تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

موت الخلايا المبرمج، أو ينظم موت الخلية ^1، يساهم بطريقة ضرورية لصيانة وتطوير الأنسجة. ينظر معظم ببساطة، تصاريح موت الخلايا المبرمج الذين تتراوح أعمارهم بين، التالفة، أو الخلايا الزائدة ليتم التخلص منها دون ضرر للأنسجة المحيطة ^2،3. مساهمة من موت الخلايا المبرمج للتوازن الأنسجة، مع ذلك، إلى حد كبير أكثر ديناميكية ومتنوعة. الخلايا الميتة بواسطة الخلايا تكتسب أنشطة جديدة متعددة، سواء يفرز والخلايا المرتبطة، والتي تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة ^4-10. الدراسات السابقة ركزت على قدرة خلايا أفكارك لقمع التهاب ^11-16، ولكن الخلايا أفكارك أيضا تعدل مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك أنشطة حيوية مثل بقاء ^4،9،10، وانتشار ^4،9،10، والتمايز ^17، الهجرة ^18، والنمو ^19. وعلاوة على ذلك، لا تقتصر هذه الآثار على البالعات المهنية، مثل بلعمالصورة، بل تمتد إلى جميع أنواع وسلالات الخلايا تقريبا، بما في ذلك الخلايا عادة غير البلعمية، مثل الظهارية والخلايا البطانية ^{7،9،10،18-21.}

استجابة محددة من الخلايا الحية المجاورة بعد التعرض لخلايا أفكارك تعتمد على عوامل متعددة تتعلق كلا من خلايا الاستجابة وقابلة للحياة الخلايا أفكارك أنفسهم. على سبيل المثال، على الرغم من أن التعرض للخلايا أفكارك يمنع انتشار كل الضامة الفئران والكلى القريبة الخلايا الظهارية أنبوبي (PTECs)، وهذه أنواع الخلايا اثنين تختلف بشكل كبير في استجابة بقائهم على قيد الحياة لخلايا أفكارك ^4،6،9،10. خلايا أفكارك تعزيز بقاء الضامة، ولكن تحفز وفاة أفكارك من PTECs ^4،6،9،10. تجدر الإشارة إلى أن استجابة لخلايا أفكارك قد تختلف حتى بين الاستجابة خلايا من نفس النسب، اعتمادا على الجهاز الخلية المجيب من أصل ¹⁰ (على سبيل المثال، PTECs الكلى مقابل الظهارية الثدييةخلايا) أو حالة تفعيل ²² (على سبيل المثال، العدلات). على العكس، قد الخلايا أفكارك تثير استجابات مختلفة في نفس الخلية تبعا لطبيعة أفكارك التحفيز ^10،23 أو مرحلة موت الخلايا المبرمج ^10،14.

ونظرا لdiverseness وتعقيد ردا على الخلايا أفكارك، يجب توخي الحرص الشديد في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. أولا، والاستجابات التي تتطلب التفاعل المادي المباشر بين خلايا قابلة للحياة وأفكارك يجب تفريقها عن تلك التي تسببها وسطاء للذوبان صدر أو الناتجة عن الخلية أفكارك ^3،6-10. إذا كان مطلوبا التفاعل الجسدي، ثم تمايز مزيد من يجب أن يتم تنفيذ. قد تعتمد يشير الأحداث على الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، بغض النظر عن ابتلاع لاحقة، أو على امتصاص أكلة، مستقلة عن مستقبلات معينة التي تربط الخلية أفكارك 3-7،9،10،19. في الحالة الأخيرة، فإن الاستجابة ليست محددة لخلايا أفكارك، ويمكن أن تنجم عن أي مواد أكلة ^4،6.

