هذا البروتوكول يوضح الفئران العزلة جزيرة والبذر على سقالة ديسيلولاريزد. تم زرع الجزر التي تدعم سقالة في لوحة الدهون البربخ من ستريبتوزوتوسين (ستز) التي يسببها الفئران السكري. نجت الجزر في موقع الزرع وعكست حالة فرط سكر الدم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد ثبت سريريا زرع جزيرة لتكون فعالة في علاج مرض السكري من النوع 1. ومع ذلك، فإن استراتيجية زرع داخل الكبد الحالية قد تتسبب في ردود فعل الدم كلها حادة ويؤدي إلى سوء إنغرافتمنت جزيرة. هنا، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول قوي لزرع الجزر في موقع زرع خارج الكبد - لوحة الدهون البربخ (إف) - في نموذج الفأر السكري. تم وصف بروتوكول لعزل وتنقية الجزر في الغلة العالية من الفئران C57BL / 6J، وكذلك طريقة زرع يؤديها البذر الجزر على سقالة ديسيلولاريزد (دسس) وزرعها في موقع إف في الفئران C57BL / 6J سينجينيك المقدمة السكري بواسطة ستريبتوزوتوسين. الكسب غير المشروع دسس يحتوي على 500 الجزر عكس حالة فرط سكر الدم في غضون 10 يوما، في حين أن الجزر الحرة دون دسس المطلوبة 30 يوما على الأقل. تم الحفاظ على نقص سكر الدم لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى تم الكشف عن الكسب غير المشروع. في الختام، دسس تعزيز إنغرافتمنت من الجزر في tموقع خارج الكبد من إف، والتي يمكن بسهولة استرجاعها ويمكن أن توفر منصة استنساخه ومفيدة للتحقيق في المواد سقالة، فضلا عن غيرها من المعلمات زرع المطلوبة ل إنغرافتمنت جزيرة ناجحة.
المقدمة
داء السكري من النوع 1 (T1D) هو اضطراب الغدد الصماء المناعي الذاتي الذي يتم طرد خلايا الجزيرة من الجهاز المناعي، مما يجعل المرضى يعتمدون على حقن الأنسولين الخارجي لحياتهم كلها. ويمثل بروتوكول ادمونتون معلما بارزا في الدراسات السريرية لزرع الجزر. تم غرس الجزر من خلال الوريد البابي وزرعها في موقع داخل الكبد 1 . ومع ذلك، اثنين من العقبات الرئيسية - مصادر غير كافية من الجزر المانحة والجزيرة إنغرافتمنت الفقراء - منع نجاح واسع من زرع جزيرة 2 . عادة، الجزر تحتاج إلى جمعها من ثلاثة المانحين الجاد لعكس حالة فرط سكر الدم من مريض واحد. وهذا يرجع إلى انخفاض العائد من إجراءات العزلة جزيرة وفقدا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل جامعة بكين المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (إاكوك، إاكوك رقم سو-لوي-1).
1. عزل العزلة
- إعداد الكواشف والمعدات.
- إعادة مسحوق كولاجيناز P (2 U / ملغ) في هبس لجعل محلول 5 ملغ / مل وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة البكتيريا. إعداد 0.6 مل-قسامة حلول كولاجيناز P في أنابيب مخروطية 15 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظ....
- إعادة مسحوق كولاجيناز P (2 U / ملغ) في هبس لجعل محلول 5 ملغ / مل وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة البكتيريا. إعداد 0.6 مل-قسامة حلول كولاجيناز P في أنابيب مخروطية 15 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لدينا طريقة لقط، يؤديها باستخدام المشبك مرقئ المجهري، هو واضح وتوفير الوقت مقارنة مع تقنية ربط خياطة. استغرق الأمر حوالي 4 ساعات لعزل وتنقية حوالي 1200 جزيرة من 6 الفئران. وكان الجزر المعزولة حديثا عادة محيط الخام تحت المجهر الضوئي ( الشكل 3A ). وبمجرد أن الجزر تعافى من عملية العزل، فإنها تبدو مشرقة وضيقة وحصلت على سطح أملس. ومع ذلك، فإن العزلة المجهدة لا تزال تحفز موت الخلايا، مما أدى إلى التخلي عن الخلايا من أسطح جزي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البنكرياس نضح والهضم الوقت هما البارامترات الرئيسية التي تؤثر على العائد جزيرة والجودة. ذكرت موسكالوسكي أولا استخدام خليط كولاجيناز الخام لهضم المفروم غينيا بنكرياس خنزير 11 . لاسي وآخرون. وذكرت حقن الانزيمات في نظام القناة لإرضاء البنكرياس، مما أدى إلى زيادة كبيرة في العائد جزيرة 12 . نضح الأقنية من الانزيم يسمح للتعرض القصوى من مساحة سطح البنكرياس إلى الانزيم، مما أدى إلى هضم أكثر تجانسا وإطلاق أكبر من الجزر سليمة بالمقارن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
المؤلفين أود أن أشكر وي تشانغ من غوانهاو التكنولوجيا الحيوية لتوفير السقالات ديسلولاريزد. نشكر شياو هونغ بنغ للمناقشات مفيدة. وقد دعم هذا البحث ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (مشروع رقم 31322021).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تشريح مقص | نينغبو ملقط طبي | ||
| نينغبو الطبية | |||
| 0.5 مم قطر شبكة سلكية | نينغبو الطبية | ||
| 70 & مصفاة الخلايا m | Falcon | 352350 | |
| مشبك مرقئ الشريان | نينغبو الطبية | ||
| المجهرية المشبك المرقئ | نينغبو المرقئ الطبي نينغبو الطبية | ||
| المرقئ | نينغبو الطبية | ||
| للامتصاص 6-0 خيوط PGLA ؛ | جينهوان | الجرح بإبرة | |
| نينغبو مسحة قطنية طبية | |||
| نينغبو شاش طبي | |||
| نينغبو ستائر طبية | |||
| معقمة | نينغبو حقنة طبية | ||
| 10 مل | حقنة جينغوان | ||
| 1 مل حقنة | جينغهوان | ||
| 27G إبرة في الوريد | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 مل أنبوب Eppendorf | Axygen | ||
| 15 مل أنبوب مخروطي | Corning | 430791 | |
| 50 مل أنبوب مخروطي | Corning | 430829 | |
| 35 مم غير معالج ؛ أطباق | بيري كورنينج | 430588 | |
| ترانسويل | كورنينج | 3422 | |
| 0.22 & مرشح m | Pall | PN4612 | |
| 10 مل ماصة مصلية | Corning | 4488 | |
| حشو ماصة S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| ماصة (2-20 & mu; L) | Axygen | AP-20 | AXYPET < sup>TM < / sup> |
| المجهر | أوليمبوس | SZ61 | |
| طرد مركزي | Eppendorf | 5810R | |
| هانك محلول ملح متوازن | جيبكو | C14175500CP | |
| كولاجيناز بي | روش | COLLP-RO | |
| هيستوباك 1077 | سيجما | 10771 | |
| RPMI 1640 | جيبكو | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| مقياس الجلوكوز | روش | ACCU-CHEK | |
| البنسلين الستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | |
| ستربتوزوتوسين | سيجما | V900890 | VetecTM< / sup> |
| هيدرات الكلور | J& K | C0073 | |
| سترات الصوديوم | Sigma | 71497 | |
| حامض الستريك | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL / 6J ، 10-12 أسبوعا | من VitalRiver | بكين ، الصين | |
| سقالة منزوعة الخلايا | Guanhao Biotec | 131102 | قوانغتشو ، الصين |
المراجع
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
