يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

8.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

ديسمبر 27, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد أحداث الإشارات داخل الخلايا المستحثة في الخلايا القابلة للحياة عن طريق التفاعل الجسدي مع الخلايا الميتة أو المحتضرة المجاورة. يركز البروتوكول على أحداث الإشارات الناجمة عن التعرف بوساطة المستقبلات على الخلايا الميتة ، بدلا من امتصاصها البلعمي أو إطلاق الوسطاء القابل للذوبان.

الملخص

الخلايا الميتة التي كتبها موت الخلايا المبرمج، وأشار أيضا إلى موت الخلايا كما ينظم، والحصول على أنشطة جديدة متعددة تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة. الأنشطة الحيوية، مثل البقاء على قيد الحياة، وانتشار والنمو والتمايز، هي من بين العديد من الوظائف الخلوية عن طريق التضمين خلايا أفكارك. تظهر القدرة على التعرف والرد على الخلايا أفكارك لتكون سمة عالمية لجميع الخلايا، بغض النظر عن النسب أو الجهاز من الأصل. ومع ذلك، فإن تنوع وتعقيد استجابة للولايات خلايا أفكارك باتخاذ عناية كبيرة في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. على وجه الخصوص، لا بد من التمييز بين آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك يمكن أن تؤثر في مسارات الإشارات بين الخلايا داخل الخلايا المستجيب قابلة للحياة، بما في ذلك: الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان من قبل الخلية أفكارك، و / أو إشراك phagoماكينات إختر التصميم. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا المستجيب قابلة للحياة بعد تعرضهم للخلايا أفكارك. والميزة الرئيسية لبروتوكول تكمن في الاهتمام الذي يدفع إلى تشريح الآلية التي الخلايا أفكارك تعدل إشارات الأحداث داخل الخلايا الاستجابة. في حين أن البروتوكول هو محدد للحصول على خط خلد مشروط الماوس الكلى القريبة خلية أنبوبي (خلايا BU.MPT)، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. استخدام الخلايا الميتة كحافز يقدم العديد من العوامل الفريدة التي يمكن أن تعيق الكشف عن أحداث الإشارات بين الخلايا. هذه المشاكل، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تطبيق هذا البروتوكول يجب أن تساعد معرفتنا توسيع نفوذ واسع على أن الخلايا الميتة أو التي تحتضر تمارس على جيرانهم الحية، سواء في مجال الصحة وفي diseaحد ذاتها.

المقدمة

موت الخلايا المبرمج، أو ينظم موت الخلية 1، يساهم بطريقة ضرورية لصيانة وتطوير الأنسجة. ينظر معظم ببساطة، تصاريح موت الخلايا المبرمج الذين تتراوح أعمارهم بين، التالفة، أو الخلايا الزائدة ليتم التخلص منها دون ضرر للأنسجة المحيطة 2،3. مساهمة من موت الخلايا المبرمج للتوازن الأنسجة، مع ذلك، إلى حد كبير أكثر ديناميكية ومتنوعة. الخلايا الميتة بواسطة الخلايا تكتسب أنشطة جديدة متعددة، سواء يفرز والخلايا المرتبطة، والتي تمكنهم من التأثير على وظيفة الخلايا الحية المجاورة 4-10. الدراسات السابقة ركزت على قدرة خلايا أفكارك لقمع التهاب 11-16، ولكن الخلايا أفكارك أيضا تعدل مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك أنشطة حيوية مثل بقاء 4،9،10، وانتشار 4،9،10، والتمايز 17، الهجرة 18، والنمو 19. وعلاوة على ذلك، لا تقتصر هذه الآثار على البالعات المهنية، مثل بلعمالصورة، بل تمتد إلى جميع أنواع وسلالات الخلايا تقريبا، بما في ذلك الخلايا عادة غير البلعمية، مثل الظهارية والخلايا البطانية 7،9،10،18-21.

استجابة محددة من الخلايا الحية المجاورة بعد التعرض لخلايا أفكارك تعتمد على عوامل متعددة تتعلق كلا من خلايا الاستجابة وقابلة للحياة الخلايا أفكارك أنفسهم. على سبيل المثال، على الرغم من أن التعرض للخلايا أفكارك يمنع انتشار كل الضامة الفئران والكلى القريبة الخلايا الظهارية أنبوبي (PTECs)، وهذه أنواع الخلايا اثنين تختلف بشكل كبير في استجابة بقائهم على قيد الحياة لخلايا أفكارك 4،6،9،10. خلايا أفكارك تعزيز بقاء الضامة، ولكن تحفز وفاة أفكارك من PTECs 4،6،9،10. تجدر الإشارة إلى أن استجابة لخلايا أفكارك قد تختلف حتى بين الاستجابة خلايا من نفس النسب، اعتمادا على الجهاز الخلية المجيب من أصل 10 (على سبيل المثال، PTECs الكلى مقابل الظهارية الثدييةخلايا) أو حالة تفعيل 22 (على سبيل المثال، العدلات). على العكس، قد الخلايا أفكارك تثير استجابات مختلفة في نفس الخلية تبعا لطبيعة أفكارك التحفيز 10،23 أو مرحلة موت الخلايا المبرمج 10،14.

