تلفزيوني أو المالحة. 1 ميكرولتر ز -1 وزن الجسم) أو آخر الأوعية الدموية وصفها وكيل الاختيار.
ملاحظة: قبل الحقن، وضمان لا تزال تحتفظ أن التخدير الكافي من أداء طيف معسر أخمص قدميه.
6. موضع الأذن على منصة التصوير
- قطع 2 قطعة من الشريط اللاصق 1.5 سم في الطول و 1.8 سم في العرض.
- السماح للالجانبين لاصقة لتلتصق ببعضها البعض مع ترك حوالي 1 ملم من مادة لاصقة على طول عرضه.
- قطع الشريط اللاصق في اثنين، بالطول، لاستيعاب وضعها داخل شق على منصة الأذن.
- إدراج هذه اخفاء الشريط حول منتصف الطريق من خلال فتحة، مثل أن الجانب اللاصق يواجه عقوبة تصل.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة، بحيث الأذن للتصوير بجوار الشريط اخفاء الشريط.
- باستخدام اثنين مبلل برنامج تلفزيوني تطبيقها القطن طرف، اضغط بلطف الأذن ضد شريط لاصق.
- استخدام الشريط كدليل، وجلب الأذن الماوسمن خلال شق في حين ضبط في وقت واحد الماوس أقرب نحو المرحلة.
- لإزالة شريط لاصق، لأول مرة إضافة قطرة من برنامج تلفزيوني للحد من الإلتصاق من الشريط.
- فصل الأذن الماوس من اخفاء الشريط بلطف ممكن باستخدام الفرشاة الجميلة.
- تتسطح الأذن ضد منصة الأذن من قبل المتداول بلطف قضيب من القطن طرف رطبة على الأذن.
- وضعت قطرة من برنامج تلفزيوني تحت ساترة (والتي يتم الاحتفاظ بها في الموقف على حامل ساترة باستخدام الشحوم، الشكل 2) وبلطف وضعه على الأذن. أعلى حتى مع أكثر PBS إذا لزم الأمر.
ملاحظة: حامل ساترة يزيد من الاستقرار أثناء التصوير. - إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم وتوصيل الأسلاك إلى نظام التدفئة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: ضبط درجة الحرارة لوحة التدفئة الجسم إلى 37 درجة مئوية، والأذن منصة المسرح إلى 35 درجة مئوية.
7. Multiphoton مجهر مجموعةيصل والتصوير معلمات
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول شعاع واحد، multiphoton المجهر مع الانضباطي (680 - 1080 نانومتر) تي: سا الليزر (3.3 W في 800 نانومتر، ومدة النبضة 140 خ م، و 80 ميغاهيرتز معدل التكرار) مع هدف 20X المياه (NA = 1.0) للدراسات التصوير حيوي داخلي.
- فتح برامج التصوير.
- محاذاة الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ضبط الطول الموجي الإثارة إلى 950 نانومتر.
ملاحظة: GFP وايفانز الأزرق يمكن أن يكون سعيدا في وقت واحد في 950 نانومتر. - إلى المعاينة، واستخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون 2 scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، وتردد المسح الضوئي 800 هرتز في مسح سطر واحد. انقر على "معاينة".
- تبديل المخفف (ليزر) السلطة. التأكد من أن جميع الإشارات الأساسية يتم انتقاؤها من دون تعريض مجال التصوير لكميات كبيرة من الطاقة ليزر، التي ربما تتسبب في ضرر الحرارة.
ملاحظة: تبدأ في قوة المخفف منخفضة وزيادة إذا كانت الاشاراتل قاتمة. كما العدلات سيكون غائبا عن الخلالي في وقت مبكر يشير بعد ضخه، ويمكن استخدام الضامة كمقياس لتحديد السلطة الحد الأدنى المطلوب، كما في السابق هي باهتة من العدلات.
ملاحظة: إذا كانت هذه الخطوة ينبغي القيام به لأول مرة، وضبط الإعدادات في منطقة غير الدماغية، حيث من المتوقع سلامة الأوعية الدموية سليمة وسيسهل وضع قوة المخفف. في تجارب لاحقة، هذه الإعدادات لا تتطلب الكثير من التعديل ما لم تكن قوة الليزر غير مستقرة. - ضبط إعدادات PMT.
