Method Article

تطوير نموذج متوجا اللب مباشرة لتقييم اللب الجروح وتشكيل إصلاحي العاج في الفئران

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة خطوة بخطوة لأداء اللب المباشر متوجا على أسنان الفئران لتقييم التئام الجروح اللبي وتشكيل العاج الترميمي في الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لب الأسنان هو عضو حيوي في السن محمي بالكامل بالمينا والعاج. عندما يتعرض اللب بسبب إصابات مسببة للتسوس أو علاجي المنشأ ، غالبا ما يتم تغطيته بمواد متوافقة حيويا من أجل تسريع التئام الجروح اللبية. الهدف النهائي هو تجديد العاج التعويضي ، وهو حاجز مادي يعمل ك "ختم بيولوجي" ويحمي أنسجة اللب الأساسية. على الرغم من أن إجراء تغطية اللب المباشر هذا قد استخدم منذ فترة طويلة في طب الأسنان ، إلا أن الآلية الجزيئية الأساسية لالتئام الجروح اللبية وتكوين العاج التعويضي لا تزال غير مفهومة جيدا. للحث على العاج التعويضي ، تم إجراء تغطية اللب تجريبيا في الكبيرة ، ولكن أقل من ذلك في الفئران ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب صغر أحجامها والصعوبات التقنية التي تلت ذلك. هنا ، نقدم طريقة مفصلة خطوة بخطوة لإجراء تغطية اللب في الفئران ، بما في ذلك تحضير تجويف يشبه الفئة الأولى ، ووضع مواد تغطية اللب ، وإجراء الترميم باستخدام مركب الأسنان. سيكون نموذج الفأر الذي يغطي اللب الخاص بنا مفيدا في التحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية لالتئام الجروح اللبية في سياق العاج التعويضي في الجسم الحي من خلال تمكين استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية المتوفرة على نطاق واسع في مجتمع البحث.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسوس الأسنان هو أحد أكثر أمراض الفم انتشارا والسبب الرئيسي للتدخلات الجراحية للأسنان لدى جميع الأفراد تقريبا1،2. يعتمد تشخيص التدخلات الجراحية وترميمات السن إلى حد كبير على استجابة اللب المناسبة والتئام الجروح بنجاح. في الواقع ، يؤدي تسوس الأسنان الذي يخترق بعمق المينا والعاج في كثير من الأحيان إلى تعرض أنسجة اللب الأساسية التي غالبا ما تكون "مغطاة بمواد طب الأسنان ، مثل هيدروكسيد الكالسيوم (Ca (OH) 2) أو أسمنت سيليكات الكالسيوم الهيدروليكي (HCSCs) ، بما في ذلك مجاميع ثالث أكسيد المعادن (MTA). الهدف النهائي من إجراء تغطية اللب هذا هو تسريع التئام الجروح اللبية عن طريق تجديد العاج التعويضي ، وهو حاجز مادي يعمل ك "ختم بيولوجي" لحماية أنسجة اللب الأساسية وزيادة متوسط العمر المتوقع للسن وصحة الفم بشكل عام. ومع ذلك ، فإن الآلية الأساسية لالتئام الجروح اللبية وتكوين العاج التعويضي ليست مفهومة تماما.

لفهم آليات التئام الجروح اللبية وتكوين العاج التعويضي في الجسم الحي بشكل أفضل ، تم استخدام العديد من سابقا ، بما في ذلك والخنازير3-5. من بينها ، تستخدم الفئران بشكل متكرر لأنها أصغر نسبيا في الأحجام مقارنة بالحيوانات الأخرى ، لكن أسنانها كبيرة بما يكفي لأداء تغطية اللب مباشرة دون أي صعوبات فنية6-10. هذه النماذج الحيوانية هي بدائل مثالية للدراسات البشرية لفحص الاستجابات اللبية وتكوين العاج الإصلاحي. ومع ذلك ، فإن استخدامها يقتصر على الدراسات القائمة على الملاحظة على المستوى الخلوي ، ونادرا ما توفر رؤى ميكانيكية أثناء تكوين العاج التعويضي على المستوى الجزيئي.

