هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد أحداث الإشارات داخل الخلايا المستحثة في الخلايا القابلة للحياة عن طريق التفاعل الجسدي مع الخلايا الميتة أو المحتضرة المجاورة. يركز البروتوكول على أحداث الإشارات الناجمة عن التعرف بوساطة المستقبلات على الخلايا الميتة ، بدلا من امتصاصها البلعمي أو إطلاق الوسطاء القابل للذوبان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الميتة التي كتبها موت الخلايا المبرمج، وأشار أيضا إلى موت الخلايا كما ينظم، والحصول على أنشطة جديدة متعددة تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة. الأنشطة الحيوية، مثل البقاء على قيد الحياة، وانتشار والنمو والتمايز، هي من بين العديد من الوظائف الخلوية عن طريق التضمين خلايا أفكارك. تظهر القدرة على التعرف والرد على الخلايا أفكارك لتكون سمة عالمية لجميع الخلايا، بغض النظر عن النسب أو الجهاز من الأصل. ومع ذلك، فإن تنوع وتعقيد استجابة للولايات خلايا أفكارك باتخاذ عناية كبيرة في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. على وجه الخصوص، لا بد من التمييز بين آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك يمكن أن تؤثر في مسارات الإشارات بين الخلايا داخل الخلايا المستجيب قابلة للحياة، بما في ذلك: الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان من قبل الخلية أفكارك، و / أو إشراك phagoماكينات إختر التصميم. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا المستجيب قابلة للحياة بعد تعرضهم للخلايا أفكارك. والميزة الرئيسية لبروتوكول تكمن في الاهتمام الذي يدفع إلى تشريح الآلية التي الخلايا أفكارك تعدل إشارات الأحداث داخل الخلايا الاستجابة. في حين أن البروتوكول هو محدد للحصول على خط خلد مشروط الماوس الكلى القريبة خلية أنبوبي (خلايا BU.MPT)، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. استخدام الخلايا الميتة كحافز يقدم العديد من العوامل الفريدة التي يمكن أن تعيق الكشف عن أحداث الإشارات بين الخلايا. هذه المشاكل، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تطبيق هذا البروتوكول يجب أن تساعد معرفتنا توسيع نفوذ واسع على أن الخلايا الميتة أو التي تحتضر تمارس على جيرانهم الحية، سواء في مجال الصحة وفي diseaحد ذاتها.
المقدمة
موت الخلايا المبرمج، أو ينظم موت الخلية 1، يساهم بطريقة ضرورية لصيانة وتطوير الأنسجة. ينظر معظم ببساطة، تصاريح موت الخلايا المبرمج الذين تتراوح أعمارهم بين، التالفة، أو الخلايا الزائدة ليتم التخلص منها دون ضرر للأنسجة المحيطة 2،3. مساهمة من موت الخلايا المبرمج للتوازن الأنسجة، مع ذلك، إلى حد كبير أكثر ديناميكية ومتنوعة. الخلايا الميتة بواسطة الخلايا تكتسب أنشطة جديدة متعددة، سواء يفرز والخلايا المرتبطة، والتي تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة 4-10. الدراسات السابقة ركزت على قدرة خلايا أفكارك لقمع التهاب 11-16، ولكن الخلايا أفكارك أيضا تعدل مجموعة واسعة من الوظائف الخل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحضيرات
ملاحظة: في هذا البروتوكول، واثنين أو أكثر من خطوط الخلايا، أو الثقافات الخلية الأولية، يتم إعداد بشكل مستقل في ظل ظروف محددة. وتشمل هذه الاستعدادات الخلايا أفكارك (بروتوكول 1)، والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، والخلايا المستجيب صحية (بروتوكول 3). بعد إعداد مستقل، تضاف الخلايا أفكارك أو الميتة إلى خلايا المستجيب ويتم رصد ينتج عن ذلك من نقل الإشارة (بروتوكولات 4 و 5 و 6).