ملاحظة: تحقق مع الشركة المصنعة للالأقصى الأمثل الجهد مكسب للPMT. ووضع التيار الكهربائي PMT خارج العتبة الموصى بها يؤدي إلى ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. التوصية العامة هي لضبط الجهد الربح PMT إلى عتبة الموصى بها لزيادة القوة المخفف عند الضرورة ينبغي أن تكون إشارة خافت جدا. - تحديد منطقة التصوير التي هي على مقربة منعلى حافة نقص التروية، والتي تتميز الهائل ايفانز تسرب الأزرق.
- جمع GFP وايفانز إشارات الزرقاء باستخدام 525/50 ممر الموجة (BP) و655/40 المرشحات BP، على التوالي. لتوليد التوافقي (SHG) إشارات الثانية من ألياف الكولاجين داخل مقصورة الجلدية، واستخدام 475/42 مرشح BP.
- إنشاء مجلد لحفظ الصور في تنسيق متوافق للبرمجيات تحليل الصور المتاحة.
- في اكتساب جنسيتها أو استخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون 2 scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، ومسح تردد 400 هرتز في مسح سطر واحد.
- 100 ميكرون ض المكدس مع حجم خطوة من 4 ميكرون يمكن الحصول عليها مرارا وتكرارا على مر الزمن، في 1 فترات دقيقة، لرصد العدلات تسلل.
ملاحظة: وخاصة بالنسبة للالكريات البيض (على سبيل المثال، العدلات) مع سرعة المهاجرة أعلى، وهي فترة أطول من 1 دقيقة قد يؤدي الى صعوبات خلال تحليل تتبع الخلية. في هذه الحالة، يمكن للمستخدم إما أن تخفف من سماكة ميلانquisition كومة أو زيادة وتيرة المسح الضوئي.
ملاحظة: على الرغم من كومة اكتساب المطلوبة المنطقة الدماغية قد تظهر أصغر نتيجة للضغط (تتميز بدلا من شدة مجموعات المساعدة الذاتية أعلى)، وضخه بعد ذلك التاريخ التهاب الهائل الذي يتسبب في الأذن وارما. ومن المتوقع الانجرافات كبيرة في Z-الاتجاه. على هذا النحو، واقتناء كبير ض المكدس ضروري لاستيعاب الانجراف. - في جميع أنحاء التصوير، أعلى حتى من برنامج تلفزيوني والماء بانتظام للحفاظ على الأذن رطبة والعدسة الشيئية مغمورة في الماء.
ملاحظة: تجربة نموذجية عادة ما يستمر لمدة 2-4 ساعات. اعتمادا على التصميم التجريبي، وإلى جانب وجود نظام التخدير تسيطر عليها بشكل جيد، تمديد مدة التصوير غير ممكن.
8. إنهاء التجربة
- الموت ببطء الماوس خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون وفقا لمؤسسة لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم (IACUC) العلاقات العامةocedures.
ملاحظة: الموت ببطء دائما الماوس عن طريق الطرق المعتمدة على النحو الذي تحدده المؤسسة القواعد والأنظمة، والمبادئ التوجيهية. إذا كانت هناك حاجة التصوير المتكررة، والحفاظ على الماوس على لوحة التسخين حتى ترتدي التخدير خارج. مرة واحدة على الفأرة استعاد وعيه كافية وغير المحمول، وعودة الماوس لقفصه.
تحليل 9. صورة
ملاحظة: البيانات الناتجة عن تجربة التصوير يمكن تصور من قبل حزم البرمجيات المختلفة.
- فتح البرنامج تحليل التصوير.
- تحت فق الوضع، استيراد ملف (فتح → حدد أي ملف في المجلد المطلوب → اضغط على "فتح").
- تحرير الزائفة الألوان إذا لم يتم تطبيق الألوان الافتراضية (تعديل تحرير → عرض → تحت علامة التبويب قناة، حدد اللون المطلوب من لوحة الألوان).
- ضبط السطوع والتباين، والخلفية (تحرير → تعديل العرض → تبديل ماكس والقيم مين).
- تأكد من أن أبعاد الملف صحيحة (تحرير خصائص → → صورة تحت علامة التبويب الهندسة، والتحقق من حجم فوكسل في هذا البروتوكول، X = 0.99، Y = 0.99، وZ = 4).
ملحوظة: اشتقاق X و Y بقسمة البعد scanfield من قبل بيكسل. Z هو سمك بين كل شريحة.
ملاحظة: يمكن عرض إخراج هذه مجموعات البيانات كما القصوى الأفلام الإسقاط.