أهمية هذه الفروق يمكن مرة أخرى موضع تقدير من قبل المتناقضة ردود الضامة وPTECs الكلى. لكل أنواع الخلايا، والتعرض للخلايا أفكارك يغير من نشاط كيناز المؤيدة للبقاء AKT. تعديل يعتمد على التفاعل المادي، لأن الفصل بين الاستجابة والخلايا أفكارك عن طريق غشاء البولي 0.4 ميكرون يلغي استجابة ^{4،9،10،19.} ومع ذلك، فإن رد PTECs هي مستقبلات بوساطة ومستقلة البلعمة، بينما هو الدافع وراء رد الضامة التي كتبها البلعمة ^{4،9،10،19.} ومما يعزز هذا الاستنتاج من خلال حقيقة أن التعرض لحبات اللاتكس، حافزا أكلة محايد، ليس له أي تأثير على النشاط AKT في PTECs، ولكن يقلد تأثير خلايا أفكارك في الضامة ^4،9.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في PTECs الكلى قابلة للحياة من خلال الاعتراف بوساطة مستقبلات PTECs أفكارك المجاورة 9،10،19،25،26، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. الأهم من ذلك أن استخدام الخلايا أفكارك كحافز خلية يطرح بعض الصعوبات التجريبية الأصيلة غير موجودة مع بروابط القابلة للذوبان. وأهم هذه العناصر هو أن الخلايا أفكارك يجب إضافة وتعليق بدلا من أن تكون حلا. هذه الصعوبات، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تقريبا كل الأساليب المذكورة في البروتوكول هي واضحة وموحدة لزراعة الخلايا. وميزة هذا البروتوكول تكمن في اهتمامها إلى آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك تعدل نقل الإشارة داخل الخلايا الاستجابة. وتشمل هذه الآليات الربط عبر محددات السطح أو سد الجزيئات لمستقبلات معينة على إعادةsponding الخلية، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان، و / أو إشراك آلية البلعمة. يتم تضمين الخلايا الميتة في جميع التجارب للتأكد من أن النتائج هي محددة لطريقة موت الخلايا، وليس استجابة تعميمها على الخلايا الميتة. نهج دقيق، على النحو الموصى به في هذا البروتوكول، أمر بالغ الأهمية في فهمنا لتأثير توسيع أي وقت مضى أن الخلايا الميتة تمارس على جيرانهم الحية، سواء في الصحة والمرض.

1. التحضيرات

ملاحظة: في هذا البروتوكول، واثنين أو أكثر من خطوط الخلايا، أو الثقافات الخلية الأولية، يتم إعداد بشكل مستقل في ظل ظروف محددة. وتشمل هذه الاستعدادات الخلايا أفكارك (بروتوكول 1)، والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، والخلايا المستجيب صحية (بروتوكول 3). بعد إعداد مستقل، تضاف الخلايا أفكارك أو الميتة إلى خلايا المستجيب ويتم رصد ينتج عن ذلك من نقل الإشارة (بروتوكولات 4 و 5 و 6).

