باستخدام الأشعة السينية البلورات، الفيزياء الحيوية، وفحوصات وظيفية لتحديد آليات الحكم تي خلية مستقبلات الاعتراف السرطان المستضدات

ملخص

هنا ، نصف الطرق التي نستخدمها عادة في المختبر لتحديد كيف تحكم طبيعة التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية ومستضدات الورم ، التي تقدمها مستضدات الكريات البيض البشرية ، وظائف الخلايا التائية ؛ تشمل هذه الطرق إنتاج البروتين ، وعلم البلورات بالأشعة السينية ، والفيزياء الحيوية ، وتجارب الخلايا التائية الوظيفية.

الملخص

من المعروف أن >jove_content<الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا البشرية CD8 + CD8 + (CTLs) تلعب دورا مهما في السيطرة على الورم. من أجل تنفيذ هذه الوظيفة ، يجب أن يتعرف مستقبل الخلايا التائية المعبر عنه على سطح الخلية (TCR) وظيفيا على الببتيدات المشتقة من الورم المقيد بمستضد الكريات البيض البشرية (HLA). ومع ذلك ، فقد أظهرنا نحن وآخرون أن معظم TCRs ترتبط بشكل غير مثالي بمستضدات الورم. يمكن أن يساعد الكشف عن الآليات الجزيئية التي تحدد هذا الاعتراف الضعيف في تطوير علاجات مستهدفة جديدة تتحايل على أوجه القصور هذه. في الواقع ، لم تكن العلاجات الحالية التي تفتقر إلى هذا الفهم الجزيئي فعالة عالميا. هنا ، نصف الطرق التي نستخدمها عادة في المختبر لتحديد كيفية تحكم طبيعة التفاعل بين TCRs و pHLA لوظائف الخلايا التائية. تشمل هذه الطرق توليد TCRs القابلة للذوبان و pHLA واستخدام هذه الكواشف لعلم البلورات بالأشعة السينية ، والتحليل الفيزيائي الحيوي ، وتلوين الخلايا التائية الخاصة بالمستضد باستخدام معددا من pHLA. باستخدام هذه الأساليب ومسترشدة بالتحليل الهيكلي ، من الممكن تعديل التفاعل بين TCRs و pHLA ثم اختبار كيفية تأثير هذه التعديلات على التعرف على مستضد الخلايا التائية. ساعدت هذه النتائج بالفعل في توضيح آلية التعرف على الخلايا التائية لعدد من مستضدات السرطان ويمكن أن توجه تطوير الببتيدات المعدلة و TCRs المعدلة لعلاجات السرطان الجديدة.

المقدمة

وكانت الأشعة السينية البلورات، وستظل، وهي تقنية قوية للغاية لفهم طبيعة التفاعلات يجند مستقبلات. من خلال وضع تصور هذه التفاعلات بالتفصيل الذري، وليس فقط هل من الممكن الكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم العديد من العمليات البيولوجية، ولكن من الممكن أيضا أن يغير مباشرة واجهات الاتصال لفائدة علاجية. إلى جانب تقنيات مثل الرنين مأكل السطح والكالوري المعايرة متساوي الحرارة (على سبيل المثال لا زوجين)، ويمكن بعد هذه التعديلات سيتم تحليلها biophysically لتقييم تأثير مباشر على تقارب ملزمة، حركية التفاعل، والديناميكا الحرارية. وأخيرا، من خلال إجراء التجارب وظيفية على أنواع الخلايا ذات الصلة، صورة مفصلة عن تأثير الجزيئية والوظيفية من التعديلات على التفاعلات مستقبلات يجند يمكن استخلاصها، وتوفير المعلومات الآلية محددة للغاية. عموما، هذه الأنواع من طرق تقديم صورة قرار الذرية تمكين ردع mination لكيفية النظم البيولوجية العمل، مع الآثار المصاحبة للتقدم التشخيصية والعلاجية.

مختبرنا يستخدم بشكل روتيني هذه التقنيات لدراسة المستقبلات التي تتوسط الإنسان مناعة الخلايا التائية لمسببات الأمراض والسرطان، في المناعة الذاتية، وخلال زرع. هنا، ونحن نركز على CD8 ⁺ استجابة خلايا T الإنسان بالسرطان، بوساطة التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستضد الكريات البيض البشرية (HLA) -restricted الببتيدات المستمدة من الورم (pHLA). هذا مهم جدا لأنه، على الرغم من أن خلايا CD8 ⁺ T قادرة على استهداف الخلايا السرطانية، نحن وغيرنا قد أظهرت في وقت سابق ان TCRs المضادة للسرطان ربط الحالات النادرة إلى pHLA المشابهة لها ^{1، 2.} وهكذا، وقد حاول العديد من المختبرات لتغيير إما TCR ^{3، 4، 5} أو الببتيد يجند ^6،الطبقة = "XREF"> ^{7، 8،} وذلك لزيادة المناعة وتحسين الخلايا السرطانية المستهدفة. ومع ذلك، هذه الأساليب ليست فعالة دائما، ويمكن أن يكون لها آثار جانبية خطيرة، بما في ذلك بعيدا عن الهدف السميات ^{4 و 9 و 10.} وإجراء مزيد من البحوث استكشاف الآليات الجزيئية التي تحكم الاعتراف تي خلية من مستضدات السرطان أمرا حيويا للتغلب على هذا النقص.