ملاحظة: مطلوب تحليل تتبع لتوصيف كامل الأنشطة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم وظيفتها في الجسم الحي. تعليمات مفصلة لتتبع الخلية باستخدام وظيفة بقعة المتاحة في البرنامج ويمكن العثور عليها في البروتوكول في مرجع 15.
ملاحظة: هناك العديد من الطرق لقياس الهجرة الكريات البيض، والتفاصيل التي يمكن العثور عليها في المادة مراجعة في مرجع 16.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يستخدم هذا البروتوكول الجلد الأذن منصة التصوير مبنية خصيصا، كما هو مبين في الشكل 1. العديد من الميزات من هذه المنصة تم تصميمها خصيصا لتسهيل التصوير مع الحفاظ على إعدادات الفسيولوجية. وضع الأذن على منصة النحاس ساخنة لا يحافظ فقط على الأذن عند درجة حرارة الفسيولوجية من 35 درجة مئوية، ولكن بل عزل الأذن من الحركات التي لا مفر منها بسبب التنفس. إضافة مشبك معدني على منصة النحاس يخلق فجوة لمنع حامل ساترة من ممارسة الوزن على الأذن، وبالتال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أهمية
الأشعة تحت الحمراء هي واحدة من الأسباب الرئيسية للقرحة الضغط الجلد. في المراحل المبكرة (الأول والثاني) من قرحة الضغط تصف حالة الجلد البشري (بالمقارنة مع الأنسجة تحت الجلد الكامنة والعضلات). ومع ذلك، فهم المسببات المناعية ما زالت ناقصة. هنا، نقدم نموذج IR بسيط وقوي على الماوس الجلد الأذن من أجل معالجة هذه الفجوة. نحن محاكاة نقص التروية قبل لقط الأذن الماوس بين اثنين من المغناطيس، وبعد دراسة الاستجابات المناعية ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر توماس جراف لتزويدنا بفئران LysM-eGFP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
Reagents< / strong> تروي فائق النقاء < td colspan = "4" ><قوي> معدات< / قوي>زجاج أهداف الأذن تعد Tools القصيرةبلاستيكي
الجينومي الجلد < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فئران سلالات < / strong> | |||
| Lysozyme-GFP C57BL / 6 | توماس جراف ، مركز التنظيم | ||
| C57BL / 6-C2J | مختبرات جاكسون | 000058 | يتم تهجينها مع Lysozyme-GFP لتوليد ألبينو Lysozyme-GFP لتصوير |
| PBS | |||
| Viaflex 0.9٪ (بالوزن / الحجم) محلول ملحي | F8B1323 | باكستر للرعاية الصحية | |
| كيتامين (100 مجم مل < sup> ناقص ؛ 1< / sup> هيدروكلوريد الكيتامين | بارنيل | كيتامين هو دواء خاضع للرقابة ويجب اتباع جميع اللوائح المحلية ذات الصلة | |
| Ilium Xylazil-20 (20 & nbsp; mg مل < سوب > ناقص ؛ 1< / sup> زيلازين هيدروكلوريد) | مختبرات | Xylazil-20 هو دواء خاضع للرقابة ويجب اتباع جميع اللوائح المحلية ذات الصلة. | |
| إيفانز الأزرق (10 mg مل < سوب > ناقص ؛ 1< / sup> في PBS أو محلول ملحي) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| ماء | |||
| حقنة الأنسولين مع إبرة | BD | 328838 | |
| نقل الماصات | Biologix Research | Company 30-0135 | |
| 3M شريط اخفاء الورق | 3M | 2214 | |
| غطاء مجهر Deckglaser (22 مم ومرات ؛ 32 مم) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| ملقط منشق منحني | Aesculap ، B. Braun Melsungen | BD312R | |
| كريم إزالة الشعر Veet | Reckitt Benckiser | ||
| أدوات تطبيق طبية ذات رؤوس | قطنية شركة Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| مناشف C-fold | Kimberly-Clark | 20311 | |
| مناديل مهمة دقيقة | Kimwipes Kimtech Science | 34155 | |
| مغناطيس نيوديميوم مطلي بالذهب من الدرجة N42 ، قطرها 12 مم وسماكة 2 مم & nbsp ؛ | first4magnets | F656S | |
| دليل بلاستيك ، 10 سم × 1.5 سم (مادة البولي فينيل كلوريد) | قابلة للطي من المنتصف بالطول ، وتربط بشريط لاصق ومغناطيس فتحة في | ||