قدمت التطورات التقنية الحديثة في الهندسة الوراثية أدوات بحثية لا تقدر بثمن ولا غنى عنها - الفئران التي تؤوي جينا إما مفرط في التعبير عنه أو حذفه - والتي تعتبر مفيدة لدراسة الآليات الجزيئية للأمراض البشرية في الجسم الحي. تتزايد أعداد السلالات المختلفة من الفئران المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية التي يمكن تحفيزها بشكل استراتيجي بطريقة خاصة بالخلية باستمرار في المجتمع العلمي. لذلك ، فإن فحص التئام الجروح اللبية وتجديد العاج التعويضي في هذه الفئران سيساعد بشكل كبير في تسريع فهمنا لهذه العمليات على المستوى الجزيئي. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران مبلل بشكل كبير ، حيث أن إجراء عملية تغطية اللب على أسنان الفأر يمثل تحديا تقنيا نظرا لحجمها المصغر. هنا ، نقدم طريقتنا القابلة للتكرار لإجراء تغطية اللب المباشرة في الفئران لتقييم التئام الجروح اللبية وتكوين العاج التعويضي في الجسم الحي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم شراء الفئران من مختبر جاكسون والاحتفاظ بها في الحظيرة خالية من مسببات الأمراض في شعبة جامعة كاليفورنيا في مختبر الطب الحيواني (DLAM). وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وافقت لجنة البحوث الحيوانية المستشار (ARC # 2016-037).

1. ماوس التخدير

  1. استخدام البالغ من العمر ثمانية أسابيع الإناث الفئران C57 / BL6 (ن = 3).
  2. تخدير الفئران باستخدام الكيتامين (80-120 ملغم / كغم من وزن الفأر) / زيلازين حلول (5 ملغم / كغم من وزن الفأر) وإدارة البريتونى (الملكية الفكرية) بجرعة 10 مل / كغ.
  3. إعداد الكيتامين (80-120 ملغ / كلغ) / زيلازين (5 ملغ / كلغ) الحلول وإدارتها داخل الصفاق (IP) بجرعة 10 مل / كغ.
  4. تأكد من أن الفئران هي تخدير كامل عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميه.

2. إجراء متوجا اللب

  1. وضع صاحب الفم في فم الفأر.
  2. تأمين حامل الفم على الطاولة بحيث يكون هويواجه إعلان التصاعدي.
  3. وضع المجهر (10X) على الجزء العلوي من الفم حتى أن أول ضرس الفك العلوي مرئيا بالكامل.
  4. باستخدام ¼ الجولة بر في قبضة عالية السرعة في 200،000 دورة في الدقيقة، وإزالة جزء المينا للأسنان في منتصف حتى اللب مرئيا من خلال عاج شفاف. لا تعرض اللب مع بر.
  5. باستخدام رقم 15 اللبية K-ملف (قطر 150 ميكرون)، خرم من خلال العاج وفضح اللب.
    ملاحظة: عناية خاصة يجب أن تؤخذ بحيث لا يحصل دفع الحطام العاج الى اللب. ويمكن تجنب ذلك عن طريق تدوير ملف K ثلاثة أشهر ثم سحب K-ملف خارج.
  6. مزيج MTA مع H 2 O معقمة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تسليم ووضع MTA على اللب يتعرض مع طرف المستكشف. استخدام الجانب الخلفي من نقطة ورقة (غرامة) لحزمة MTA الى اللب كشفها بواسطة التنصت لطيف. الجانب سمكا من نقطة ورقة مسطحة، وبالتالي يسمحلالتكثيف السليم للMTA الى اللب عرضة للخطر.
  7. حفر السن عن 15 ثانية عن طريق وضع 35٪ منمش حمض الفوسفوريك حيث أنها تغطي فقط السن. عناية خاصة للحد من موضع منمش، لأنها قد تهيج أنسجة اللثة.
    ملاحظة: منمش يأتي في حقنة وتستخدم لتخشين أسطح الأسنان بحيث اللاصقة الأسنان يمكن أن تتدفق في التوسط الترابط الميكرو ميكانيكية على الأسنان. لأنها لزجة، ويمكن أن يكون من خلال تطبيق كميات صغيرة مباشرة على الأسنان مكتفية ذاتيا.
  8. استخدام الشفط السلبي لضغوط لإزالة منمش. استخدام بيليه القطن المشبع باستخفاف مع H 2 O لإزالة المخلفات من منمش. كرر هذه الخطوة حتى تتم إزالة منمش تماما من الأسنان.
  9. باستخدام خرقة الهواء المضغوط، يجف بلطف الأسنان.
  10. تطبيق المواد اللاصقة الأسنان باستخدام مساعدات من نقطة ورقة.
  11. جعل طبقة لاصقة رقيقة باستخدام الهواء المضغوط لمدة 3 ق.
  12. Cلدى عودتهم من المواد اللاصقة الأسنان لمدة 20 ق باستخدام وحدة المعالجة الخفيفة.
  13. وضع مركب flowable بكميات صغيرة على الأسنان الذي توج مع MTA. استخدام غيض من المستكشف في التدفق المركب في الأخاديد الأسنان.
  14. علاج مركب لمدة 30 ثانية باستخدام وحدة خفيفة علاج لبلمرة ذلك. تأكد من أن مركب يتم الشفاء الكامل والثابت باستخدام المستكشف.