في هذه الدراسة، وركزنا على ردود ضد خلايا سرطان الجلد ذاتي من قبل خلايا CD8 ⁺ T معينة للحصول على جزء من المستضد تمايز الخلايا الصباغية بروتين سكري 100 (GP100)، GP100 _280-288، التي قدمها HLA-A * 0201 (الأكثر شيوعا -expressed الطبقة pHLA الإنسان الأول). وقد تم هذا المستضد هدفا درس على نطاق واسع لعلاج مناعي سرطان الجلد، وقد تم تطويره ليصبح ما يسمى الببتيد "heteroclitic" فيه حمض أميني أساسي محل ألانينفي موقف مرساة 9 إلى تحسين pHLA الاستقرار ^11. وقد استخدم هذا النهج لتعزيز تحريض CTLs-سرطان الجلد على رد الفعل في المختبر، وقد استخدمت بنجاح في التجارب السريرية ^12. ومع ذلك، يمكن إدخال تعديلات على بقايا الببتيد لها آثار لا يمكن التنبؤ بها على خصوصية خلايا T، ويتجلى ذلك في فعالية الفقيرة من معظم الببتيدات heterolitic في العيادة ^{6 و 13.} وبالفعل، شكل heteroclitic آخر من GP100 _280-288، الذي بقايا الببتيد تم استبداله باللاعب Glu3 لعلاء، ألغى الاعتراف من قبل السكان بولكلونل من GP100 _280-288 خلايا T -specific ^{14 و 15.} لقد أثبتنا سابقا أن حتى تغييرات طفيفة في بقايا الببتيد مرساة يمكن أن يغير إلى حد كبير الاعتراف تي خلية بطرق غير متوقعة ^{6، 16.} وهكذا، ركزت الدراسة على بناءيمكن جي صورة أكثر تفصيلا لكيفية تعترف خلايا CD8 ⁺ T GP100 وكيفية إدخال تعديلات على التفاعل بين TCRs وpHLA تؤثر هذه الوظيفة.

هنا، ولدت لنا نقية للغاية، أشكال قابلة للذوبان من اثنين TCRs محددة لGP100 _280-288 قدمها HLA-A * 0201 (A2-YLE)، فضلا عن الأشكال الطبيعية وتغير من pHLA. واستخدمت هذه الكواشف لتوليد بلورات البروتين لحل التركيب الذري الثلاثي من TCR البشري في مجمع مع شكل heteroclitic من A2-YLE، فضلا عن اثنين من pHLAs متحولة في شكل unligated. ثم استخدمنا منهج المسح الببتيد لتوضيح تأثير بدائل الببتيد على TCRs عن طريق أداء في عمق التجارب الفيزيائية الحيوية. وأخيرا، فإننا ولدت CD8 + خط تي خلية المعدلة وراثيا، وإعادة برمجتها للتعبير عن واحدة من TCRs A2-مط محددة، من أجل إجراء تجارب وظيفية لاختبار تأثير البيولوجي من مختلف التعديلات الببتيد. وهذه البيانات تظهر أن مودي حتىمواشفات إلى الببتيد المخلفات التي هي خارج عزر ملزمة TCR يمكن أن يكون لا يمكن التنبؤ بها أثره على بقايا الببتيد المجاورة التي تلغي TCR ملزمة والاعتراف تي خلية. وتمثل النتائج التي توصلنا إليها في المثال الأول من الآليات الهيكلية الكامنة وراء الاعتراف تي خلية من هذا الهدف العلاجي مهم لسرطان الجلد.

البروتوكول

1. بروتين التعبير

1. جعل يبني الجينات لتوليد TCRs القابلة للذوبان وpHLAs، كما هو موضح بالتفصيل سابقا ^{17 و 18.} تصميم كل بناء مع 5 "BamH1 و3" موقع EcoR1 قيود على الإدراج في ناقلات pGMT7.
2. تحويل كولاي رشيد (DE3) pLysS مع ناقل البلازميد المستمدة pGMT7 التي تحتوي على تسلسل ترميز البروتين من الفائدة التي يحتضنها 1 ميكرولتر من 50-200 نانوغرام / ميكرولتر البلازميد مع 5 ميكرولتر من القولونية لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ، 2 دقيقة في 42 درجة مئوية، و 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ولوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على صفيحة أجار LB تستكمل مع 50 ملغ / لتر كربنيسيلين.
3. اختيار المستعمرات الفردية وينمو بمعدل 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة في 30 مل من وسائل الاعلام الطباع (16 جم / لتر تريبتون، 16 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 5 ز / L هونج كونج ₂ O ₄₎ تستكمل مع 100 كربنيسيلين ميكرومتر حتى تعليق يصل في دي البصريةnsity (OD ₆₀₀₎ من بين 0.4 و 0.6.
4. حث إنتاج البروتين في 5 مل قسامة من خلال تقديم 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لمدة 3 ساعات. تبقي 20 ميكرولتر من تعليق مع وبدون تحريض لالكهربائي دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد هلام تحليل (SDS-PAGE) وصمة عار على هلام.
5. إضافة الثقافات بداية إلى 1 لتر من الطرق والجسور تستكمل مع 100 كربنيسيلين ميكرومتر وتنمو الخلايا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3 حتى يصل تعليق على OD ₆₀₀ بين 0.4 و 0.6.
6. حمل تعبير البروتين لمدة 3 ساعات مع 0.5 ملي IPTG. الطرد المركزي الخلايا لمدة 20 دقيقة في 3000 x ج وتخلصي من طاف بعناية.
7. حل بيليه في 40 مل من تحلل العازلة (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 و 10 ملي كلوريد المغنيسيوم، MgCl _2، 150 مم كلوريد الصوديوم، والجلسرين 10٪)، يصوتن على الجليد على السلطة مدة 30 دقيقة في 60٪ باستخدام 2 ثانية فاصل ويحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة مع 0.1 جم / لتر الدناز.
8. علاج سوسالتقاعد التي تحتوي على البروتينات في شكل هيئات إدراج (IB) مع 100 مل من غسل العازلة (0.5٪ تريتون X-100 و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA).
9. الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، و8،000 x ج وتخلصي من طاف بعناية. إعادة تعليق بيليه في 100 مل من العازلة إعادة تعليق (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1)، الطرد المركزي كما كان من قبل في 8000 x ج، وتخلصي من طاف بعناية.
10. أخيرا، حل بيليه في 10 مل من العازلة غوانيدين (6 M غوانيدين و 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1، و 100 مم كلوريد الصوديوم) وقياس تركيز البروتين في 280 نانومتر باستخدام مطياف.