- إعداد وسائل الإعلام والثقافة، والكواشف
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الشكل 1، ونحن نقدم التخطيطي تصور توقيت والحرجة الخطوات المتبعة في إعداد الخلايا أفكارك (بروتوكول 1) والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، وتحفيز خلايا الرد مع تعليق من الخلايا أفكارك والميتة (بروتوكول 4).
في الشكل 2، ونحن نقدم نتائج ممثل تبين تأثير الخلايا أفكارك على الفسفرة من اثنين من الأشكال الإسوية من السيرين، ثريون.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ونحن نقدم هنا بروتوكول لوصف أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا قابلة للحياة بعد تعرضها لالخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج، أو غيرها من موت الخلايا الأشكال. ويؤكد البروتوكول على آليات متعددة التي التعرض للخلايا أفكارك يمكن أن تعدل مسارات الإشارات بين الخلايا داخل الخلايا المستجيب قابلة للحياة. وتشمل هذه الآليات: التفاعل (عن طريق سد الجزيئات أو المحددات على سطح الخلية الميتة أو الحويصلات سقيفة وmicrovesicles، وغالبا ما يطلق الهيئات أفكارك) مع مستقبلات معينة على الخلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل ، كليا أو جزئيا ، من خلال الأموال المؤسسية من الدكتور خوسيه أ. أرودا وقسم أمراض الكلى ، جامعة إلينوي في شيكاغو (إلى جي إس إل) ؛ وتمويل من قسم الطب بجامعة ماكجيل ومعهد البحوث التابع للمركز الصحي بجامعة ماكجيل (إلى جي آر )
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <مواد زراعة الخلايا القوية<> / قوية > | |||
| DMEM ، 1x مع [4.5 جم / لتر] الجلوكوز ، &# 671 ؛ -الجلوتامين والصوديوم البيروفات | Mediatech (ماناساس ، فيرجينيا) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II ، مصل الأبقار الجنيني | GE Healthcare (لوجان ، يوتا) | SH30066.03 | تضيف 10٪ (حجم / حجم) ؛ إلى وسط الاستزراع A |
| البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين ، 100x | Life Technologies (Grand Island ، NY) | 10378-016 | تضيف 100 وحدة / مل إلى وسائط الثقافة A و B |
| & gamma ؛ - إنترفيرون ، مؤتلف الفأر ، من الإشريكية القولونية < / em> | كالبيوكيم ، ميليبور (بيليريكا ، ماساتشوستس) | 407303 | إضافة 10 وحدات / مل إلى وسط الاستزراع أطباق |
| معالجة بزراعة أنسجة البوليسترين فالكون ، كورنينج غير الحرائق | (دورهام ، نورث كارولاينا) | 353003 | معقمة ، |
| أنابيب الطرد المركزي فالكون البوليسترين بقطر 100 مم ، القاع المخروطي | Corning (دورهام ، نورث كارولاينا) | 352095 | معقمة ، 15 مل |
| Trypsin-EDTA ، 0.05٪ ، Gibco | Fisher (Waltham ، MA) | 25300062 | معقمة ، 100 مل |
| < قوي > الاسم < / قوي > | < قوي > الشركة < / strong > | catalog < / strong > | التعليقات < / قوي> |
| <قوي>المواد الكيميائية والمثبطات< / قوي > | |||
| Staurosporine ، من Streptomyces sp< / em>. | استخدام Sigma (سانت لويس ، ميزوري) | S4400 | في [1 & mu; جم / مل] لمدة 3 ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج |
| عامل نمو البشرة (EGF) ، [1 مجم / مل] | استخدام Millipore (Billerica ، MA) | EA140 | عند 50 نانومتر لتحفيز الخلايا المستجيبة |
| UltraPure ، 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 | Life Technologies (Grand Island ، NY) | 15575-038 | استخدم 5 ملي مولار لفصل الخلايا الملتصقة |
| محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ | MP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا) | 91691049 | لتلوين |
| الخلايا الميتةمحلول بارافورمالدهايد ، 4٪ في DPBS | Affymetrix (سانتا كلارا ، كاليفورنيا) | 19943 | يستخدم 0.4٪ (حجم / حجم) في 1x DPBS لتثبيت الخلايا |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، 1x ، Gibco | Life Technologies (Grand Island ، نيويورك) | 14040133 | محلول المخزون |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، Ca2 + < / sup>- و Mg2 + < / sup> خالي ، 1x ، Gibco | Life Technologies (Grand Island ، نيويورك) | 14190367 | محلول مخزون |