ونظرا لdiverseness وتعقيد ردا على الخلايا أفكارك، يجب توخي الحرص الشديد في تشريح أحداث ومسارات إشارات مسؤولة عن أي نتيجة معينة. أولا، والاستجابات التي تتطلب التفاعل المادي المباشر بين خلايا قابلة للحياة وأفكارك يجب تفريقها عن تلك التي تسببها وسطاء للذوبان صدر أو الناتجة عن الخلية أفكارك 3،6-10. إذا كان مطلوبا التفاعل الجسدي، ثم تمايز مزيد من يجب أن يتم تنفيذ. قد تعتمد يشير الأحداث على الاعتراف بوساطة مستقبلات الخلية أفكارك، بغض النظر عن ابتلاع لاحقة، أو على امتصاص أكلة، مستقلة عن مستقبلات معينة التي تربط الخلية أفكارك 3-7،9،10،19. في الحالة الأخيرة، فإن الاستجابة ليست محددة لخلايا أفكارك، ويمكن أن تنجم عن أي مواد أكلة 4،6.

أهمية هذه الفروق يمكن مرة أخرى موضع تقدير من قبل المتناقضة ردود الضامة وPTECs الكلى. لكل أنواع الخلايا، والتعرض للخلايا أفكارك يغير من نشاط كيناز المؤيدة للبقاء AKT. تعديل يعتمد على التفاعل المادي، لأن الفصل بين الاستجابة والخلايا أفكارك عن طريق غشاء البولي 0.4 ميكرون يلغي استجابة 4،9،10،19. ومع ذلك، فإن رد PTECs هي مستقبلات بوساطة ومستقلة البلعمة، بينما هو الدافع وراء رد الضامة التي كتبها البلعمة 4،9،10،19. ومما يعزز هذا الاستنتاج من خلال حقيقة أن التعرض لحبات اللاتكس، حافزا أكلة محايد، ليس له أي تأثير على النشاط AKT في PTECs، ولكن يقلد تأثير خلايا أفكارك في الضامة 4،9.

"> وعلى الرغم من دراستها بشكل أقل، الخلايا الميتة التي نخر، أو عرضي موت الخلايا 1، كما تعدل وظيفة خلايا قابلة للحياة في مكان قريب 3-10،19. مثل الخلايا أفكارك، والخلايا الميتة تمارس تأثيرها من خلال مجموعة متنوعة من الآليات، ولا سيما تسرب محتويات الخلايا من خلال من تمزق غشاء الخلية 3،5،6،9،24. العديد من الخلايا، بما في ذلك PTECs والضامة، تمتلك مستقبلات غير منافسة متميزة للالخلايا الميتة التي تنخر 5،9. إشراك هذه المستقبلات يحرض يشير الأحداث التي في كثير من الأحيان عكس تلك الناجمة عن إشراك مستقبلات الخلايا أفكارك 4-10،19. على سبيل المثال، في PTECs، والخلايا الميتة زيادة الفسفرة من AKT، في حين أن انخفاض خلايا أفكارك الفسفرة 9،10،19.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في PTECs الكلى قابلة للحياة من خلال الاعتراف بوساطة مستقبلات PTECs أفكارك المجاورة 9،10،19. في حين أن البروتوكول هو محدد لخط الخلية PTEC خلد مشروط المعروفة باسم خلايا BU.MPT 9،10،19،25،26، أنها تتكيف بسهولة مع خطوط الخلايا التي هي غير الظهارية في المنشأ و / أو مشتقة من الأجهزة الأخرى من الكلى. الأهم من ذلك أن استخدام الخلايا أفكارك كحافز خلية يطرح بعض الصعوبات التجريبية الأصيلة غير موجودة مع بروابط القابلة للذوبان. وأهم هذه العناصر هو أن الخلايا أفكارك يجب إضافة وتعليق بدلا من أن تكون حلا. هذه الصعوبات، وكذلك استراتيجيات لتقليل أو الالتفاف عليها، ومناقشتها في البروتوكول. تقريبا كل الأساليب المذكورة في البروتوكول هي واضحة وموحدة لزراعة الخلايا. وميزة هذا البروتوكول تكمن في اهتمامها إلى آليات متعددة من الخلايا التي أفكارك تعدل نقل الإشارة داخل الخلايا الاستجابة. وتشمل هذه الآليات الربط عبر محددات السطح أو سد الجزيئات لمستقبلات معينة على إعادةsponding الخلية، وإطلاق سراح من وسطاء للذوبان، و / أو إشراك آلية البلعمة. يتم تضمين الخلايا الميتة في جميع التجارب للتأكد من أن النتائج هي محددة لطريقة موت الخلايا، وليس استجابة تعميمها على الخلايا الميتة. نهج دقيق، على النحو الموصى به في هذا البروتوكول، أمر بالغ الأهمية في فهمنا لتأثير توسيع أي وقت مضى أن الخلايا الميتة تمارس على جيرانهم الحية، سواء في الصحة والمرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التحضيرات