2. pHLA وTCR Refolding

1. لrefolds pHLA، مزيج 30 ملغ من HLA-A2 (أو HLA-A2 مع علامة البيوتين) المعرفين، 30 ملغ من β2m وسطاء، و 4 ملغ من الببتيد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي في الحجم النهائي من 6 مل من العازلة غوانيدين تستكمل مع dithiothreitol 10 ملي(DTT).
2. بدء refolding البروتين عن طريق تمييع المزيج السابق في 1 لتر من منطقة عازلة HLA refold قبل المبردة (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 و 400 مم L-أرجينين، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1 و 6 ملي cysteamine، و 4 ملي cystamine).
3. مغادرة HLA refold اثارة في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ومن ثم نقلها إلى 12.4 كيلو دالتون MWCO (الوزن الجزيئي قطع) أنبوب غسيل الكلى وdialyze مرتين لمدة 24 ساعة مقابل 20 L 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1.
4. لrefolds TCR، مزيج 30 ملغ من TCR سلسلة α وسطاء و 30 ملغ من TCR سلسلة β آي بي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي في 6 مل من العازلة غوانيدين تستكمل مع 10 ملي DTT.
5. بدء refolding البروتين عن طريق تمييع الخليط TCR التشويه والتحريف في 1 لتر من منطقة عازلة TCR refold قبل المبردة (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1؛ 2.5 M اليوريا، 2 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.1 و 6 ملي cysteamine، و 4 ملي cystamine) لمدة 3 ح.
6. نقل refold في أنبوب غسيل الكلى 12.4 كيلو دالتون MWCO وdialyze مرتين لمدة 24 ساعة مقابل 20 L 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1.
7. تصفية كل من pHLA أو TCR المرجعالذين تتراوح أعمارهم بين باستخدام فلتر الغشاء 0.45 ميكرون للخطوات تنقية.

3. تنقية من البروتين سريع اللوني السائل (FPLC)

1. تحميل إعداد refold تصفيتها (إما pHLA أو TCR) على 7.9 مل، 50 ميكرومتر أنيون العمود راتنج التبادل قبل معايرتها مع 20 مل من 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1 على نظام اللوني مرنة وبديهية.
2. أزل البروتين في 5 مل / دقيقة مع التدرج الملح (كلوريد الصوديوم 0-500 ملم في 10 ملم تريس، ودرجة الحموضة 8.1، أكثر من 8 مجلدات عمود) وجمع الكسور 1 مل.
3. تحليل الكسور المقابلة لبروتين من الاهتمام من قبل SDS-PAGE، تجميع الكسور التي تحتوي على البروتين من الفائدة معا، والتركيز عليهم إلى 500 ميكرولتر مع 10 كيلو دالتون MWCO 20 أو 10 كيلو دالتون MWCO 4 بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4000 x ج ، التخلص من التدفق من خلال.
4. تحميل الاستعدادات البروتين تتركز في 2 مل حقن حلقة على 24 مل حجم العمود الاستبعاد اللوني قبل معايرتها مع التطبيقعازلة ropriate شطف: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، مسح ميزانية الأسرة (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 3.4 ملي EDTA، و 0.005٪ السطحي)، أو عازلة الكريستال (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.1، و 10 ملي كلوريد الصوديوم ).
5. أزل البروتينات في معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة أكثر من 1 عمود الحجم؛ جمع 1 كسور مل تحتوي على البروتين من الفائدة التحقق من SDS-PAGE.
   ملاحظة: استخدمت هذه الأساليب لتوليد القابلة للذوبان PMEL17 TCR وGP100 TCRs، وكذلك كل من pHLAs المستخدمة في هذه الدراسة: HLA-A * 0201 مع YLEPGPVTA (A2-YLE)، YLEPGPVTV (A2-مط-9V)، ALEPGPVTA (A2-YLE-1A)، YLAPGPVTA (A2-مط-3A)، YLEAGPVTA (A2-مط-4A)، YLEPAPVTA (A2-مط-5A)، YLEPGAVTA (A2-مط-6A)، YLEPGPATA (A2-YLE- 7A)، أو YLEPGPVAA (A2-مط-8A).

4. سطح بلازمون الرنين (SPR) تحليل

1. لتحليل ملزم التوازن أو تحليل الحرارية باستخدام نظام تحليل التفاعل الجزيئي مجهزة CM5 رقاقة الاستشعار ^19.
2. تفعيل شريحة CM5 التي كتبها fخوار 1: مزيج 1 من 100 ملي N-hydroxysuccinimide (NHS) و 400 ملي 1-إيثيل-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) لمدة 10 دقيقة بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة، وعند 25 درجة C.
3. تحميل ما يقرب من 5000 وحدة استجابة (RU) من streptavidin (110 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل في 10 ملي خلات، ودرجة الحموضة 4.5) من خلال التساهمية ربط على سطح رقاقة في جميع خلايا تدفق أربعة واستخدام 100 ميكرولتر من 1 M إيثانولامين هيدروكلوريد لإيقاف أي مجموعة رد الفعل المتبقية.
4. زوجان حوالي 500-600 RU من pHLA، في ~ 1 ميكرومتر في المخزن التجاري (المقدمة من قبل الشركة المصنعة)، إلى رقاقة الاستشعار CM5 بمعدل تدفق بطيء من 10 ميكرولتر / دقيقة لضمان توزيع منتظم على سطح رقاقة.
5. تشبع سطح رقاقة مع 1 البيوتين ملم في المخزن التجاري (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) لمدة 60 ثانية.
6. حقن عشرة التخفيفات المسلسل من TCRs القابلة للذوبان أكثر من وتدفق الخلايا ذات الصلة بمعدل تدفق عال من 30 ميكرولتر / دقيقة عند 25 درجة مئوية.
7. حساب ثابت ملزم التوازن(K _D (E)) القيم باستخدام نوبة غير الخطية منحنى (ذ = (P1x) / (P2 + س)) ^20.
   ملاحظة: وحدات ذ = ردا على ذلك، س = تركيز المحلل، P1 = ص _{كحد أقصى،} P2 = K _D.
8. لتحليل حركية افتراض 1: انجميور 1 ملزمة واحتواء البيانات باستخدام خوارزمية العالمية لتناسب في حزمة البرامج ^2.
9. أداء الديناميكا الحرارية التجارب بتكرار هذه الطريقة في درجات الحرارة التالية: 5 درجة مئوية و 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية و 25 درجة مئوية، و 30 درجة مئوية ^(19).
10. استخدام القيم K _D يحددها SPR عند درجات حرارة مختلفة لحساب ΔG ° باستخدام المعادلة الحرارية القياسية (ΔG ° = -RTlnK _D) ^19.
    ملاحظة: R = الغاز ثابت، T = درجة الحرارة في K، LN = سجل الطبيعية.
11. حساب المعلمات الحرارية وفقا للمعادلة جيبس-هيلمهولتز (ΔG ° = ΔH - TΔS درجة) ^19.
12. رسم الطاقات ملزم الحرة، ΔG درجة (ΔG ° = -RTlnK _D)، ضد الحرارة (K) باستخدام الانحدار غير الخطية لتناسب المعادلة ثلاثة معلمة (ذ = ΔH + ΔCp * (س 298) -x * ΔS- س * ΔCp * قانون الجنسية (خ / 298)) ^19.
    ملاحظة: ص = درجة الحرارة في K، س = ΔG درجة.

5. متساوي الكالوري المعايرة (ITC)

1. إجراء تجارب مركز التجارة الدولية باستخدام المسعر المعايرة متحاور. ضخ 30 ميكرومتر pHLA في الخلية المسعر وتحميل 210 ميكرومتر ذوبان TCR في حقنة. استخدام الظروف العازلة التالية: 20 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) التي تحتوي على 150 ملي مول كلوريد الصوديوم.
2. أداء 20 الحقن TCR، كل من حجم 2 ميكرولتر. حساب ΔH وK _D باستخدام البرامج التحليلية.

6. بلورة وجمع البيانات الحيود، ونموذج صقل

1. أداء التجارب تبلور باستخدام الروبوت التبلور.
2. بلورات من فبأو نشرها في 18 ° C عبر تقنية هبوط يجلس في لوحة 96-جيدا مع خزان يحتوي على 60 ميكرولتر من العازلة تبلور (الأم الخمور) ^21.
3. تركيز pHLA قابل للذوبان إلى ما يقرب من 10 ملغ / مل (0.2 ملم) في المخزن وضوح الشمس من خلال الدوران في 3000 x ج في 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع المكثف الطرد المركزي.
4. لهياكل شارك معقدة، خلط TCR وpHLA في نسبة 1: 1 المولي للحصول على حل البروتين في ما يقرب من 10 ملغ / مل (0.1 ملم).
5. إضافة 200 NL من pHLA وحده، أو 1: 1 المولي مزيج نسبة TCR وpHLA، إلى 200 NL كل خزان حل من الشاشة بلورة باستخدام الروبوت تبلور ويسجل لبلورات تحت المجهر بعد 24 ساعة، 48 ساعة، 72 ح، ثم مرة واحدة في الأسبوع.
6. البلورات الحصاد عن طريق تركيب عليها يدويا في البرد حلقات تحت المجهر والبرد تبريد لهم من قبل غمر وتخزينها في النيتروجين السائل (100 K).
   ملاحظة: تحميل البلورات تأخذ قليلا من الاستشارية لاستعراض المشترياتتايس، والبت فيها بلورات هي جيدة بما فيه الكفاية لجمع البيانات يأتي مع الخبرة. وكقاعدة عامة من الإبهام، وأكبر وأكثر انتظاما وضوح الشمس، كان ذلك أفضل.
7. جمع البيانات في تيار من غاز النيتروجين عند 100 ك.
   ملاحظة: تم الحصول عليها هذه البيانات في مصدر الضوء الماس (DLS) منشأة العلوم السنكروترون الوطني في المملكة المتحدة.
8. تحليل البيانات عن طريق تقدير شدة انعكاس مع xia2 باستخدام كل MOSFLM ²² و XDS حزم ^23، ومن ثم توسيع نطاق البيانات مع SCALA أو بلا هدف ⁽²⁴⁾ وحزمة CCP4 ^25.
9. حل الهياكل مع استبدال الجزيئي باستخدام PHASER ^26.
10. ضبط النموذج مع أبله ²⁷ و صقل النموذج مع REFMAC5 ^28.
11. إعداد رسوم بيانية مع PYMOL ^29.
12. حساب الاتصالات باستخدام "الاتصال"برنامج في حزمة CCP4. استخدام 4 قطع الامدادات عن فان دير فال الاتصالات و3.4 Å قطع للروابط هيدروجينية والجسور الملح.
13. حساب التكامل سطح باستخدام برنامج "SC" في حزمة CCP4.
14. حساب زاوية عبور مجمع TCR-pHLA، كما هو موضح ^30.
    ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، تم إيداع البيانات انعكاس والإحداثيات نموذج النهائية مع قاعدة البيانات PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V فوسفات: 5EU6، A2-YLE PDB: 5EU3، A2-مط-3A PDB: 5EU4، وA2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

النتائج

استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، ولدت لنا TCR للذوبان (الجدول 1) والجزيئات pHLA لإجراء تحليلات متعمقة الجزيئية الاعتراف GP100 _280-288 قبل خلايا CD8 ⁺ T. تم استخدام E. نظام التعبير القولونية المعدلة لتوليد غير قابلة للذوبان وسطاء لكل سلسلة منفصلة من كل من TCRs (α و β سلاسل) وpHLAs (سلسلة α و β2m). هذا الأسلوب له ميزة كونها رخيصة نسبيا وسهلة لإنشاء ويولد عائدات كبيرة من البروتين (100-500 ملغم / لتر للثقافة). أيضا، فإن البروتينات غير قابلة للذوبان في حالة مستقرة للغاية إذا المخزنة في -80 درجة مئوية. نحن ثم استخدم refolding وتنقية تقنية راسخة لتوليد الوظائف، متجانسة، بروتينات قابلة للذوبان. هذه الطريقة مفيدة لتوليد البروتينات للتجارب الفيزيائية الحيوية والهيكلية، والخلوية، وكذلك المواد الكيميائية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص أو العلاجات.

-together.within الصفحات = "1"> هنا، استخدمنا هذه البروتينات لأداء ألانين تجارب الطفرات المسح الضوئي عبر العمود الفقري الببتيد وتقييمها TCR تقارب ملزمة باستخدام مأكل سطح الرنين (SPR) تجارب (الجدول 2). وكان هذا الاختبار أثبت التي المخلفات في الببتيد أهم لTCR ملزمة. يحلل عالية الدقة من الانتماءات الملزمة باستخدام هذه التقنية مفيدة للغاية لتحديد الآليات البيولوجية التي تتحكم في تفاعلات البروتين البروتين، وكذلك لتحليل تقارب ملزمة من الجزيئات العلاجية.

نحن ثم تبلورت على بعد سرطان الجلد محددة قابلة للذوبان TCR (PMEL17 TCR) في مجمع مع pHLA المستمدة الورم المعدلة (A2-مط-9V) للتحقيق في وضع ملزم في قرار الذري (الشكلان 1 و 2 والجدول 3). وتوفر هذه التجارب رؤية مباشرة من واجهة ربط بين جزيئين، providinز المعلومات الأساسية حول المبادئ الأساسية التي تحكم التفاعل. أجرينا كذلك تحليل الحرارية من التفاعل باستخدام كل SPR ومركز التجارة الدولية، وكشف عن المساهمات النشطة التي مكنت ملزمة (الشكلان 3). وتم دعم هذه التحليلات أبعد من ذلك وصفا عالية الدقة من البصمة اتصال بين اثنين من البروتينات (الشكل 4 والجدول 4).

نحن ثم حل هياكل جزيئات pHLA unligated، وتقديم أشكال متحولة من الببتيد، وكشف عن أن التحول الجزيئي يمكن أن يفسر لماذا بعض الطفرات ألغى TCR ملزمة (الشكلان 5).

عموما، وفرت هذه التقنيات بيانات جديدة مما يدل على آلية شرح كيفية تعترف خلايا T مستضد المستمدة من سرطان الجلد وهذا هو هدف هام للعلاجات المضادة للسرطان. وعلى نطاق أوسع، هذه التقنياتيمكن استخدامها لتحقيق عمليا أي تفاعل مستقبلات يجند، كشف الآليات البيولوجية الجديدة التي قد تستهدف لتقدم علاجية جديدة.

الشكل 1: الكثافة تحليل مؤامرة. يظهر العمود الأيسر حذفت الخرائط التي تم تنقيح هذا النموذج في غياب الببتيد. احيط كثافة الفرق عند 3.0 سيغما، وتظهر ملامح إيجابية باللون الأخضر، وملامح السلبية والأحمر. ويبين العمود الأيسر خريطة الملحوظة عند 1.0 سيغما (كما هو موضح شبكة الرمادية حول تمثيل عصا من سلاسل البروتين) بعد الصقل لاحقا باستخدام آلية القيود التماثل غير البلورات التي تطبقها REFMAC5. (أ) نموذج لPMEL17 TCR-A2-مط-9V مع TCR CDR3 حلقات زرقاء اللون (سلسلة α) والبرتقال (سلسلة β) والببتيد باللون الأخضر. (ب) نموذج لA2-YLE معالببتيد ملونة خضراء داكنة. (ج) نموذج لA2-مط-3A مع اللون البرتقالي الببتيد (لA2-مط-3A، هناك 2 الجزيئات في وحدة غير متكافئة، ولكن هذه كانت متطابقة تقريبا من حيث احذف وكثافة خرائط، لذلك نسخ فقط 1 ويظهر هنا). (د) نموذج لA2-مط-5A مع الببتيد الملونة الوردي. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نظرة عامة على PMEL17 TCR في مجمع مع A2-YLE-9V. تمثيل (A) كارتون من مجمع PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. والملونة TCR الأسود. وتظهر الحلقات TCR مجلس الإنماء والإعمار (أحمر، CDR1α، الأخضر الداكن، CDR2α، الأزرق، CDR3α، الأصفر، CDR1β، أكوا، CDR2 ^6 ؛؛ البرتقال، CDR3β)؛ وHLA-A * 0201 هو مبين في الرمادي. ويمثل الببتيد YLE-9V بواسطة العصي الخضراء. (ب) المياه السطحية والتمسك تمثيل مخلفات PMEL17 TCR مجلس الإنماء والإعمار حلقات (ترميز الألوان كما في أ) أن الاتصال سطح A2-مط (A2، الرمادية، YLE-9V والعصي الخضراء). خط مائل الأسود يشير إلى زاوية عبور TCR فيما يتعلق المحور الطويل للالببتيد YLEPGPVTV (46.15 °). (ج) الاتصال البصمة من TCR PMEL17 على سطح A2-YLE-9V (A2، رمادي)؛ الأرجواني والأخضر (السطحية والعصي) تشير إلى HLA-A * 0201 والمخلفات YLE، على التوالي، اتصل قبل TCR GP100. قطع من 3.4 Å على السندات الهيدروجين و 4 Å لفان دير فال الاتصالات. أعيد طبعها بإذن من المرجع 31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل الديناميكا الحرارية من PMEL17 التفاعل TCR-A2-مط. (A) PMEL17 TCR الردود على A2-YLE في 5 و 12 و 18 و 25 ملزمة التوازن، و 37 درجة مئوية في تسع الى عشر التخفيفات المسلسل TCR. SPR البيانات الخام والمجهزة (على افتراض 1: 1 انجميور ملزمة) وترد في أقحم كل منحنى واستخدمت لحساب K _على وK _من القيم باستخدام خوارزمية العالمية لصالح (BIAevaluation 3.1). ويبين الجدول ملزم المتوازن لل(K _D (E)) وثوابت ملزمة الحركية (K _D (K) = K _قبالة / K _على) في كل درجة الحرارة. (، K _D ميكرومتر) حسبت التوازن ملزمة المستمر القيم باستخدام نوبة غير الخطية (ص = (P1x) / (P2 + س)). حسبت (ب) المعلمات الحرارية وفقا للمعادلة جيبس-هيلمهولتز (ΔG ° = ΔH ° - TΔS درجة). طاقات حرة ملزمة، ΔG درجة (ΔG ° = -RTlnK _D) تم التخطيط، ضد الحرارة (K) باستخدام الانحدار غير الخطية لتناسب المعادلة ثلاثة معلمة (ذ = ΔH ° + ΔCp ° * (س 298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * قانون الجنسية (خ / 298)). المحتوى الحراري (ΔH °) والكون (TΔS درجة) على 298 K (25 درجة مئوية) وترد في كيلو كالوري / مول وحسبت من قبل الانحدار غير الخطي للحرارة (K) تآمر ضد الطاقة الحرة (ΔG درجة). (C) متساوي المعايرة المسعرية (ITC) القياسات لPMEL17 التفاعل TCR-A2-مط. يتم عرض المحتوى الحراري (ΔH °) والكون (TΔS درجة) على 298 K (25 درجة مئوية) في كيلو كالوري / مول. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أونج> الشكل 4: PMEL17 مجلس الإنماء والإعمار حلقات التركيز على الببتيد بقايا PRO4، Val7، وThr8. (أ) تمثيل تخطيطي للاتصالات بين الببتيد YLE-9V وبقايا حلقة PMEL17 مجلس الإنماء والإعمار (مرمزة كما في الشكل 2A). الأرقام في الجزء السفلي من لوحة تظهر مجموع الاتصالات بين TCR والببتيد. (ب) اتصالات بين PMEL17 TCR والببتيد YLE-9V (العصي الخضراء) تبين فان دير الاتصالات فال (أسود الخطوط المتقطعة)، والسندات الهيدروجين (الحمراء الخطوط المتقطعة) التي قدمها TCR CDR3α (الأزرق)، CDR1β (أصفر) ، CDR2β (أكوا)، وCDR3β (برتقالي) حلقات. في اللوحة السفلى هو وجهة نظر قريبة من الاتصالات بين YLE PRO4، Val7، وThr8، على التوالي، وTCR مجلس الإنماء والإعمار بقايا حلقة (العصي مرمزة كما في الشكل 1A). قطع من 3.4 Å على السندات الهيدروجين و 4 Å لفان دير فال الاتصالات. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: مقارنة بتكوين جزئي للYLE، YLE-3A، وA2-YLE-5A الببتيدات قدمها HLA-A * 0201. (A) YLE (العصي خضراء داكنة) وYLE-3A (العصي البرتقال) الببتيد المواءمة عن طريق تركيب HLA-A * 0201 α1 الحلزون (الكرتون الرمادي). وتشير بقايا محاصر تحور Glu3 إلى ألانين. تظهر الأشكال كيف يسبب استبدال Glu3Ala تحولا في موقف (السهم الأسود) من PRO4 جار بقايا في بنية A2-YLE-3A مقارنة مع هيكل A2-مط. (ب) YLE (العصي خضراء داكنة) وYLE-5A (العصي الوردي) الببتيد المواءمة عن طريق تركيب HLA-A * 0201 α1 الحلزون (الكرتون الرمادي). وتشير بقايا محاصر تحور الجلايسين 5 إلى ألانين. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^{الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
GP100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

الجدول 1: محاذاة TCR المناطق CDR3 من PMEL17، GP100، MPD، و 296 TCRs-GP100 محددة. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31.

تسلسل الببتيد	الببتيد	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 الانجذاب K D	GP100 TCR TRAV17 TRBV19 افىNITY K D
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ± 2 ميكرومتر	26.5 ± 2.3 ميكرومتر
YLEPGPVT الخامس	YLE-9V	6.3 ± 1.2 ميكرومتر	21.9 ± 2.4 ميكرومتر
وLEPGPVTA	YLE-1A	15.9 ± 4.1 ميكرومتر	60.6 ± 5.4 ميكرومتر
YL وPGPVTA	YLE-3A	لا ملزم	لا ملزم
YLE وGPVTA	YLE-4A	19.7 ± 1.3 ميكرومتر	144.1 ± 7.8 ميكرومتر
YLEP وPVTA	YLE-5A	> 1 ملم	> 1MM
YLEPG وVTA	YLE-6A	11.4 ± 2.7 ميكرومتر	954.9 ± 97.8 ميكرومتر	YLEPGP وTA	YLE-7A	31.1 ± 4 ميكرومتر	102.0 ± 9.2 ميكرومتر
YLEPGPV أ أ	YLE-8A	38.1 ± 7.4 ميكرومتر	121.0 ± 7.5 ميكرومتر

الجدول 2: تحليل تقارب (K _د) من PMEL17 TCR وTCR GP100 GP100 إلى _280-288 المتغيرات الببتيد. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31.

المعلمات	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
كود PDB </ قوي>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
إحصاءات بيانات
مجموعة الفضاء	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
المعلمات الخلية وحدة (أ)	و= 45.52، ب = 54.41، ج = 112.12، و= 85.0 درجة، ب = 81.6 درجة، ز = 72.6 °	و= 52.81، ب = 80.37، ج = 56.06، ب = 112.8 °	و= 56.08، ب = 57.63، ج = 79.93، و= 90.0 درجة، ب = 89.8 درجة، ز = 63.8 °	و= 56.33، ب = 79.64، ج = 57.74، ب = 116.2 °
مصدر الإشعاع	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
الطول الموجي (أ)	0.9763	0.9999	0.9763	0.9763
قنينةمجموعة قرار الأحمر (أ)	51،87-2،02	45،25-1،97	43،39-2،12	43،42-1،54
قرار الخارجي شل (أ)	2،07-2،02	2،02-1،97	2،18-2،12	1،58-154
لاحظ انعكاس	128191 (8955)	99442 (7056)	99386 (7463)	244577 (17745)
تأملات فريدة من نوعها	64983 (4785)	30103 (2249)	49667 (3636)	67308 (4962)
كمال (٪)	97.7 (96.7)	98.5 (99.3)	97.4 (96.7)	99.6 (99.9)
تعددية	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2.0 (2.1)	3.6 (3.6)
I / سيجما (I)	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6.7 (20.3)	13 (2.3)
Rpim (٪)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4.5 (35.4)
دمج R (٪)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
إحصاءات الصقل
القرار (أ)	2.02	1.97	2.12	1.54
لا انعكاسات المستخدمة	61688	28557	47153	63875
لا انعكاس في مجموعة Rfree	3294	1526	2514	3406
R cryst (لا قطع) (٪)	18.1	19.7	17.2	17.0
R مجانا	22.2	25.5	210.1	20.1
جذر متوسط الانحراف مربع من الهندسة المثالية
طول الرابطة (أ)	0.018 (0.019) *	0.019 (0.019) *	0.021 (0.019) *	0.018 (0.019) *
زوايا السندات (درجة)	1،964 (1،939) *	1،961 (1،926) *	2،067 (1،927) *	1،914 (1،936) *
عموما تنسيق خطأ (أ)	0.122	0.153	0،147	0،055
راماشاندران الاحصائيات
معظم تفضيلا	791 (96٪)	371 (98٪)	749 (99٪)	384 (98٪)
سمح	32 (4٪)	6 (2٪)	10 (1٪)	5 (1٪)
القيم المتطرفة	2 (0٪)	3 (1٪)	1 (0٪)	2 (0٪)

الجدول 3: الحد من البيانات وصقل الاحصائيات (استبدال الجزيئي). أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31. القيم بين قوسين هي لأعلى قرار قذيفة.

Tyr1 ^OH

هلا / الببتيد بقايا	TCR بقايا	رقم VDW (≤4Å)	سندات H رقم (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 يا	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 يا	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
αGly97 يا	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
PRO4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
PRO4 يا	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 يا	6	1

الجدول 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V الاتصال الجدول. أعيد طبعها بإذن من المرجع ^31.

المناقشة

توفر البروتوكولات المذكورة هنا إطارا لتشريح الجزيئية والخلوية من الاستجابات تي خلية في سياق أي الأمراض التي تصيب البشر. على الرغم من أن سرطان كان التركيز الرئيسي لهذه الدراسة، وقد استخدمنا نهج مشابهة جدا لتحقيق استجابات الخلايا التائية للفيروسات ^{32، 33، 34، 35، 36، 37} وأثناء المناعة الذاتية ^{38، 39، 40.} وعلاوة على ذلك، وقد استخدمنا هذه التقنيات على نطاق أوسع لفهم مبادئ الجزيئية التي تتحكم خلايا T مستضد الاعتراف ^{2، 19، 41، 42.} في الواقع، وطبيعة لا يمكن التنبؤ بها من تعديلات على الببتيد المخلفات، حتى تلك التيخارج من بقايا الاتصال TCR، والتعرف على الآثار تي خلية آثار هامة لتصميم الببتيدات heteroclitic. وقد ساهمت هذه النتائج مباشرة إلى تطوير علاجات رواية تي خلية، بما في ذلك اللقاحات الببتيد ^{6 و 43} و الاصطناعية TCRs عالية تقارب ^{3، 4، 5، 20، 44،} وكذلك من وسائل التشخيص المحسنة ^{45، 46، 47.}

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
جيل من البروتين النقي للغاية، وظيفية أمر ضروري لجميع الطرق الواردة في هذه الورقة.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
صعوبات في توليد البروتين النقي للغاية تتعلق غالبا للتعبير عن درجة عاليةالبحتة، غير قابلة للذوبان وسطاء من نظام التعبير كولاي. عادة، تعديل بروتوكول التعبير (على سبيل المثال، الأمر الذي أدى إلى كثافة بصرية مختلفة، وذلك باستخدام سلالات مختلفة كولاي، أو باستخدام تشكيلات وسائل الإعلام المختلفة) يحل هذه القضايا.

القيود المفروضة على تقنية
هذه التقنيات تستخدم جزيئات البروتين القابلة للذوبان (TCR وpHLA) التي يتم التعبير عنها عادة على سطح الخلية. وبالتالي، فمن المهم التأكد من أن النتائج الهيكلية / الفيزيائية الحيوية تتفق مع النهج الخلوية لتأكيد الأهمية البيولوجية.

أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية / البديلة
من خلال استخدام البلورات بالأشعة السينية والفيزياء الحيوية إثباتها من خلال التحليل الوظيفي، نحن وغيرنا قد أظهرت أن TCRs محددة لالحواتم السرطان تتميز عموما الانتماءات الملزمة منخفضة ^48. هذا المنخفض TCR تقارب قد تساعد في تفسير سبب ع خلايا Tالبريد يست فعالة بشكل طبيعي في إزالة السرطان. هياكل عالية الدقة الذرية المجمعات بين TCRs المضادة للسرطان ومستضدات الأورام وما شابه ذلك بدأت تكشف عن الأساس الجزيئي لهذا التقارب الضعيف. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الدراسات هي مفيدة لتحديد الآليات التي تكمن وراء التدخلات العلاجية المصممة للتغلب على هذه المشكلة، بذر تحسينات في المستقبل ^16. في هذه الدراسة، درسنا هيكل الأول من αβTCR التي تحدث بشكل طبيعي في مجمع مع GP100 HLA-A * 0201 المقيدة سرطان الجلد حاتمة. هيكل، جنبا إلى جنب مع دراسة الفيزياء الحيوية في العمق، كشف وضع ملزم العام للتفاعل. نحن أيضا كشفت تبديل غير متوقع الجزيئية، التي وقعت في شكل تحور من الببتيد، التي تلغي TCR ملزمة (تقييمها باستخدام سطح صدى مأكل) وCD8 ⁺ T الاعتراف خلايا (التجارب الوظيفية). كان من الممكن فقط لإثبات هذه الآلية الجديدة من presentati المستضد HLAعلى استخدام وسائل عالية الدقة وصفها.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
وعموما، نتائجنا تظهر قوة البلورات بالأشعة السينية وطرق الفيزيائية الحيوية عند دمجها مع تحليلات وظيفية قوية. باستخدام هذه الأساليب، فمن الممكن أن تشريح خارج الآليات الجزيئية الدقيقة التي تحكم الاعتراف مستضد الخلايا التائية. والواقع أنه من الممكن أيضا استخدام هذا النهج إلى حل هيكل unligated TCRs، مما يدل على مدى التغييرات متعلق بتكوين يمكن أن تلعب دورا خلال التمييز المستضد ^{49، 50، 51.} لديه فهم أفضل للطبيعة المعقدة للغاية والحيوية التي تقوم عليها التفاعلات TCR-pHLA أيضا آثار واضحة لتصميم العلاج. أن تكون قادرة على مباشرة "رؤية" الجزيئات التي مستهدفون علاجيا، فضلا عن تأثير تلك التعديلات لها على recognitio مستضدن، وتحسين واضح في تطوير هذه الأدوية للمضي قدما. في هذه الدراسة، وتبين لنا أنه حتى التغييرات في بقايا الببتيد واحدة لا تعمل بشكل كبير من قبل TCR يمكن أن تنقل غير متوقع تغييرات هيكلية على المخلفات الأخرى في الببتيد محددة HLA، والتي، بدورها، يغير بشكل كبير الاعتراف تي خلية. وهناك فهم أكثر اكتمالا من الآليات الجزيئية المستخدمة خلال الاعتراف مستضد الخلايا التائية يكون مفيدا بشكل كبير عند تصميم العلاجات المستقبلية لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
S.O.C. وسائل الإعلام	Invitrogen
Orbi-Safe حاضنة المدار الجديدة	Sanyo
carbenicillin	Sigma
IPTG	فيشر
كويك كوماس صبغة SafeStain	Generon
Legend RT	سورفال
تريس	فيشر
كلوريد المغنيسيوم	Arcos
NaCl	فيشر
الجلسرين	سيجما ألدريتش
سونوبولس HD 2070	Bandelin
DNAse	فيشر
تريتون	سيجما ألدريتش
EDTA	فيشر
غوانيدين	فيشر
نانو دروب ND1000	الببتيدات الحرارية
	أبحاث البروتين
dithiothreitol	سيجما ألدريتش
L-arginine	SAFC
السيستيامين	فيشر
سيستامين	غسيل الكلى فيشر
	سيجما ألدريتش
اليوريا	سيجما ألدريتش
متريسيل 0.45 & م مرشح غشاء	Pall
POROS 10/100 HQ			الحيوية التطبيقية
Ä ؛ نظام FPLC النقي KTA	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية علوم
الحياة 10 كيلو دالتون MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 كيلو دالتون MWCO Vivaspin 4	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline	Oxoid
BIAcore buffer HBS			الحياة من جنرال إلكتريك
	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Life Sciences
CM5 مجموعة اقتران رقاقة	GE Healthcare Life Sciences
ستربتافيدين	سيجما ألدريتش
ميكروكال نائب الرئيس لمركز التجارة الدولية	GE Healthcare Life Sciences
Hepes	روبوت تبلور سيجما ألدريتش
جريفون	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
شاشات التبلور والكواشف			الجزيئية
75 سم 2 < / sup>flask	Greiner Bio-One
0.22 & mu; مرشحات m	Miller-GP ، أنبوب الطرد
؛	بيكمان كولتر
أوبتيما L-100 XP مع دوار SW28	بيكمان كولتر
CD8 ميكروبيدات	Miltenyi Biotec
anti-CD3 / CD28 Dynabeads	ميكروبيدات Invitrogen
المضادة لل PE   ؛	Miltenyi Biotec
CK متوسط, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb	BD
dasatinib	أكسون
MIP-1 & بيتا ؛ و TNF & alpha ؛ إليسا	R & D Systems
51Cr	PerkinElmer
1450 ميكروبيتا عداد	PerkinElmer