3. بعد المرجع الرعاية

  1. إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) تحت الجلد (SC) على الفور بعد العملية متوجا اللب.
  2. وضع الفئران على وسادة التدفئة على الطاقة المنخفضة للحفاظ على الحيوانات دافئة قبل أن يستيقظ.
  3. عودة الفئران إلى الحظيرة للسكن.

4. الأنسجة المشتريات

  1. بعد 5-6 أسابيع، الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم تحت التخدير حالة كاملة مع isoflurane.
  2. إزالة بعناية الفك العلوي من قاعدة الجمجمة ووضعها في أنبوب 50 مل. إصلاح entirالبريد الفك العلوي يحتوي على كل من الأسنان المغطاة اللب والأسنان لم يسبق لهم اللعب المقابل في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، في 4 درجات مئوية خلال الليل، ومن ثم تخزينها في حل الإيثانول 70٪.
    ملاحظة: لامتصاص العرق غير سامة ومسرطنة. وينبغي رصد استخدام امتصاص العرق الصحيح على النحو المبين في إجراءات التشغيل القياسية (SOP).
  3. مسح لفك الماوس باستخدام الفحص μCT. لتأمين لفك خلال المسح الضوئي، والتفاف عينات بشاش غارقة مع 70٪ من الإيثانول ووضعها في أنبوب ثقافة الخلية 15 مل.

5. μCT الضوئي

  1. تحضير عينات للμCT المسح. لفترة وجيزة، والتفاف العينات بشاش غارقة مع 70٪ من الإيثانول وتأمينها في 15 مل أنبوب مخروطي ثقافة الخلية عام. تركيب أنبوب على خشبة المسرح المسح μCT، على النحو المبين في تعليمات الشركة الصانعة.
  2. تعيين مصدر الأشعة السينية إلى تيار 145 أمبير، والجهد من 55 KVP، ومدة التعرض من 200 مللي ثانية.
  3. أداء الحصول على الصور مع الماسح الضوئي μCT في قرار 20 ميكرون ومع آل مرشح 0.5 مم.
  4. إعادة بناء صورة وتصور ذلك (11).
  5. مرة واحدة الفحص μCT كاملة، بدء زوال الكلس مع 5٪ EDTA و 4٪ سكروز في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 2 أسابيع.