ملاحظة: في هذا البروتوكول، واثنين أو أكثر من خطوط الخلايا، أو الثقافات الخلية الأولية، يتم إعداد بشكل مستقل في ظل ظروف محددة. وتشمل هذه الاستعدادات الخلايا أفكارك (بروتوكول 1)، والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، والخلايا المستجيب صحية (بروتوكول 3). بعد إعداد مستقل، تضاف الخلايا أفكارك أو الميتة إلى خلايا المستجيب ويتم رصد ينتج عن ذلك من نقل الإشارة (بروتوكولات 4 و 5 و 6).

  1. إعداد وسائل الإعلام والثقافة، والكواشف
    1. إعداد 500 مل من مستنبت ألف (للاستخدام عند تزايد الخلايا تحت الظروف متساهلة، انظر القسم 1.2) من خلال الجمع بين التالية: 1X Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 4.5 غرام / لتر جلوكوز، 584 ملغ / لتر ʟ الجلوتامين، 110 ملغم / لتر البيروفات الصوديوم، و 100 وحدة / مل البنسلين ستربتومايسين، 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 وحدة / مل من الإنترفيرون γ (IFN-γ).
    2. إعداد 500 مل من مستنبت ب (لذوي الخوذات البيضاء استخدامأون الخلايا تجويع المصل في ظل ظروف غير متساهلة، انظر القسم 1.2) بحذف FBS وIFN-γ من وصفة مستنبت أ لزراعة خلايا في ظل ظروف غير متساهلة (قبل المصل المجاعة)، إضافة 10٪ ضد / ت FBS إلى مستنبت B.
    3. تحضير 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.2، في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco و(DPBS) من 4٪ لامتصاص العرق الأوراق المالية للتثبيت من الخلايا الميتة.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة، وينبغي توخي الحذر المناسب في استخدامه.
  2. خلايا BU.MPT الثقافة
    1. ذوبان الجليد من النيتروجين السائل قنينة واحدة من الخلايا BU.MPT.
      ملاحظة: BU.MPT هو الداني الخلايا الظهارية أنبوبي (PTEC) خط الماوس الكلى مستمدة من الماوس المعدلة وراثيا تحمل (TS) طفرة حساسة للحرارة (tsA58) من SV40 مستضد ورم كبير (TAG) تحت سيطرة الماوس الرئيسي مجمع التوافق النسيجي (MHC) H-2K ب الصف الأول المروج 25،26.
    2. لوحة الخلايا على polystyr معقمإيني البلازما الغاز فراغ تعامل أطباق زراعة الأنسجة (~ 5 × 10 6 خلايا لكل 100 ملم طبق القطر).
    3. زراعة خلايا في ظل ظروف متساهلة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي.
      ملاحظة: الشروط المتساهلة، التي تعرف بأنها ثقافة في 33-37 درجة مئوية في وجود IFN-γ، وتمكين التعبير مستقر من التحوير TAG تحور tsA58. على عكس الثقافات الأولية من الماوس PTEC الكلى، والتي لا البقاء على قيد الحياة أكثر من ممر واحد أو اثنين، مثقف BU.MPT في ظل ظروف متساهلة يمكن passaged إلى أجل غير مسمى.
      1. خلايا مرور ثلاث مرات على الأقل بعد ذوبان الجليد قبل استخدامها في تجربة.
        1. إلى خلايا مرور، إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين في صحن 100 ملم، واحتضان في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين بإضافة 10 مل من المتوسط ​​A. نضح خلايا منفصلة، ​​وتقسيم 1: 3-1: 5 في الجديدة 100 مم البوليسترين العقيمة الغاز فراغ البلازما تعامل TISSأطباق ثقافة رق. إضافة المتوسطة ولتبرزي حجم ما يصل الى ما مجموعه 10 مل لكل طبق 100 ملم.
    4. في إطار التحضير للاستخدام التجريبي كما الاستجابة الخلايا، تنمو الخلايا لالتقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 جو في ظل ظروف غير متساهلة (أي في 39 درجة مئوية في ظل غياب IFN-γ [المتوسط B تحتوي على 10٪ ضد / ت FBS]).
      ملاحظة: في ظل ظروف غير متساهلة، هو تحول دون التعبير عن التحوير TAG تحور tsA58 من قبل> 95٪، والخلايا BU.MPT تتصرف مثل الثقافات الأولية من PTEC الماوس الكلى.

2. إعداد خلايا أفكارك BU.MPT (بروتوكول 1)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا أفكارك، وstaurosporine كأسلوب من تحريض موت الخلايا المبرمج. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، يمكن أن تستخدم كمصدر للخلايا أفكارك، مع موت الخلايا المبرمج الناجم عن protoco موحدليرة سورية لهذا النوع من خلية معينة وطريقة الحث موت الخلايا المبرمج.

  1. بعد مرور على البوليسترين معقم البلازما الغاز فراغ أطباق زراعة الأنسجة قطرها 100 ملم تعامل، وتنمو خلايا BU.MPT إلى التقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 جو في ظل ظروف متساهلة (أي في 37 درجة مئوية في مستنبت وفي 10 مل لكل طبق بقطر 100 ملم)، كما هو موضح في القسم 1.2.3.
  2. شطف الخلية أحادي الطبقة ملتصقة ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وذلك باستخدام 10 مل لكل الشطف.
  3. لحث الخلايا التي تفرخ الخلايا في مستنبت B تحتوي على staurosporine، وغير الانتقائية بروتين كيناز المانع، في 1 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعات في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.
  4. نضح المتوسطة التي تحتوي على staurosporine تحتوي على "عائم" خلايا أفكارك أن يكون فصل من أحادي الطبقة. الطرد المركزي هذه الوسيلة لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، تجاهل طاف، ويغسل بيليه ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وإضافة بيليه إلى الخلايا التي تم جمعها في الخطوة التالية، 2.5.
  5. فصل الخلايا الملتصقة المتبقية من الخطوات 2.3 و 2.4 بإضافة 5 مم (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) EDTA في 1X كا 2 + - والمغنيسيوم 2 + خالية من DPBS في 1 مل لكل طبق لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة التي تحتوي على EDTA تحتوي على خلايا أفكارك منفصلة، ​​وتجميع خلايا منفصلة مع "عائم" خلايا أفكارك من الخطوة 2.4 في 15 مل أنبوب البوليسترين الطرد المركزي معقمة.
  6. غسل الخلايا أفكارك ثلاث مرات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج وإعادة تعليق في 10 مل من 1X الكالسيوم + 2 - والمغنيسيوم + 2 خالية من DPBS في غسل.
  7. بعد غسل الماضي، تعليق الخلايا أفكارك في الطازجة مستنبت B في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مليلتر قبل استخدامها لتحفيز خلايا المستجيب. بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا أفكارك غسلها في 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق في 1X DPBS لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل ثلاث مرات مع الثقافةمتوسطة B، قبل تعليق في مستنبت B.
  8. حسب الاقتضاء، تأكيد استحثاث موت الخلايا المبرمج من قبل التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من الخلايا أفكارك (أو عن طريق حجز بعض الخلايا لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا 6،9،10،15.
    انخفضت الخلايا أفكارك المبكرة لها أغشية الخلايا سليمة، وتظهر كما يوديد propidium (PI) خلايا-سلبية وannexin-V إيجابي من حجم الخلية (نسبة إلى خلايا قابلة للحياة): ملاحظة. في وقت متأخر خلايا أفكارك لها أغشية الخلايا غير سليمة، وتظهر على شكل خلايا إيجابية PI وannexin-V الإيجابي لانخفاض حجم الخلية. باستخدام البروتوكول الحالي، الاستعدادات نموذجية تحتوي على ~ 85٪ أفكارك المبكر و~ 15٪ خلايا أفكارك في وقت متأخر.
  9. إضافة خلايا أفكارك إلى BU.MPT خلايا المستجيب (بروتوكول 3) في نسبة أفكارك إلى الرد خلية من 1: 1، إما مباشرة أو بعد تثبيت الخلايا أفكارك لمدة 30 دقيقة مع 0.4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق في 1X DPBS .
    ملاحظة: أفكارك خلية التثبيت قبل التحفيز من المستجيبين ينبغيلا تؤثر على النتائج، ما لم ترجع إلى الإفراج عن وسيط للذوبان (الجدول 1) أحداث لاحظ الإشارة.

3. إعداد الخلايا الميتة BU.MPT (بروتوكول 2)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا الميتة، والتدفئة كوسيلة للتحريض النخر. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، يمكن أن تستخدم كمصدر للخلايا الميتة، مع نخر الناجم عن بروتوكولات موحدة لهذا النوع من خلية معينة وطريقة الاستقراء النخر.

  1. بعد مرور على البوليسترين معقم البلازما الغاز فراغ أطباق زراعة الأنسجة قطرها 100 ملم تعامل، وتنمو خلايا BU.MPT إلى التقاء في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 جو في ظل ظروف متساهلة (أي في 37 درجة مئوية في مستنبت وفي 10 مل لكل طبق)، كما هو موضح في القسم 1.2.3.
  2. شطف الخلية أحادي الطبقة ملتصقة ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة B، وذلك باستخدام10 مل لكل الشطف.
  3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 ملي EDTA في 1X الكالسيوم + 2 - والمغنيسيوم + 2 خالية من DPBS في 1 مل لكل طبق لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة التي تحتوي على EDTA تحتوي على خلايا منفصلة، ​​وإضافة تعليق الخلية إلى 15 مل أنبوب البوليسترين الطرد المركزي معقمة.
  4. غسل الخلايا ثلاث مرات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج وإعادة تعليق في 10 مل من الكالسيوم + 2 - والمغنيسيوم + 2 خالية من DPBS في غسل.
  5. بعد غسل الماضي، تعليق الخلايا في الطازجة مستنبت B في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مليلتر.
  6. حمل نخر عن طريق تسخين الخلايا إلى 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حمام مائي، vortexing لبلطف تعليق خلية كل 10 دقيقة.
  7. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. دوامة بلطف تعليق خلية كل 15 دقيقة.
  8. حسب الاقتضاء، تؤكد تحريض نخر التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من شمال شرقخلايا crotic (أو عن طريق حجز بعض الخلايا لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا 6،9،10،15.
    ملاحظة: خلايا نخرية لقد مزقت أغشية الخلايا، وتبدو وكأنها خلايا PI الإيجابي لزيادة حجم الخلية (نسبة إلى خلايا قابلة للحياة). باستخدام البروتوكول الحالي، الاستعدادات نموذجية تحتوي على ≥ الخلايا الميتة 95٪. بدلا من ذلك، قد يتم تأكيد تحريض نخر وفقدان سلامة الغشاء عن طريق التريبان تلطيخ الأزرق.

4. إعداد خلايا BU.MPT المستجيب (بروتوكول 3)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو محدد لخلايا BU.MPT كمصدر للخلايا المستجيب. بدلا من ذلك، خط خلية أخرى، أو ثقافة الخلية الأولية، ويمكن استخدام مثل خلايا المستجيب. قبل استخدام التجريبي، قد يكون ذلك حافزا هدوء بين عشية وضحاها من بروتوكولات موحدة داخل المختبر.

  1. زراعة خلايا BU.MPT في أطباق زراعة الأنسجة معقمة 100 ملم في ظل ظروف متساهلة في الثقافة المتوسطة وفي 10 مل لكل طبق حتى تحقيق ~85٪ التقاء.
  2. الثقافة نضح المتوسطة و، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع الثقافة المتوسطة (ب) في 10 مل لكل الشطف. المصل تجويع الخلايا بين عشية وضحاها من 18 إلى 24 ساعة في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 جو في ظل ظروف غير متساهلة (أي في 39 درجة مئوية في الثقافة المتوسطة (ب) في 10 مل لكل طبق)، كما هو موضح في القسم 1.2 0.4، من أجل حمل هدوء. بدلا من ذلك، تنمو الخلايا في مستنبت B بالإضافة إلى 10٪ (ت / ت) FBS في 39 درجة مئوية لمدة يوم واحد قبل خلايا الدم تجويع بين عشية وضحاها في مستنبت باء بدون FBS.
  3. تسمية طبق زراعة الأنسجة منفصلة من متكدسة خلايا BU.MPT لكل حالة تجريبية.
  4. تشمل ستة شروط التالية: التحفيز من المستجيبين BU.MPT قابلة للحياة مع عامل إما السيارة أو البشرة النمو (EGF) لمدة 15 دقيقة، بعد التعرض لمدة 30 دقيقة إما لا الخلايا، خلايا أفكارك، أو الخلايا الميتة.
    ملاحظة: التعرض إلى الخلايا الميتة إما أن تحفز أو تثبط مستوى النشاط من غيفين جزيء التأشير. من الأفضل الكشف عن التحفيز فوق خط الأساس منخفضة (على سبيل المثال، وغياب EGF)، في حين أن أفضل الكشف عن تثبيط من خط الأساس عالية (على سبيل المثال، وجود EGF). منذ تأثير التحفيز مع الخلايا الميتة هو بداهة معروف، فمن المستحسن لإجراء جميع الدراسات في كل من غياب وجود EGF.

5. تحفيز الخلايا المستجيب مع أفكارك وخلايا نخرية (بروتوكول 4)

  1. نضح مستنبت B من الأطباق وصفت مسبقا من هادئة (المصل المتعطشة) BU.MPT خلايا المستجيب (بروتوكول 3).
    ملاحظة: بعد الثقافة بين عشية وضحاها في ظل ظروف غير متساهلة، يجب أن خلايا BU.MPT تتصرف مثل الثقافات الأولية من PTEC الماوس الكلى.
  2. في صحن 100 ملم، إضافة 2 مل من واحد مما يلي: الثقافة المتوسطة ب (أي خلايا)؛ تعليق الخلية أفكارك في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 1)؛ أو تعليق خلية نخرية في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مليلتر طن ثقافة المتوسطة ب (بروتوكول 2).
    1. توزيع تعليق 2 مل من الخلايا الميتة بالتساوي على طبق 100 ملم، والحفاظ على الوقت بالنسبة لهم لتسوية إلى أدنى حد ممكن. ولتحقيق ذلك، توزيع القتلى قطرة تعليق خلية قطرة مع ماصة واسعة على سطح كامل من الأطباق خلية المستجيب. استخدام حجم 2 مل كحل وسط بين تقليل زمن الاستقرار وتجنب تراكمها من الخلايا الميتة.
      ملاحظة: استخدام تعليق الخلايا الميتة كما ينطوي على تحفيز عدد من الاعتبارات الخاصة، والتي تم وصفها أدناه بمزيد من التفصيل (الجدول 2 ومناقشة).
    2. تحقيق نسبة الخلايا القتلى إلى الرد من ~ 1: 1 وذلك بإضافة 2 مل من الخلايا الميتة في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مليلتر إلى طبق مم متكدسة 100، والذي يحتوي على ~ 10 × 10 6 خلايا. بدلا من ذلك، من أجل تحديد الجرعة واعتماد أي أحداث يشير لاحظ، تختلف نسبة القتلى إلى خلايا المستجيب باستمرار التخفيف التدريجي في عبادةلدى عودتهم المتوسط ​​باء من الايقاف الخلية الميتة التي أعدت في البروتوكولات 1 و 2.
  3. دوامة بلطف الأطباق، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي.
  4. بعد 30 دقيقة، وتحفيز الخلايا الرد مع أي مركبة أو 50 نانومتر EGF، وفقا لمرحلة ما قبل وضع العلامات على طبق الثقافة.
  5. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي.
  6. يغسل الخلايا الميتة عن طريق إضافة 5 مل من الجليد الباردة 1X DPBS، يحوم على طبق، والشفط السائل غسل. كرر ثلاث مرات.
  7. المكان على الفور الأطباق خلية الرد على الجليد لمزيد من المعالجة.
  8. إعداد الخلية لست]
    1. إعداد العازلة تحلل الخلية التي تحتوي على ما يلي: 1 × تريس مخزنة المالحة (TBS)، 10 ملي بيروفوسفات الصوديوم، و 0.5٪ ث / ت deoxycholate، 0.1٪ ث / ت SDS، 10٪ الجلسرين، و 25 ملم فلوريد الصوديوم.
      1. قبل مباشرة إلى الخلية تحلل، إضافة لما يلي في الترتيب الدقيق بالنظر في دائرة الهجرة والجنسيةتركيزات icated: مصغرة خالية من EDTA مثبط البروتياز كوكتيل (1 قرص لكل 10 مل من تحلل العازلة)، 10٪ (ت / ت) تريتون X-100، 1 ملم dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethanesulfonyl فلوريد (PMSF)، و 10 ملي orthovanadate الصوديوم.
    2. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة في صحن 100 ملم من خلايا المستجيب حفز حديثا على الجليد من الخطوة 5.7. تتخلص من الخلايا مع مكشطة الخلية، ونقل المحللة إلى ما قبل المبردة 1.5 microtubes مل. الحفاظ على أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. لست] يصوتن على الجليد مع 10 نبضات من 20 هرتز، أقل من ثانية واحدة في كل من المدة. تجنب خلق رغوة في واجهة الغاز / السائل، وهذا يمكن أن ارتفاع درجة حرارة العينات. تزج تماما التحقيق sonicator في microtubes تحتوي لست] قبل تبديل sonicator على، وتبديل sonicator من قبل إزالة المسبار من لست].
    4. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونقل supernatants إلى الطازج microtubes قبل المبردة، ومخزن في -70 درجة مئوية.
    5. أداء الكهربائي للهلام وimmunoblotting على supernatants من لست]، كما هو موضح سابقا 6،9،10،15.

6. منع المباشر البدني الاتصال بين الأهداف والمستجيبين باستخدام البولي غشاء شبه منفذ (بروتوكول 5)

  1. إعداد خلايا المستجيب BU.MPT وفقا لبروتوكول 3، مع استثناء واحد؛ تنمو الخلايا في نسيج الثقافة البوليسترين العقيمة معاملة مجموعات 12-جيدا.
  2. في آبار مختارة، وضع نظام دعم منفذ يحتوي على غشاء البولي 0.4 ميكرون لمنع التفاعل الجسدي بين الخلايا الميتة والرد. تشمل آبار المراقبة بدون غشاء بنفس التجربة.
  3. نضح مستنبت B من الآبار التجريبية من خلايا BU.MPT الرد المتعطشة للمصل.
  4. اتبع بروتوكول 4 لتحفيز خلايا الرد مع الخلايا أفكارك أو الميتة، مع إجراء التعديلات التالية:
    1. لكل بئر من 1المجموعة 2 بشكل جيد، إضافة 0.1 مل من واحد مما يلي: الثقافة المتوسطة ب (أي خلايا)؛ تعليق الخلية أفكارك في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 1)؛ أو نخرية تعليق خلية في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مل في مستنبت ب (بروتوكول 2).
      ملاحظة: كما جيدا متموجة من مجموعة ال 12 أيضا يحتوي ~ 0.5 × 10 6 خلايا، إضافة 0.1 مل من الخلايا الميتة في ~ 5 × 10 6 خلايا لكل مل ينتج نسبة القتلى إلى الرد خلية من ~ 1: 1.
    2. إلى الآبار التي تحتوي على نظام دعم نفاذة، إضافة الخلايا الميتة على رأس الغشاء البولي 0.4 ميكرون داخل منظومة الدعم قابلة للاختراق، لذلك ليس هناك تفاعل المادي المباشر بين الخلايا الميتة والرد.

7. تثبيط البلعمة مع مثبط حركة الخلايا D (بروتوكول 6)

  1. إعداد خلايا المستجيب BU.MPT وفقا لبروتوكول 3.
  2. إعداد هيكل الخلية المانع مثبط حركة الخلايا D في dimethYL سلفوكسيد (DMSO) في 4 ملغ / مل (1000 ×). إضافة أطباق لمرحلة ما قبل المسمى الخلايا المستجيب BU.MPT إما 10 ميكرولتر من السيارة (DMSO) أو 10 ميكرولتر من مثبط حركة الخلايا D لتحقيق تركيز النهائي من 4 ميكروغرام / مل في 10 مل من مستنبت B.
    ملاحظة: في هذه تركيز مثبط حركة الخلايا D، البلعمة من قبل خلايا BU.MPT وخط خلية بلعم كان مستعمل من قبل ≥90٪ 9،10.
  3. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ (ت / ت) CO 2 الغلاف الجوي.
  4. اتبع بروتوكول 4 لتحفيز خلايا الرد مع الخلايا أفكارك أو الميتة.
  5. حسب الاقتضاء، تأكيد تثبيط البلعمة من الخلايا الميتة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام إعداد منفصل من الخلايا الميتة والرد (أو خلايا محفوظة لهذا الغرض)، كما هو موضح سابقا 9،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الشكل 1، ونحن نقدم التخطيطي تصور توقيت والحرجة الخطوات المتبعة في إعداد الخلايا أفكارك (بروتوكول 1) والخلايا الميتة (بروتوكول 2)، وتحفيز خلايا الرد مع تعليق من الخلايا أفكارك والميتة (بروتوكول 4).

في الشكل 2، ونحن نقدم نتائج ممثل تبين تأثير الخلايا أفكارك على الفسفرة من اثنين من الأشكال الإسوية من السيرين، ثريون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ونحن نقدم هنا بروتوكول لوصف أحداث الإشارات بين الخلايا التي يسببها في خلايا قابلة للحياة بعد تعرضها لالخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج، أو غيرها من موت الخلايا الأشكال. ويؤكد البروتوكول على آليات متعددة التي التعرض للخلايا أفكارك يمكن أن تعدل مسارات الإشارات بين الخلايا داخل الخلايا المستجيب قابلة للحياة. وتشمل هذه الآليات: التفاعل (عن طريق سد الجزيئات أو المحددات على سطح الخلية الميتة أو الحويصلات سقيفة وmicrovesicles، وغالبا ما يطلق الهيئات أفكارك) مع مستقبلات معينة على الخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل ، كليا أو جزئيا ، من خلال الأموال المؤسسية من الدكتور خوسيه أ. أرودا وقسم أمراض الكلى ، جامعة إلينوي في شيكاغو (إلى جي إس إل) ؛ وتمويل من قسم الطب بجامعة ماكجيل ومعهد البحوث التابع للمركز الصحي بجامعة ماكجيل (إلى جي آر )

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<مواد زراعة الخلايا القوية<> / قوية >
DMEM ، 1x مع [4.5 جم / لتر] الجلوكوز ، &# 671 ؛ -الجلوتامين والصوديوم البيروفاتMediatech (ماناساس ، فيرجينيا)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II ، مصل الأبقار الجنينيGE Healthcare (لوجان ، يوتا)SH30066.03تضيف 10٪ (حجم / حجم)   ؛ إلى وسط الاستزراع A
البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين ، 100xLife Technologies (Grand Island ، NY)10378-016تضيف 100 وحدة / مل إلى وسائط الثقافة A و B
& gamma ؛ - إنترفيرون ، مؤتلف الفأر ، من الإشريكية القولونية < / em>كالبيوكيم ، ميليبور (بيليريكا ، ماساتشوستس)407303إضافة 10 وحدات / مل إلى وسط الاستزراع أطباق
معالجة بزراعة أنسجة البوليسترين فالكون ، كورنينج غير الحرائق(دورهام ، نورث كارولاينا)353003معقمة ،
أنابيب الطرد المركزي فالكون البوليسترين بقطر 100 مم ، القاع المخروطيCorning (دورهام ، نورث كارولاينا)352095معقمة ، 15 مل
Trypsin-EDTA ، 0.05٪ ، GibcoFisher (Waltham ، MA)25300062معقمة ، 100 مل
< قوي > الاسم < / قوي >< قوي > الشركة < / strong > catalog < / strong > التعليقات < / قوي>
<قوي>المواد الكيميائية والمثبطات< / قوي >
Staurosporine ، من Streptomyces sp< / em>.استخدام Sigma (سانت لويس ، ميزوري)S4400في [1 & mu; جم / مل] لمدة 3 ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج
عامل نمو البشرة (EGF) ، [1 مجم / مل]استخدام Millipore (Billerica ، MA)EA140عند 50 نانومتر لتحفيز الخلايا المستجيبة
UltraPure ، 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0Life Technologies (Grand Island ، NY)15575-038استخدم 5 ملي مولار لفصل الخلايا الملتصقة
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪MP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا)91691049لتلوين
الخلايا الميتةمحلول بارافورمالدهايد ، 4٪ في DPBSAffymetrix (سانتا كلارا ، كاليفورنيا)19943يستخدم 0.4٪ (حجم / حجم) في 1x DPBS لتثبيت الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، 1x ، GibcoLife Technologies (Grand Island ، نيويورك)14040133محلول المخزون
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، Ca2 + < / sup>- و Mg2 + < / sup> خالي ، 1x ، GibcoLife Technologies (Grand Island ، نيويورك)14190367محلول مخزون
Cytochalasin D ، 4 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، من Zygosporium mansonii < / em >Sigma (سانت لويس ، ميزوري)C8273يستخدم في [4 & mu ؛ جم / مل] لتثبيط البلعمة
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما (سانت لويس ، ميزوري)مذيب D2650للسيتوكالاسين D
[header]
< قوي > مكونات محلول ملحي لتحلل الخلية < / قوي >
محلول ملحي مخزن (TBS) ، 10x ، درجة الحموضة 7.4BioRad (هرقل ، كاليفورنيا)1706435للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
بيروفوسفاتالصوديومسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) 22136810 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل
الخلايا ديوكسي كولات الصوديومسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري)D67500.5٪ وزن / حجم للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري)L3771 & nbsp ؛0.1٪ وزن / حجم للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
الجلسرينسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري)G551610٪ للمخزن المؤقت لتحلل
الخلايا فلوريد الصوديومسيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري) 45002225 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
كوكتيل مثبط للبروتياز خال من EDTA قرص كوكتيلدقيق دقيق خال من EDTA Roche Diagnostics (إنديانابوليس ، إنديانا)4693159001للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، 1 قرص لكل 10 مل من المخزن المؤقت
Triton X-100Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO)T878710٪ للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا)11DTT000051 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) MPBiomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا)48002631 ملي مولار للمخزن المؤقت لتحلل الخلايا
أورثوفانديت الصوديومMP Biomedicals (سانتا آنا ، كاليفورنيا)215966410 ملي مولار للمخزن
المؤقت لتحلل الخلايا<قوي>الاسم<قوي>الشركةCatalogComments
Equipment
Sorvall T6000B جهاز طردمركزي Du Pont (ويلمنجتون ، DE)T6000B
فيشر Tissuemat ، حمام مائيفيشر (والثام ، ماساتشوستس)
جهاز الصوتيات (سونيكاتور) ، موديل 100فيشر (والثام ، ماساتشوستس)
<قوي >متنوع< / قوي >
غرفة عد الخلايا ، نيوباورهوكسلي (لانسينج ، ساسكس ، المملكة المتحدة)AC2000
Annexin V-FITC Detection Ptosis Kit IIMillipore (Billerica ، MA)CBA059ل PI و Annexin V تلطيخ لتحديد مرحلة موت الخلايا المبرمج
أنابيب Eppendorf microcntrifuge ، 1.5 ملSigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري)T9661
دعم نفاذية Transwell ، 0.4 & mu ؛ م غشاء البولي كربوناتكورنينج (كورنينج ، نيويورك)3413معقم ، بوليسترين ، ثقافة الأنسجة المعالجة
<قوية>الاسم< / قوي><قوي>الشركة< / قوي><قوي>كتالوج<قوي>تعليقات
><قوي>الأجسام المضادة
فوسفو جليكوجين سينسيز كيناز -3 &alpha ;/&beta ؛ (GSK-3 &alpha ؛ /&beta ؛) (Ser21/9) ، تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة متعددة النسيلة9331الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة
جلسرالديهايد -3-فوسفات نازعة هيدروجين (GAPDH) أحادي النسيلة ((14C10) ) تقنيةإشارات الخلية2118أجسام مضادة أحادية النسيلة للأرانب
قرص

المراجع

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GSK3
تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.