| شحم عالي الفراغ | Dow Corning | ||
| <قوي>مجهر < / قوي> | |||
| TriM Scope II مجهر ثنائي الفوتون أحادي الشعاع | LaVision BioTec | ||
| قابل للضبط (680 – 1،080 نانومتر) حرباء متماسكة Ultra II One Box Ti: ليزر الياقوت (> 3.3 واط عند 800 نانومتر ؛ طول النبضة 140 fs ، معدل تكرار 80 ميجاهرتز) | متماسكة | ||
| للغمس بالماء (20 مرة ؛ NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| <قوي>مجموعات مرشح Miscroscope ومرايا (لتصوير GFP ، SHG ، Evans Blue) < / strong> | |||
| 495 | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 تمرير النطاق | Semrock | FF01-475 / 42-25 | |
| 525/50 تمرير النطاق | Chroma | ET525 / 50m | |
| 655/40 تمرير النطاق | Chroma | NC028647 | |
| <قوي>منصة مرحلة تصوير الجلد (راجع الرسم البياني للتجميع) < / قوي > | |||
| لوحة قاعدة معدنية (126 مم & مرات ؛ 126 مم & مرات ؛ 1 مم) | |||
| منصة نحاسية للأذن (79 مم ومرات ؛ 19 مم ؛ سمك 1 مم في الجانب ، سمك 0.5 مم في المنتصف ؛ <قوي > الشكل 1< / قوي >) مع شق (1.7 مم & مرات ؛ 1 مم ؛ 1.5 مم بعيدا عن الحافة الطويلة) كتلتان | |||
| بلاستيكيتان (ارتفاع 10 مم) و [مدش] ؛ للعزل | |||
| الحراري حامل منحني ، لوضع الثرمستور التحكم على منصة | |||
| كابل واجهة CC-28 مع موصل DIN والثرمستورات ، أحدهما للتحكم في درجة الحرارة والآخر لمراقبة درجة الحرارة | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | قم بتوصيل كابل الواجهة بكل من كتل السخان المقاومة المحددة عند 35 درجة ؛ كتل السخان المقاومة C |
| RH-2 | (Warner Instruments (جهاز هارفارد) | 640274 | يمكن لكتل السخان المقاومة تسخين منصة الأذن النحاسية حتى أكثر من 100 درجة ؛ ج في غضون دقائق. تأكد من تثبيت ثرمستور التحكم بشكل صحيح في الحامل لتجنب ارتفاع درجة الحرارة. |
| جهاز التحكم في درجة الحرارة TC-344B لمنصة الأذن | (Warner Instruments (جهاز هارفارد) | 640101 | |
| وحدة التحكم في درجة الحرارة TR-200 لوسادة تسخين الماوس | لم | الوحدة معروضة للبيع. اسأل الشركة المصنعة عن بدائل | |
| مصدر الطاقة ل TR-200 | Fine Science | 21051-00 | لم تعد الوحدة معروضة للبيع. اسأل الشركة المصنعة عن بدائل |
| لم تعد وحدة التدفئة Fine | Science | Tools 21060-00 | معروضة للبيع. اسأل الشركة المصنعة عن البدائل. |
| مسبار المستقيم الحيواني | أدوات العلوم الدقيقة | 21060-01 | الوحدة لم تعد معروضة للبيع. اسأل الشركة المصنعة عن البدائل. بعد توصيل مسبار المستقيم ووسادة التسخين بوحدة التحكم في درجة الحرارة TR-200 ، اضبط درجة الحرارة على 37 درجة ؛ C |
| <قوي>حامل غطاء < / قوي | |||
| >2 قضبان بلاستيكية ، قطرها 1 سم ، طول 10 سم | |||
| 1 محول بلاستيكي مع ثقوب محفورة لاستيعاب القضبان (راجع الرسم التخطيطي) | |||
| 3 مسامير شد بلاستيكية للحفاظ على قضبان بلاستيكية في مكانها | |||
| 1 صفيحة معدنية ، 6 سم × 2.5 سم ، مع قطع مربع 2 سم في نهاية واحدة ، حافة 2 مم بعيدا عن الحافة | |||
| 1 زوج من الصواميل والمسامير لربط الصفيحة المعدنية بقضيب | |||
| 1 قاعدة أكريليك (4 سم × 5 سم × 1.5 سم) مع مغناطيس لتثبيت حامل الغطاء على منصة مرحلة تصوير الجلد. 1 قضيب مثبت بشكل دائم على القاعدة. | |||
| <قوي>برنامج تحليل التصوير< / strong> | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
المراجع
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913(2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222(2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805(2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