| Cytochalasin D ، 4 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، من Zygosporium mansonii < / em > | Sigma (سانت لويس ، ميزوري) | C8273 | يستخدم في [4 & mu ؛ جم / مل] لتثبيط البلعمة |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما (سانت لويس ، ميزوري) | مذيب D2650 | للسيتوكالاسين D |
| [header] | |||
| < قوي > مكونات محلول ملحي لتحلل الخلية < / قوي > | |||
| محلول ملحي مخزن (TBS) ، 10x ، درجة الحموضة 7.4 | BioRad (هرقل ، كاليفورنيا) | 1706435 | للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| بيروفوسفات | الصوديومسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري | ) 221368 | 10 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل |
| الخلايا ديوكسي كولات الصوديوم | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) | D6750 | 0.5٪ وزن / حجم للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) | L3771 & nbsp ؛ | 0.1٪ وزن / حجم للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| الجلسرين | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) | G5516 | 10٪ للمخزن المؤقت لتحلل |
| الخلايا فلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري | ) 450022 | 25 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| كوكتيل مثبط للبروتياز خال من EDTA قرص كوكتيل | دقيق دقيق خال من EDTA Roche Diagnostics (إنديانابوليس ، إنديانا) | 4693159001 | للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، 1 قرص لكل 10 مل من المخزن المؤقت |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO) | T8787 | 10٪ للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا) | 11DTT00005 | 1 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) MP | Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا) | 4800263 | 1 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا |
| أورثوفانديت الصوديوم | MP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا) | 2159664 | 10 ملي مولار للمخزن |
| المؤقت لتحلل الخلايا<قوي>الاسم | <قوي>الشركة | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B جهاز طرد | مركزي Du Pont (ويلمنجتون ، DE) | T6000B | |
| فيشر Tissuemat ، حمام مائي | فيشر (والثام ، ماساتشوستس) | ||
| جهاز الصوتيات (سونيكاتور) ، موديل 100 | فيشر (والثام ، ماساتشوستس) | ||
| <قوي >متنوع< / قوي > | |||
| غرفة عد الخلايا ، نيوباور | هوكسلي (لانسينج ، ساسكس ، المملكة المتحدة) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Detection Ptosis Kit II | Millipore (Billerica ، MA) | CBA059 | ل PI و Annexin V تلطيخ لتحديد مرحلة موت الخلايا المبرمج |
| أنابيب Eppendorf microcntrifuge ، 1.5 مل | Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري) | T9661 | |
| دعم نفاذية Transwell ، 0.4 & mu ؛ م غشاء البولي كربونات | كورنينج (كورنينج ، نيويورك) | 3413 | معقم ، بوليسترين ، ثقافة الأنسجة المعالجة |
| <قوية>الاسم< / قوي> | <قوي>الشركة< / قوي> | <قوي>كتالوج | <قوي>تعليقات |
| ><قوي>الأجسام المضادة | |||
| فوسفو جليكوجين سينسيز كيناز -3 &alpha ;/&beta ؛ (GSK-3 &alpha ؛ /&beta ؛) (Ser21/9) ، تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة متعددة النسيلة | 9331 | الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة | |
| جلسرالديهايد -3-فوسفات نازعة هيدروجين (GAPDH) أحادي النسيلة ((14C10) ) تقنية | إشارات الخلية | 2118 | أجسام مضادة أحادية النسيلة للأرانب |
المراجع
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in i....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