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافة، والكواشف
   1. إعداد 500 مل من مستنبت ألف (للاستخدام عند تزايد الخلايا تحت الظروف متساهلة، انظر القسم 1.2) من خلال الجمع بين التالية: 1X Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 4.5 غرام / لتر جلوكوز، 584 ملغ / لتر ʟ الجلوتامين، 110 ملغم / لتر البيروفات الصوديوم، و 100 وحدة / مل البنسلين ستربتومايسين، 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 وحدة / مل من الإنترفيرون γ (IFN-γ).
   2. إعداد 500 مل من مستنبت ب (لذوي الخوذات البيضاء استخدامأون الخلايا تجويع المصل في ظل ظروف غير متساهلة، انظر القسم 1.2) بحذف FBS وIFN-γ من وصفة مستنبت أ لزراعة خلايا في ظل ظروف غير متساهلة (قبل المصل المجاعة)، إضافة 10٪ ضد / ت FBS إلى مستنبت B.
   3. تحضير 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.2، في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco و(DPBS) من 4٪ لامتصاص العرق الأوراق المالية للتثبيت من الخلايا الميتة.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة، وينبغي توخي الحذر المناسب في استخدامه.
2. خلايا BU.MPT الثقافة
   1. ذوبان الجليد من النيتروجين السائل قنينة واحدة من الخلايا BU.MPT.
      ملاحظة: BU.MPT هو الداني الخلايا الظهارية أنبوبي (PTEC) خط الماوس الكلى مستمدة من الماوس المعدلة وراثيا تحمل (TS) طفرة حساسة للحرارة (tsA58) من SV40 مستضد ورم كبير (TAG) تحت سيطرة الماوس الرئيسي مجمع التوافق النسيجي (MHC) H-2K ^ب الصف الأول المروج ^25،26.
   2. لوحة الخلايا على polystyr معقمإيني البلازما الغاز فراغ تعامل أطباق زراعة الأنسجة (~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل 100 ملم طبق القطر).
   3. زراعة خلايا في ظل ظروف متساهلة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي.
      ملاحظة: الشروط المتساهلة، التي تعرف بأنها ثقافة في 33-37 درجة مئوية في وجود IFN-γ، وتمكين التعبير مستقر من التحوير TAG تحور tsA58. على عكس الثقافات الأولية من الماوس PTEC الكلى، والتي لا البقاء على قيد الحياة أكثر من ممر واحد أو اثنين، مثقف BU.MPT في ظل ظروف متساهلة يمكن passaged إلى أجل غير مسمى.
      1. خلايا مرور ثلاث مرات على الأقل بعد ذوبان الجليد قبل استخدامها في تجربة.
         1. إلى خلايا مرور، إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين في صحن 100 ملم، واحتضان في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين بإضافة 10 مل من المتوسط ​​A. نضح خلايا منفصلة، ​​وتقسيم 1: 3-1: 5 في الجديدة 100 مم البوليسترين العقيمة الغاز فراغ البلازما تعامل TISSأطباق ثقافة رق. إضافة المتوسطة ولتبرزي حجم ما يصل الى ما مجموعه 10 مل لكل طبق 100 ملم.
   4. في إطار التحضير للاستخدام التجريبي كما الاستجابة الخلايا، تنمو الخلايا لالتقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ جو في ظل ظروف غير متساهلة (أي في 39 درجة مئوية في ظل غياب IFN-γ [المتوسط B تحتوي على 10٪ ضد / ت FBS]).
      ملاحظة: في ظل ظروف غير متساهلة، هو تحول دون التعبير عن التحوير TAG تحور tsA58 من قبل> 95٪، والخلايا BU.MPT تتصرف مثل الثقافات الأولية من PTEC الماوس الكلى.

2. إعداد خلايا أفكارك BU.MPT (بروتوكول 1)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا أفكارك، وstaurosporine كأسلوب من تحريض موت الخلايا المبرمج. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، يمكن أن تستخدم كمصدر للخلايا أفكارك، مع موت الخلايا المبرمج الناجم عن protoco موحدليرة سورية لهذا النوع من خلية معينة وطريقة الحث موت الخلايا المبرمج.

1. بعد مرور على البوليسترين معقم البلازما الغاز فراغ أطباق زراعة الأنسجة قطرها 100 ملم تعامل، وتنمو خلايا BU.MPT إلى التقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ جو في ظل ظروف متساهلة (أي في 37 درجة مئوية في مستنبت وفي 10 مل لكل طبق بقطر 100 ملم)، كما هو موضح في القسم 1.2.3.
2. شطف الخلية أحادي الطبقة ملتصقة ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وذلك باستخدام 10 مل لكل الشطف.
3. لحث الخلايا التي تفرخ الخلايا في مستنبت B تحتوي على staurosporine، وغير الانتقائية بروتين كيناز المانع، في 1 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعات في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.
4. نضح المتوسطة التي تحتوي على staurosporine تحتوي على "عائم" خلايا أفكارك أن يكون فصل من أحادي الطبقة. الطرد المركزي هذه الوسيلة لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، تجاهل طاف، ويغسل بيليه ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وإضافة بيليه إلى الخلايا التي تم جمعها في الخطوة التالية، 2.5.
5. فصل الخلايا الملتصقة المتبقية من الخطوات 2.3 و 2.4 بإضافة 5 مم (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) EDTA في 1X كا ^{2 +} - والمغنيسيوم ^{2 +} خالية من DPBS في 1 مل لكل طبق لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة التي تحتوي على EDTA تحتوي على خلايا أفكارك منفصلة، ​​وتجميع خلايا منفصلة مع "عائم" خلايا أفكارك من الخطوة 2.4 في 15 مل أنبوب البوليسترين الطرد المركزي معقمة.
6. غسل الخلايا أفكارك ثلاث مرات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج وإعادة تعليق في 10 مل من 1X الكالسيوم ^{+ 2} - والمغنيسيوم ^{+ 2} خالية من DPBS في غسل.
7. بعد غسل الماضي، تعليق الخلايا أفكارك في الطازجة مستنبت B في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مليلتر قبل استخدامها لتحفيز خلايا المستجيب. بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا أفكارك غسلها في 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق في 1X DPBS لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل ثلاث مرات مع الثقافةمتوسطة B، قبل تعليق في مستنبت B.
8. حسب الاقتضاء، تأكيد استحثاث موت الخلايا المبرمج من قبل التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من الخلايا أفكارك (أو عن طريق حجز بعض الخلايا لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا ^{6،9،10،15.}
   انخفضت الخلايا أفكارك المبكرة لها أغشية الخلايا سليمة، وتظهر كما يوديد propidium (PI) خلايا-سلبية وannexin-V إيجابي من حجم الخلية (نسبة إلى خلايا قابلة للحياة): ملاحظة. في وقت متأخر خلايا أفكارك لها أغشية الخلايا غير سليمة، وتظهر على شكل خلايا إيجابية PI وannexin-V الإيجابي لانخفاض حجم الخلية. باستخدام البروتوكول الحالي، الاستعدادات نموذجية تحتوي على ~ 85٪ أفكارك المبكر و~ 15٪ خلايا أفكارك في وقت متأخر.
9. إضافة خلايا أفكارك إلى BU.MPT خلايا المستجيب (بروتوكول 3) في نسبة أفكارك إلى الرد خلية من 1: 1، إما مباشرة أو بعد تثبيت الخلايا أفكارك لمدة 30 دقيقة مع 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق في 1X DPBS .
   ملاحظة: أفكارك خلية التثبيت قبل التحفيز من المستجيبين ينبغيلا تؤثر على النتائج، ما لم ترجع إلى الإفراج عن وسيط للذوبان (الجدول 1) أحداث لاحظ الإشارة.

3. إعداد الخلايا الميتة BU.MPT (بروتوكول 2)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا الميتة، والتدفئة كوسيلة للتحريض النخر. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، يمكن أن تستخدم كمصدر للخلايا الميتة، مع نخر الناجم عن بروتوكولات موحدة لهذا النوع من خلية معينة وطريقة الاستقراء النخر.

1. بعد مرور على البوليسترين معقم البلازما الغاز فراغ أطباق زراعة الأنسجة قطرها 100 ملم تعامل، وتنمو خلايا BU.MPT إلى التقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ جو في ظل ظروف متساهلة (أي في 37 درجة مئوية في مستنبت وفي 10 مل لكل طبق)، كما هو موضح في القسم 1.2.3.
2. شطف الخلية أحادي الطبقة ملتصقة ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وذلك باستخدام10 مل لكل الشطف.
3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 ملي EDTA في 1X الكالسيوم ^{+ 2} - والمغنيسيوم ^{+ 2} خالية من DPBS في 1 مل لكل طبق لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة التي تحتوي على EDTA تحتوي على خلايا منفصلة، ​​وإضافة تعليق الخلية إلى 15 مل أنبوب البوليسترين الطرد المركزي معقمة.
4. غسل الخلايا ثلاث مرات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج وإعادة تعليق في 10 مل من الكالسيوم ^{+ 2} - والمغنيسيوم ^{+ 2} خالية من DPBS في غسل.
5. بعد غسل الماضي، تعليق الخلايا في الطازجة مستنبت B في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مليلتر.
6. حمل نخر عن طريق تسخين الخلايا إلى 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حمام مائي، vortexing لبلطف تعليق خلية كل 10 دقيقة.
7. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. دوامة بلطف تعليق خلية كل 15 دقيقة.
8. حسب الاقتضاء، تؤكد تحريض نخر التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من شمال شرقخلايا crotic (أو عن طريق حجز بعض الخلايا لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا ^{6،9،10،15.}
   ملاحظة: خلايا نخرية لقد مزقت أغشية الخلايا، وتبدو وكأنها خلايا PI الإيجابي لزيادة حجم الخلية (نسبة إلى خلايا قابلة للحياة). باستخدام البروتوكول الحالي، الاستعدادات نموذجية تحتوي على ≥ الخلايا الميتة 95٪. بدلا من ذلك، قد يتم تأكيد تحريض نخر وفقدان سلامة الغشاء عن طريق التريبان تلطيخ الأزرق.

4. إعداد خلايا BU.MPT المستجيب (بروتوكول 3)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا المستجيب. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، ويمكن استخدام مثل خلايا المستجيب. قبل استخدام التجريبي، قد يكون ذلك حافزا هدوء بين عشية وضحاها من بروتوكولات موحدة داخل المختبر.

1. زراعة خلايا BU.MPT في أطباق زراعة الأنسجة معقمة 100 ملم في ظل ظروف متساهلة في الثقافة المتوسطة وفي 10 مل لكل طبق حتى تحقيق ~85٪ التقاء.
2. الثقافة نضح المتوسطة و، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة (ب) في 10 مل لكل الشطف. المصل تجويع الخلايا بين عشية وضحاها من 18 إلى 24 ساعة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ جو في ظل ظروف غير متساهلة (أي في 39 درجة مئوية في الثقافة المتوسطة (ب) في 10 مل لكل طبق)، كما هو موضح في القسم 1.2 0.4، من أجل حمل هدوء. بدلا من ذلك، تنمو الخلايا في مستنبت B بالإضافة إلى 10٪ (ت / ت) FBS في 39 درجة مئوية لمدة يوم واحد قبل خلايا الدم تجويع بين عشية وضحاها في مستنبت باء بدون FBS.
3. تسمية طبق زراعة الأنسجة منفصلة من متكدسة خلايا BU.MPT لكل حالة تجريبية.
4. تشمل ستة شروط التالية: التحفيز من المستجيبين BU.MPT قابلة للحياة مع عامل إما السيارة أو البشرة النمو (EGF) لمدة 15 دقيقة، بعد التعرض لمدة 30 دقيقة إما لا الخلايا، خلايا أفكارك، أو الخلايا الميتة.
   ملاحظة: التعرض إلى الخلايا الميتة إما أن تحفز أو تثبط مستوى النشاط من غيفين جزيء التأشير. من الأفضل الكشف عن التحفيز فوق خط الأساس منخفضة (على سبيل المثال، وغياب EGF)، في حين أن أفضل الكشف عن تثبيط من خط الأساس عالية (على سبيل المثال، وجود EGF). منذ تأثير التحفيز مع الخلايا الميتة هو بداهة معروف، فمن المستحسن لإجراء جميع الدراسات في كل من غياب وجود EGF.

5. تحفيز الخلايا المستجيب مع أفكارك وخلايا نخرية (بروتوكول 4)

1. نضح مستنبت B من الأطباق وصفت مسبقا من هادئة (المصل المتعطشة) BU.MPT خلايا المستجيب (بروتوكول 3).
   ملاحظة: بعد الثقافة بين عشية وضحاها في ظل ظروف غير متساهلة، يجب أن خلايا BU.MPT تتصرف مثل الثقافات الأولية من PTEC الماوس الكلى.
2. في صحن 100 ملم، إضافة 2 مل من واحد مما يلي: الثقافة المتوسطة ب (أي خلايا)؛ تعليق الخلية أفكارك في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 1)؛ أو تعليق خلية نخرية في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مليلتر طن ثقافة المتوسطة ب (بروتوكول 2).
   1. توزيع تعليق 2 مل من الخلايا الميتة بالتساوي على طبق 100 ملم، والحفاظ على الوقت بالنسبة لهم لتسوية إلى أدنى حد ممكن. ولتحقيق ذلك، توزيع القتلى قطرة تعليق خلية قطرة مع ماصة واسعة على سطح كامل من الأطباق خلية المستجيب. استخدام حجم 2 مل كحل وسط بين تقليل زمن الاستقرار وتجنب تراكمها من الخلايا الميتة.
      ملاحظة: استخدام تعليق الخلايا الميتة كما ينطوي على تحفيز عدد من الاعتبارات الخاصة، والتي تم وصفها أدناه بمزيد من التفصيل (الجدول 2 ومناقشة).
   2. تحقيق نسبة الخلايا القتلى إلى الرد من ~ 1: 1 وذلك بإضافة 2 مل من الخلايا الميتة في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مليلتر إلى طبق مم متكدسة 100، والذي يحتوي على ~ 10 × 10 ⁶ خلايا. بدلا من ذلك، من أجل تحديد الجرعة واعتماد أي أحداث يشير لاحظ، تختلف نسبة القتلى إلى خلايا المستجيب باستمرار التخفيف التدريجي في عبادةلدى عودتهم المتوسط ​​باء من الايقاف الخلية الميتة التي أعدت في البروتوكولات 1 و 2.
3. دوامة بلطف الأطباق، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي.
4. بعد 30 دقيقة، وتحفيز الخلايا الرد مع أي مركبة أو 50 نانومتر EGF، وفقا لمرحلة ما قبل وضع العلامات على طبق الثقافة.
5. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي.
6. يغسل الخلايا الميتة عن طريق إضافة 5 مل من الجليد الباردة 1X DPBS، يحوم على طبق، والشفط السائل غسل. كرر ثلاث مرات.
7. المكان على الفور الأطباق خلية الرد على الجليد لمزيد من المعالجة.
8. إعداد الخلية لست]
   1. إعداد العازلة تحلل الخلية التي تحتوي على ما يلي: 1 × تريس مخزنة المالحة (TBS)، 10 ملي بيروفوسفات الصوديوم، و 0.5٪ ث / ت deoxycholate، 0.1٪ ث / ت SDS، 10٪ الجلسرين، و 25 ملم فلوريد الصوديوم.
      1. قبل مباشرة إلى الخلية تحلل، إضافة لما يلي في الترتيب الدقيق بالنظر في دائرة الهجرة والجنسيةتركيزات icated: مصغرة خالية من EDTA مثبط البروتياز كوكتيل (1 قرص لكل 10 مل من تحلل العازلة)، 10٪ (ت / ت) تريتون X-100، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF)، و 10 ملي orthovanadate الصوديوم.
   2. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة في صحن 100 ملم من خلايا المستجيب حفز حديثا على الجليد من الخطوة 5.7. تتخلص من الخلايا مع مكشطة الخلية، ونقل المحللة إلى ما قبل المبردة 1.5 microtubes مل. الحفاظ على أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
   3. لست] يصوتن على الجليد مع 10 نبضات من 20 هرتز، أقل من ثانية واحدة في كل من المدة. تجنب خلق رغوة في واجهة الغاز / السائل، وهذا يمكن أن ارتفاع درجة حرارة العينات. تزج تماما التحقيق sonicator في microtubes تحتوي لست] قبل تبديل sonicator على، وتبديل sonicator من قبل إزالة المسبار من لست].
   4. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونقل supernatants إلى الطازج microtubes قبل المبردة، ومخزن في -70 درجة مئوية.
   5. أداء الكهربائي للهلام وimmunoblotting على supernatants من لست]، كما هو موضح سابقا ^{6،9،10،15.}

6. منع المباشر البدني الاتصال بين الأهداف والمستجيبين باستخدام البولي غشاء شبه منفذ (بروتوكول 5)

1. إعداد خلايا المستجيب BU.MPT وفقا لبروتوكول 3، مع استثناء واحد؛ تنمو الخلايا في نسيج الثقافة البوليسترين العقيمة معاملة مجموعات 12-جيدا.
2. في آبار مختارة، وضع نظام دعم منفذ يحتوي على غشاء البولي 0.4 ميكرون لمنع التفاعل الجسدي بين الخلايا الميتة والرد. تشمل آبار المراقبة بدون غشاء بنفس التجربة.
3. نضح مستنبت B من الآبار التجريبية من خلايا BU.MPT الرد المتعطشة للمصل.
4. اتبع بروتوكول 4 لتحفيز خلايا الرد مع الخلايا أفكارك أو الميتة، مع إجراء التعديلات التالية:
   1. لكل بئر من 1المجموعة 2 بشكل جيد، إضافة 0.1 مل من واحد مما يلي: الثقافة المتوسطة ب (أي خلايا)؛ تعليق الخلية أفكارك في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 1)؛ أو نخرية تعليق خلية في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 2).
      ملاحظة: كما جيدا متموجة من مجموعة ال 12 أيضا يحتوي ~ 0.5 × 10 ⁶ خلايا، إضافة 0.1 مل من الخلايا الميتة في ~ 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل ينتج نسبة القتلى إلى الرد خلية من ~ 1: 1.
   2. إلى الآبار التي تحتوي على نظام دعم نفاذة، إضافة الخلايا الميتة على رأس الغشاء البولي 0.4 ميكرون داخل منظومة الدعم قابلة للاختراق، لذلك ليس هناك تفاعل المادي المباشر بين الخلايا الميتة والرد.

7. تثبيط البلعمة مع مثبط حركة الخلايا D (بروتوكول 6)

1. إعداد خلايا المستجيب BU.MPT وفقا لبروتوكول 3.
2. إعداد هيكل الخلية المانع مثبط حركة الخلايا D في dimethYL سلفوكسيد (DMSO) في 4 ملغ / مل (1000 ×). إضافة أطباق لمرحلة ما قبل المسمى الخلايا المستجيب BU.MPT إما 10 ميكرولتر من السيارة (DMSO) أو 10 ميكرولتر من مثبط حركة الخلايا D لتحقيق تركيز النهائي من 4 ميكروغرام / مل في 10 مل من مستنبت B.
   ملاحظة: في هذه تركيز مثبط حركة الخلايا D، البلعمة من قبل خلايا BU.MPT وخط خلية بلعم كان مستعمل من قبل ≥90٪ ^9،10.
3. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO ₂ الغلاف الجوي.
4. اتبع بروتوكول 4 لتحفيز خلايا الرد مع الخلايا أفكارك أو الميتة.
5. حسب الاقتضاء، تأكيد تثبيط البلعمة من الخلايا الميتة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من الخلايا الميتة والرد (أو خلايا محفوظة لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا ^9،10.

في الشكل 1، ونحن نقدم التخطيطي تصور توقيت والحرجة الخطوات المتبعة في إعداد الخلايا أفكارك (بروتوكول 1) والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، وتحفيز خلايا الرد مع تعليق من الخلايا أفكارك والميتة (بروتوكول 4).

في الشكل 2، ونحن نقدم نتائج ممثل تبين تأثير الخلايا أفكارك على الفسفرة من اثنين من الأشكال الإسوية من السيرين، ثريونين كيناز الجليكوجين سينسيز كيناز-3 (GSK-3)، GSK-3α وGSK-3β. GSK-3α / β له دور بارز في تنظيم انتشار الخلوي والبقاء على قيد الحياة، فضلا عن دوره الهام في عملية ايض الجلوكوز. الفسفرة من GSK-3α في السيرين-21 و GSK-3β في السيرين-9 يمنع النشاط كيناز و، بدوره، يؤدي إلى انخفاض الفسفرة وزيادة استقرار β-كاتينين. بيتا-كاتينينثم translocates إلى النواة، حيث أنه يشجع على نسخ من الجينات المعروفة لتحفيز تكاثر الخلايا وتمنع موت الخلايا المبرمج. لذلك، ويرتبط زيادة الفسفرة من GSK-3α / β مع زيادة انتشار والبقاء على قيد الحياة، في حين انخفضت الفسفرة من GSK-3α / β يرتبط انتشار انخفضت والبقاء على قيد الحياة.

تعرض المستجيبين BU.MPT هادئة لأفكارك الخلايا لمدة 30 دقيقة الفسفرة القاعدية تحول دون بقوة من GSK-3α / β (الشكل 2A). وبالمثل، تعرض من قبل لأهداف أفكارك لمدة 30 دقيقة بقوة يمنع عامل نمو البشرة لاحق (EGF) الفسفرة -induced من GSK-3α / β (الشكل 2A). في المقابل، كان التعرض من المستجيبين BU.MPT إلى الخلايا الميتة أي تأثير على أي الفسفرة القاعدية أو من صنع EGF من GSK-3α / β.

إلى الحيلولة دونر التفاعل الجسدي بين المستجيبين BU.MPT والخلايا أفكارك، ونمت المستجيبين BU.MPT في نظام الدعم نفاذة وفصلها عن أهداف أفكارك عن طريق غشاء البولي 0.4 ميكرون. الوقاية من التفاعل الجسدي بين المستجيبين BU.MPT والخلايا أفكارك إلغاء قدرة أهداف أفكارك لمنع الفسفرة من GSK-3α / β (الشكل 2B). لتقييم دور البلعمة، استخدمنا هيكل الخلية المانع مثبط حركة الخلايا D لمنع امتصاص أكلة من الخلايا الميتة. حدث تثبيط الفسفرة من GSK-3α / β ردا على خلايا أفكارك في غياب البلعمة (الشكل 2C). لقد أظهرنا سابقا أن مثبط حركة الخلايا D، في التركيز المستخدم، يمنع PTEC والبلعمة بلعم التي كتبها ≥90٪ 9،10. معا، نتائجنا تظهر أن أفكارك تثبيط بوساطة خلية من الفسفرة من GSK3α / β يتطلب المباشر betwe التفاعل الجسدي أون أهداف والخلايا المستجيب، ولكن مستقلة عن البلعمة.

الشكل 1. مخطط للتحريض بين الخلايا اشارة الأحداث في خلايا المستجيب قابلة للحياة من خلال التفاعل الجسدي مع الخلايا المجاورة التي تمر موت الخلية. الرسوم البيانية خط تصوير أحداث التوقيت وحاسمة في إعداد (A) أفكارك (آبو) خلية و (ب) نخرية (نيكرو) تعليق خلية من خلايا BU.MPT، وفي (ج) تحفيز الرد BU.MPT قابلة للحياة الخلايا مع تعليق من الخلايا أفكارك أو الميتة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
الرقم 2. تثبيط الفسفرة من GSK3α / β في الخلايا BU.MPT المستجيب بعد التعرض للخلايا أفكارك يتطلب المباشر التفاعل خلية خلية ولكن مستقلة عن البلعمة. تم سابقة التجهيز خلايا المستجيب BU.MPT المتعطشة المصل لمدة 2 ساعة مع (A، B) مركبة أو (C) مثبط حركة الخلايا D (4 ميكروغرام / مل)، وبعدها سعى لمدة 30 دقيقة مع عدم وجود خلايا (-)، والخلايا أفكارك (آبو )، أو الخلايا الميتة (NEC) في خلية ميتة في الرد نسبة الخلايا من 1: 1. تم غسلها ثم الخلايا المستجيب، والمحتضنة لمدة 15 دقيقة أخرى في وجود أو غياب من EGF (50 نانومتر)، قبل الحصاد. وكان مصدر من الخلايا أفكارك الخلايا BU.MPT المعالجة staurosporine. وكان مصدر من الخلايا الميتة خلايا BU.MPT المعالج حراريا. كان التفاعل بين الخلايا الميتة والمستجيبين BU.MPT إما (A، C) دون عوائق، مما مباشرةميت خلية في الرد التفاعل الجسدي، أو (ب) مع فصل الخلايا الميتة والمستجيبين عن طريق غشاء البولي 0.4 ميكرون في نظام دعم منفذ. تم إزالة الخلايا الميتة والخلايا المستجيب غير ملتصقة عن طريق الغسيل، وBU.MPT الرد جرى التحقيق الخلية لست] مع anti-فسفرته الأجسام المضادة GSK3α / β كما هو مبين. وأكد تحميل قدم المساواة التحقيق لمجموع نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات (GAPDH). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تحديد آلية (ق) المسؤولين عن اشارة الأحداث في خلايا قابلة للحياة بعد التعرض للخلايا أفكارك. وتقدم عدة استراتيجيات تجريبية واضحة للتمييز بين الآلية المحتملة (ق) المسؤولة عن إشارات الأحداث نظرن بعد التعرض لخلايا أفكارك. وتشمل هذه الآليات: التفاعل المادي للخلية أفكارك مع مستقبلات معينة على الخلية المستجيب، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان من الخلية أفكارك، وإشراك الأجهزة أكلة الخلية المستجيب ل.

الجدول 2. التجريبية القضايا المرتبطة باستخدام لتعليق الخلوي بمثابة المحفز من بين الخلايا اشارة الأحداث. وترد عدة عقبات التجريبية المرتبطة باستخدام تعليق الخلية على أنها التحفيز، وكذلك استراتيجيات لعلاج لهم جزئي.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.