6. معالجة الأنسجة وتلطيخ

  1. تضمين الأنسجة decalcified في البارافين. قبل تضمين، وتقليم الفك العلوي عن طريق إجراء خفض السهمي الأمامي فورا إلى الرحى الأولى. في حين التضمين، ضع هذا السطح إلى الأسفل، بحيث المقطع الطولي للرحى الأول هو سطح القطع.
  2. باستخدام مبضع للفحص المجهري، وإعداد 5 ميكرون شرائح سميكة. وتتزامن هذه المناطق متوجا اللب عادة مع distopalatal (DP) الجذر، والتي يمكن استخدامها كمعلم. تحديد المنطقة التي تهم عن طريق فحص الأنسجة تحت المجهر الضوئي ومقارنة الصور μCT.
  3. لH & E تلطيخ، deparaffinize وترطيب الشرائح مع زيلين (2X) والايثانول المخفف متسلسل (100٪ ETOH 2X، 95٪ ETOH 2X، و 70٪ ETOH 1X).
  4. شطف الشرائح مع تشغيل ماء الصنبور.
  5. وصمة عار مع حل الهيماتوكسيلين لمدة 2.5 دقيقة ويشطف بماء الصنبور.
  6. تراجع الشرائح في الايثانول 95٪ لمدة 1 دقيقة.
  7. وصمة عار مع حل يوزين لمدة 1 دقيقة ويشطف بماء الصنبور.
  8. يذوى مع الإيثانول المخفف متسلسل (70٪ ETOH 1x، ل95٪ ETOH 2X، و 100٪ ETOH 3X) والزايلين (3X).
  9. جبل الشرائح مع تصاعد الحل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، أظهرنا الإجراءات خطوة بخطوة لأداء اللب متوجا على أسنان الفئران. أحد الجوانب الرئيسية من اللب السد في الفئران هو أن يكون الجهاز مناسبا. في هذا الصدد، وجود مجهر مع التكبير السلطة 10X من الضروري (الشكل 1A). لإنشاء إعداد الفئة I-تشبه في السن، كنا لدغ ¼ جولة في سرعة عالية الكهربائية قبضة في 200،000 دورة في الدقيقة (الشكل 1B). بدلا من ذلك، أي محركات أخرى، بما في ذلك تلك التي تستخدم الهواء المضغوط، ويمكن استخدامها لإ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاليا، هناك العديد من النماذج التجريبية المختلفة المتاحة للتحقق من صحة الآثار في الجسم الحي من مواد طب الأسنان، السقالات، أو عوامل النمو على التفرقة سني المنشأ من الخلايا الجذعية لب الأسنان (DPSCs) 13. وتشمل هذه النماذج زرع خارج الرحم ذاتي من DPSCs إلى الجهاز، مثل كبسولة الكلى، أو زرع تحت الجلد في الفئران DPSCs المناعة مع السقالات 14،15. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب محدودة في هذا الشأن سني المنشأ على DPSCs لا يتم تنفيذ في البيئة اللب مثلي. من ناحية أخرى...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل R01DE023348 (RHK) من NIDCR / المعاهد الوطنية للصحة والبحوث غرانت كلية (RHK) من مجلس البحوث في مجلس الشيوخ الأكاديمي لقسم لوس انجليس في جامعة كاليفورنيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BM-LED مجهر ستيريوMEIJI TechnoMicroscope 
أوبتيما MCX-LED Bien Air Dental1700588-001محرك محرك كهربائي
isofluraneHenry schein صحةNDC 11695-0500-2
1/4 جولة برBrasseler001092T0
Endodontic K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
نقطة ورقيةهنري شاين100-3941
Ultra-EtchUltradent Product Inc.نقش حمض الفوسفوريك
OptiBond SoloPlusKerr29669المواد اللاصقة
Coltolux LEDColtene / Whaledent Inc.C7970100115معالجة وحدة ضوء
التوصيف صبغةبيسكوT-14012مركب قابل للتدفق
SkyscanBreuker1275uCT ماسح
ضوئي ميكرومثيرموHM355Sميكروتوم
هيماتوكسيلين -1ثيرمو ساینتيك7221
إيوسين-وايحراري علمي7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16حل التركيب
شركة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles