مقالة منهجية

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

21.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55000

⸱

أبريل 18, 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, University of Manitoba, 2Kleysen Institute for Advanced Medicine, Health Sciences Centre

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكول لزراعة منخفض الكثافة الخلايا العصبية الحصين الابتدائية المتزايد على coverslips الزجاج المقلوب على أحادي الطبقة الدبقية. يتم فصل طبقات الخلايا العصبية والدبقية التي كتبها حبات شمع البارافين. الخلايا العصبية التي يزرعها هذه الطريقة هي مناسبة لعالية الدقة التصوير الضوئي والمقايسات الفنية.

الملخص

القدرة على تحقيق هيكل وفسيولوجيا الخلايا العصبية الفردية في الثقافة أمر بالغ الأهمية لدراسة بيولوجيا الأعصاب، ويسمح للمرونة في التلاعب الجيني والكيميائي للخلايا فردية أو شبكات محددة. بهذه السهولة التلاعب أبسط في نظام الثقافة انخفاض بالمقارنة مع أنسجة الدماغ سليمة. بينما العديد من الأساليب لعزل ونمو هذه الخلايا العصبية الأولية موجودة، كل له حدوده الخاصة. يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة منخفض الكثافة والقوارض عالية النقاء الخلايا العصبية الجنينية الحصين coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية. هذه "الثقافة شطيرة" تسمح للنمو على المدى الطويل الحصري لعدد السكان من الخلايا العصبية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج، لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية والمستخدمة في التصوير أو المقايسات الفنية. الخلايا العصبية زrown بهذه الطريقة البقاء على قيد الحياة عادة لعدة أسابيع وتطوير العرش واسعة، اتصالات متشابك، وخصائص الشبكة.

المقدمة

وينظم الدماغ في شبكات معقدة من الخلايا العصبية. مساهمة من الخلايا العصبية الفردية لنشاط الشبكة وظائف المخ يمكن دراستها عن طريق تغيير الانتقائي للتكوينها الجزيئية وperturbance ممتلكاتهم الفسيولوجية. التلاعب الجيني والكيميائية من الخلايا العصبية الفردية أسهل القول في الخلايا العصبية مثقف مما كانت عليه في أنسجة الدماغ سليمة، تعيقها عدم التجانس الخلوية الأخير والتعقيد. الخلايا العصبية في ثقافة تطوير محور عصبي واضحة المعالم والعرش الشجرية وتشكل الاتصالات المشبكية مكثفة مع بعضها البعض.

في حين ثقافة العصبية من الحيوانات البالغة أو من مناطق أخرى من الجهاز العصبي هو ممكن، وكثيرا ما يفضل الثقافات الحصين الجنينية بسبب السكان المحمولة الخاصة بهم محددة هرمي وكثافة منخفضة نسبيا الدبقية 1 و 2. الخلايا العصبية قرن آمون نمت في منخفض الكثافة في الثقافة بشكل خاص آميnable لدراسة توطين التحت خلوية، والاتجار البروتين، والاستقطاب الخلايا العصبية والتنمية المشبك. كما تم توظيف الخلايا العصبية في الثقافة على نطاق واسع في دراسة العمليات الجزيئية في اللدونة متشابك 3، 4، 5، 6. وكانت الاستعدادات ثقافة العصبية من الفئران مع الحذف الجينية العالمية التي لا البقاء على قيد الحياة بعد الولادة مفيدة بشكل خاص في دراسة أدوار الخلوية ومتشابك بعض الجينات 7.

كما هو الحال في الدماغ، الخلايا العصبية الحصين مثقف تعتمد على الدعم الغذائي من الخلايا الدبقية. هذا يعقد ثقافتهم، وأدى إلى تطوير العديد من الطرق المختلفة التي يتم من خلالها توفير هذا الدعم. ويشمل أحد الطريقة المستخدمة عادة طلاء الخلايا العصبية مباشرة على أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية 8، أو السماح للخلايا الدبقية الملوثات من هيب المكتسبةالأنسجة ocampal لتتكاثر وتشكيل أحادي الطبقة تحت الخلايا العصبية 9. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة بعض النجاح، والنجاسة من ثقافة العصبية الناتج هو غير ملائم للتجارب التصوير. آخر الطريقة المستخدمة عادة من ثقافة العصبية ومن المقرر ان يغادر المغادرة وحدة التغذية الدبقية طبقة تماما، وبدلا من تقديم الدعم الغذائي في شكل متوسط النمو المحدد 10.

هنا، نحن تصف "ساندويتش" أو طريقة "بانكر" للثقافة العصبية 2 و 11. يتضمن هذا الأسلوب طلاء الخلايا العصبية قرن آمون coverslips على الزجاج، والتي يتم بعد ذلك علقت اكثر من أحادي الطبقة من الخلايا الدبقية مفصولة حبات شمع البارافين. وهذا يسهل الثقافة على المدى الطويل من السكان متجانسة من الخلايا العصبية دون تلويث الدبقية في حين يسمح للحصول على الدعم الغذائي من أحادي الطبقة الدبقية الأساسية. عندما الخلايا العصبية هي من العمر ما يكفي أو مستوى النضج،لل coverslips الخلايا العصبية يمكن أن انقلبت التدريجي من الطبق الدبقية وتستخدم في التصوير أو المقايسات الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب والبروتوكولات باستخدام حيوانات المختبر من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية جامعة مانيتوبا وكانت متوافقة مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. إعداد الآلات، المخازن وحلول

  1. تعقيم بواسطة التعقيم جميع المعدات تشريح، الماصات الزجاج باستور، نصائح ماصة، جهاز التصفية، والماء منزوع الأيونات.
  2. إعداد 20٪ (ث / ت؛ 1.1 M) حل سهم الجلوكوز في الماء منزوع الأيونات وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 ° C.
  3. يعد حل البيروفات الصوديوم 100 ملم في الماء منزوع الأيونات وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 ° C.
  4. إعداد الكالسيوم والمغنيسيوم خالية هانك المتوازن محلول الملح (CMF-HBSS) بجعل حل 10٪ HBSS (10X)، و 10 ملي HEPES، و 100 U / مل البنسلين ستربتومايسين في الماء منزوع الأيونات. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر.
  5. إعداد 10 ملغ / مل ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز) في CMF-HBSS،ثم تصفية تعقيم وتخزين في -20 ° C.
  6. إعداد المتوسطة الدبقية بجعل حل 30 ملي الجلوكوز (من محلول معقم)، 95 U / مل البنسلين ستربتومايسين، و10-15٪ مصل النمو البقري (BGS) في الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM).
    ملاحظة: كما هو مبين في البروتوكول، وهو حل من 5٪ BGS يمكن استخدامها إذا لزم الأمر لإبطاء تكاثر الخلايا. حصان المصل يمكن أن تستخدم بدلا من BGS، ولكن لاحظ أن كل دفعة يجب أن يتم اختبار قبل استخدامها نظرا لاختلاف بين دفعة واحدة. تخزين حل استعداد عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر. على الرغم من العديد من المختبرات تستخدم FBS، لاحظنا دائما أن النمو الدبقية في BGS قوي كما هو الحال في FBS. مشتق BGS من مصل العجل الجنين الذي تستكمل مع عناصر محددة كيميائيا. وبالإضافة إلى ذلك، BGS حد كبير أكثر اقتصادا من FBS.
  7. إعداد نمو الخلايا العصبية والمتوسطة الصيانة (neurobasal-B27، NBG) بجعل حل 1X B27 تكملة و 0.5 ملي L-الجلوتامين في 500 مل Neurobasal ميديأم. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر. يمكن أن تكون بديلا L-الجلوتامين مع GlutaMAX، الذي كان قد اقترح أن يكون أكثر استقرارا في متوسط ​​النمو.
  8. إعداد الخلايا العصبية تصفيح المتوسطة بجعل حل 30 ملي الجلوكوز (من محلول معقم)، 1 ملم البيروفات الصوديوم (من محلول معقم)، و 10٪ BGS في MEM. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1-2 أشهر.
  9. يعد حل من 1 ملم Cytarabine و(آرا-C) ومرشح تعقيم. قسامة 1 مل أجزاء ومخزن في -20 ° C.
  10. يعد حل من 100 ملي APV في هيدروكسيد الصوديوم فلتر تعقيم-100 مليون. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  11. حل 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في المخزن بورات، ودرجة الحموضة 8.5 (50 ملم حمض البوريك و 12 ملي البوراكس) ومرشح تعقيم. قسامة ومخزن في -20 ° C. بدلا من بولي-L-ليسين، يمكن للمرء استخدام بولي-L-الأورنيثين التي قد تكون أقل سمية للخلايا.

2. إعداد الثقافة الدبقية

  1. إعداد القشرية زراعة الخلايا دبق نجمي الخلايا
    1. الحصول على الفئران الوليدة خلال 24 ساعة من الولادة. ضع الجراء على الجليد لتخدير لهم.
    2. رش الجراء مع 70٪ من الإيثانول واقطع رؤوسهم.
    3. وضع رؤساء في صحن 100 ملم على الجليد تحتوي على 15 مل CMF-HBSS.
    4. تشريح خارج كل الدماغ عن طريق قطع في فروة الرأس، وفتح الجمجمة، قطع جذع الدماغ، ومن ثم نقل الدماغ إلى 60 مم أطباق بتري على الجليد التي تحتوي على 3 مل CMF-HBSS.
    5. فصل نصفي الكرة المخية من الحصين ومن ثم تجريد بعيدا السحايا المحيطة بهم. ممارسة الاحتياطات الكافية لضمان الحد الأدنى من التلوث من الخلايا الليفية السحائية. الليفية السحائي في الثقافة يمكن أن تتنافس مع الدبقية للنمو ويكون ضارا لصحة الخلايا العصبية. جمع كل نصفي الكرة المخية في 60 مم طبق بيتري على الجليد تحتوي على 5 مل CMF-HBSS.
    6. إزالة CMF-HBSS ثم تخطر على الأنسجة القشرية التي تم جمعها كما بدقة ممكن باستخدام الربيع مقص تشريح الصغيرة.
    7. إضافة يكفي CMF-HBSS لفرمالأنسجة PED. باستخدام الزجاج ماصة باستير، ونقل القطع الأنسجة لأنبوب 15 مل. جعل إجمالي حجم 12 مل بإضافة CMF-HBSS.
    8. إضافة 1.5 مل كل من التربسين 2.5٪ و 10 ملغ / مل حل الدناز. احتضان الخليط الناتج على 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 12 دقيقة.
    9. يسحن الأنسجة 10-15 مرة باستخدام الزجاج ماصة باستير، وكذلك احتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 3 دقائق.
    10. تصفية طاف من خلال العدسة ورق أو شبكة مرشح في أنبوب 50 مل تحتوي على 5 مل من BGS. ويتم ذلك لإزالة أجزاء من الأنسجة undissociated. بدلا من ذلك، استخدم مصافى الخلية متاحة تجاريا.
    11. إضافة 13.5 مل من CMF-HBSS و 1.5 مل من 2.5٪ التربسين إلى الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة المتبقية وزيادة احتضان أنه عند 37 درجة مئوية في حمام الماء لمدة 10 دقيقة إضافية.
    12. يسحن الأنسجة المتبقية مرة أخرى، ومن ثم تصفية تعليق مرة أخرى في أنبوب 50 مل تحتوي على الترشيح الأولي. بعد ذلك، شطف جنيهورقة نانوثانية مع 3 مل من BGS. يجب أن يكون الحجم النهائي ما يقرب من 38 مل.
    13. الطرد المركزي تعليق يحتوي على الخلايا الدبقية فصلها لمدة 6 دقائق في 130 ز س. بعناية تجاهل طاف باستخدام ماصة باستير الزجاج. تأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي ليست منزعجة. الجزء السفلي من بيليه يبدو المحمر قليلا تحتوي على مكونات الدم.
    14. نقل الخلايا الدبقية في 1 مل من المتوسط ​​الدبقية في أنبوب جديد، مع الحرص على عدم تعكير صفو جزء المحمر من بيليه.
    15. تضيف ما يصل الى 2 مل من المتوسط ​​الدبقية في الجرو لإعادة تعليق مجتمعة فصل الخلايا الدبقية. على سبيل المثال، إذا تم استخدام 10 الجراء، ومن ثم إجمالي حجم إعادة تعليق سيكون 20 مل.
    16. إعداد واحد 75 سم 2 خلية الثقافة قارورة في الجرو. إضافة 18 مل قبل تحسنت المتوسطة الدبقية إلى كل قارورة.
    17. نقل 2 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
    18. بعد يوم واحد، مع استبدال 20 مل الدبقية مedium. في هذه المرحلة، والثقافة هي مزيج من الدبقية وغيرها من أنواع الخلايا غير المرغوب فيها.
    19. بعد أربعة أيام من البذر الخلايا، هزة بقوة القوارير لإزاحة الخلايا غير نجمية. للقيام بذلك، وشطف القوارير مرة واحدة مع CMF-HBSS، ثم قم بإضافة 10 مل الطازجة CMF-HBSS إلى كل قارورة. يهز قوارير بقوة 5-10 مرات، ثم نضح قبالة CMF-HBSS. شطف مرتين مع CMF-HBSS، ثم إضافة 20 مل المتوسطة الدبقية.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة أنواع الخلايا غير المستهدفة، ويجب أن لا تؤدي إلى فقدان الخلايا النجمية المطلوب.
    20. استبدال المتوسطة الدبقية الطازج مرتين في الأسبوع حتى الخلايا متموجة (الشكل 1).
  2. تجميد الدبقية
    1. بمجرد متموجة الثقافات، ونضح قبالة المتوسطة وغسل أحادي الطبقة الخلية مع 10 مل CMF-HBSS.
    2. إضافة 10 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA لكل قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    3. قوارير الصنبور بلطف لطرد الخلايا. إضافة 1 مل BGS رس كل قارورة ونقل تعليق خلية في 15 مل أنابيب.
    4. أنابيب الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف الناتجة عن ذلك.
    5. إعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل المتوسطة الدبقية.
    6. إعداد المتوسطة تجميد الدبقية (1-جزء ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 4 أجزاء BGS). إضافة 0.5 مل من هذا الحل إلى كل من 4 قوارير المبردة في قارورة.
    7. نقل 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة، ثم تجميد الخلايا ببطء عن طريق وضع قارورة في وعاء معزول في الفريزر -80 درجة مئوية خلال الليل. بعد يوم واحد، ونقل قوارير إلى الثلاجة النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
  3. أحيت الطلاء الدبقية
    1. الدبقية لوحة قبل اليوم ثقافة العصبية 1-2 أسابيع.
    2. إعداد أنبوب 50 مل مع 10 مل حرارة متوسطة الدبقية.
    3. ذوبان الجليد 1 قارورة المجمدة من الدبقية في 37 ° C حمام الماء لمدة 2-3 دقيقة.
    4. نقل محتويات القارورة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل المتوسطة الدبقية.
    5. طاردةالبريد الأنبوب لمدة 5 دقائق في 130 x ج ونضح من طاف.
    6. إعادة تعليق بيليه في 20 مل المتوسطة الدبقية.
    7. إضافة 3 مل المتوسطة الدبقية جديدة إلى كل من الأطباق الثقافة (60 ملم)، ومن ثم نقل 1 مل من خلية إلى تعليق كل طبق. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
    8. تغذية الخلايا مرتين في الأسبوع. إذا وصلت كثافة الخلية 50٪ التقاء جيدا قبل اليوم ثقافة العصبية، والتحول إلى المتوسطة الدبقية تحتوي على 5٪ BGS إلى إبطاء معدل النمو الدبقية. التقاء المرجوة من أحادي الطبقة الدبقية للثقافة العصبية بنسبة 50٪ - 70٪.
    9. استبدال المتوسطة الدبقية مع NBG المتوسطة (6 مل / طبق) قبل 1-2 أيام من ثقافة العصبية.

3. إعداد ساترة

  1. تنظيف وإعداد الخرز البارافين
    1. غمر coverslips في حامض النتريك (70٪ وزن / وزن، تنبيه: ضارة للغاية) ويصوتن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وو غيرها من المختبراتس اوند من المفيد لاحتضان coverslips في حمض النيتريك 70٪ في رفوف السيراميك لمدة 12-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة بدلا من ذلك.
    2. بعناية تجاهل حمض النيتريك في عين غطاء الدخان الكيميائية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. شطف لل coverslips 3-5 مرات بالماء منزوع الأيونات.
    3. غمر لل coverslips في الماء منزوع الأيونات ويصوتن لهم مرة أخرى لمدة 30 دقيقة (تخطي إذا وفقا للطريقة بديلة).
    4. إزالة الماء منزوع الأيونات وشطف لل coverslips آخر ثلاث مرات.
    5. غمر لل coverslips في 50 مل من الماء منزوع الأيونات وتعقيم لهم من قبل التعقيم. بدلا من ذلك، تعقيم لل coverslips في 225 ° C في الفرن لمدة 6 ساعات. في حالة استخدام هذا النهج البديل، انتقل إلى الخطوة 3.1.9.
    6. مرة واحدة تعقيمها، ونقل لل coverslips إلى غطاء تدفق الصفحي معقمة للخطوات التالية.
    7. إزالة الماء منزوع الأيونات وشطف مع 20-30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
    8. إضافة 20-30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ونقل لل coverslips والإيثانول إلى 100 ملم طبق بيتري.
    9. استخدام ملاقط حادة لنقل coverslips إلى 60 ملم أطباق بتري، 4-5 coverslips في طبق، ثم السماح لهم الهواء الجاف بالانحناء لل coverslips على حافة الطبق. مرة واحدة وقد تبخرت الإيثانول، وضع لل coverslips شقة على السطح.
    10. نقل 10 غ البارافين لزجاجة مناسبة الزجاج المقاوم للحرارة. إذابة البارافين والحفاظ عليه في حوالي 150-200 ° C على طبق ساخن لمدة 1 ساعة على الأقل. درجة الحرارة المثالية التي يجب أن تكون ساخنة البارافين قد يستغرق بعض التغيير والتبديل. إن درجات الحرارة غير المثالية تؤدي إلى صعوبات في انتاج الحجم الصحيح من الخرز البارافين. فترة الانتظار بعد ذوبان تساعد على ضمان درجة حرارة ثابتة طوال السائل.
    11. تراجع ماصة باستور في البارافين، ثم سرعان ما مسها إلى ثلاث مناطق قرب حافة كل ساترة (كل بقعة يجري ما يقرب من 120 درجة على حدة). فإن قطرات يصلب في الخرز حوالي 0.3-0.5 ملم عالية و1،0-2،0 مم بقطرالعطر وسوف تعمل لتوفير مساحة بين الخلايا العصبية على ساترة وأحادي الطبقة الدبقية أدناه (الشكل 2).
    12. تعقيم الأطباق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، ثم تغطيتها بورق الألمنيوم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. coverslips مستعدة يمكن تخزينها واستخدامها لمدة تصل إلى شهر واحد. ينبغي أن يسمح الخرز البارافين التمسك لل coverslips لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام. وهذا سيمنع البارافين من فصل خلال الخطوات المتبقية من البروتوكول.
  2. Coverslips مع طلاء بولي-L-ليسين
    1. الحصول على أطباق بتري تحتوي معدة مسبقا coverslips مع الخرز البارافين.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من بولي-L-يسين في المخزن بورات على سطح كل ساترة والسماح للحل الجلوس على لل coverslips بين عشية وضحاها، وتغطيتها، في درجة حرارة الغرفة. معطف السطح نفسه باسم واحد التي تقع الخرز البارافين. لاحظ أنه إذا تنظيفها بشكل صحيح، بولي-L-يسين أن ينتشر بسهولةلتغطية سطح ساترة.
    3. بعد يوم واحد، وغسل لل coverslips مرتين عن طريق نقع في الماء منزوع الأيونات معقمة لمدة 2 ساعة في كل مرة. بعد غسل النهائي، واستبدال الماء مع 4 مل من المتوسط ​​طلاء الخلايا العصبية في طبق. لاحظ أنه من المهم أن يسمح للسطح لل coverslips لا تجف بعد أن تم المغلفة مع بولي-L-يسين.
    4. ضع الأطباق التي تحتوي على ساترة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. وينبغي المحتضنة لل coverslips المغلفة لمدة 24 ساعة على الأقل قبل ثقافة العصبية. ويتم ذلك لرئيس وسيلة للثقافة الخلايا العصبية.

4. تشريح الحصين وطلاء الخلايا العصبية

  1. الحصول على الفئران الحوامل (18-19 يوم الجنينية، كما يقاس من يوم اكتشاف المكونات المهبلية) والموت ببطء عن طريق قطع الرأس-تخدير الأيزوفلورين أو غيرها من طريقة المعتمدة.
  2. رش الجانب السفلي من الفئران مع 70٪ من الإيثانول، ثم إجراء شق من منطقة العانة ترولاف إلى نهاية تجويف البطن. لتجنب التلوث، ورعاية لقطع فقط من خلال الجلد في هذه الخطوة.
  3. شطف أدوات تشريح ثانية مع 70٪ من الإيثانول، ثم قطع طريق جدار البطن لفضح الرحم. إزالة قرني الرحم ووضعها في العقيمة 100 ملم طبق بيتري.
  4. تنفيذ الخطوات المتبقية في غطاء تدفق الصفحي. إزالة غشاء الرحم المحيطة الأجنة. اقطع رؤوسهم ووضع رؤساء في 100 مم طبق بتري تحتوي على 20 مل CMF-HBSS.
  5. تشريح خارج العقول وعلى الفور وضعها في 60 مم طبق بتري تحتوي على 2 مل CMF-HBSS على الجليد. جمع فقط 2-3 العقول في طبق للسماح مساحة كافية لاتخاذ الخطوة التالية.
  6. تحت المجهر تشريح تجريد بعيدا السحايا من خط الوسط من نصفي الكرة المخية، ومن ثم تشريح خارج الحصين ووضعها في 60 مم طبق بتري تحتوي على 4.5 مل CMF-HBSS. لاحظ أن الحصين يمكن تمييزها على أنها struc على شكل هلالتلح في السطح الإنسي من نصف الكرة القشرية، وسهلة لإزالة كما يحده أفقيا عن طريق البطين.
  7. نقل الأنسجة قرن آمون التي تم جمعها وCMF-HBSS إلى أنبوب 15 مل. إضافة 0.5 مل من 2.5٪ التربسين، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. غراء يمكن أن تستخدم بدلا من التربسين لأنها ألطف ويمكن أن تزيد الغلة.
  8. إزالة بلطف الحل التربسين بواسطة ماصة باستير، وترك الأنسجة دون عائق قرن آمون في الجزء السفلي من الأنبوب.
  9. غسل بلطف النسيج مرتين مع 5 مل CMF-HBSS في حين تفرخ أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد غسل الثاني، ليصبح الحجم الكلي للا يقل عن 5 مل عن طريق إضافة كمية كافية من CMF-HBSS إلى الأنسجة. إذا كان هناك الحصين من أكثر من 10 الجراء، ما يصل إلى 8 مل CMF-HBSS يمكن إضافتها.
  10. تحضير نوعين مختلفين من ماصات مصقول النار لتفكك الأنسجة. غيض من متغير واحد هو من القطر العادي من ماصة ولكن مع حواف مملس مصقول النار. وفاري الآخريننملة واحدة مع قطر الحافة بمقدار النصف. لفترة وجيزة فضح غيض من ماصة باستير الزجاج قطريا لمصدر لهب، ومن ثم اختبر نصائح من الماصات.
    1. كرر هذه الخطوة حتى يتم مملس حافة الحافة أو تم تخفيض القطر. ومن المهم أن ممارسة للعثور على قطر المثالي للتأكد من أن الأنسجة نأت لانتاج الخلايا واحد دون الإضرار هذه الخلايا.
  11. يسحن الأنسجة الحصين أولا بنحو 10 يمر من خلال ماصة باستير الزجاج العادي ارتفع على نحو سلس، وبعد ذلك أبعد 5-10 يمر من خلال ماصة مع انخفاض القطر. الهدف هو الحصول على حل متجانس من الخلايا مع عدم وجود أو عدد قليل جدا من كتل الأنسجة.
  12. تحديد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي. عادة، يتم الحصول على 0،8-1،0 مليون خلية لكل الجرو عندما يتم الجمع بين الحصين من نصفي الكرة الأرضية.
  13. نقل كمية كافية من خلية إلى تعليق الأطباقتحتوي على coverslips المغلفة بولي-L-يسين في 4 مل الطلاء المتوسطة للحصول على كثافة الطلاء من 300000 خلية لكل 60 مم طبق. كثافة الخلايا يمكن أن تختلف من 100،000 إلى 500،000، وهذا يتوقف على التجربة المقصود.
  14. بعد 3-4 ساعات، ونقل لل coverslips مع الخلايا العصبية التي تعلق على الأطباق التي تحتوي على الخلايا الدبقية في NBG المتوسطة. ينبغي أن يتم ذلك بحيث يكون الجانب الذي كانت مطلية الخلايا العصبية لأسفل نحو طبقة الخلايا الدبقية. إضافة ما مجموعه 4-5 coverslips في طبق الدبقية.
  15. بعد يومين أو ثلاثة أيام والطلاء، وإضافة محلول آرا-C إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في طبق لإيقاف نمو الدبقية.
  16. تغذية الخلايا مرة واحدة في الأسبوع عن طريق استبدال 2 مل من المتوسط ​​القديم مع 2.5 مل من متوسطة جديدة في كل رضاعة. وسيلة اضافية المضافة هي لتعويض التبخر مع مرور الوقت، ويتم تغيير سوى جزء من وسيلة لضمان تكييف ثابت من المتوسط ​​من قبل الخلايا الدبقية. هذه الثقافات هي عادة صحية لمدة شهر واحد على الأقل (الشكل 3). ويمكن تحسين بقاء الخلايا العصبية عن طريق إضافة APV إلى مستنبت إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر. APV هو مستقبلات NMDA ويعزز البقاء على قيد الحياة عن طريق الحد من الغلوتامات التحفيز الزائدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الطريقة "ساندويتش" الثقافة الخلايا العصبية الأولية، والخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 3) تنمو على سرير من الخلايا الدبقية (الشكل 1) مفصولة الخرز البارافين (الشكل 2). وهذا يضمن أن الخلايا العصبية تنمو بشكل انتقائي على coverslips الزجاج مع الحد الأدنى من تلوث الخلية الدبقية لكن تلقي الدعم الغذائي الكافي من الدبقية المتزايد على طبق زراعة الأنسجة. عادة، الخلايا العصبية يمكن الحفاظ على ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في حين أن أسلوب "ساندويتش" من الخلايا العصبية زراعة وصفت أيضا في أماكن أخرى 2، 11، هناك العديد من الخطوات في جميع أنحاء البروتوكول الذي يصعب جدا لوصف في النص وحده، الذي يمكن أن يؤدي إلى الإحباط للمحققين الذين يرغبون في اعتماده.

ويمكن تقسيم طريقة إلى ثلاثة مسارات رئيسية: ثقافة الدبقية، وإعداد ساترة والثقافة الخلايا العصبية والصيانة. كل الاستعدادا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل CIHR MOP-142209 لTJS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<أدوات تشريح قوية> < / قوي >
مقص تشريح دقيقRobozRS-5910
مقص زنبركي مايكروتشريح RobozRS-5650
مقص زنبركي مايكرو التشريحRobozRS-5605
ملقط دومون 0RobozRS-5045
Dumont ملقط (#PP)RobozRS-4950
Name< / strong>Company < / strong> Catalog Number< / strong>تعليقات< قوي
> <قوي>إعداد الأنسجة< قوي>
التربسين (2.5٪)Gibco15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25٪)Gibco25-200-072
حامل فلتر سوينكس ، 25 & nbsp ؛ ممEMD MilliporeSX0002500تستخدم كمصفاة خلية. قم بالتجميع أولا باستخدام الفلتر والأوتوكلاف
IsofloranePharmaceutical Partners of Canada Inc.CP0406V2
مقياس الدمHausser Scientific1492
Grade 105 Lens CleaningHealthcare2105-841يستخدم كمصفاة خلايا. قم بتجميع أولا في حامل الفلتر
وماصات باستور زجاجية الأوتوكلاف مع فلتر قطنيVWR14672-412
HEPES (1 M)Gibco15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution بدون كالسيوم ومغنيسيوم وأحمر فينول (HBSS ، 10x)Gibco14-185-052
ماصات زجاجية باستورVWR14672-380
ديوكسيريبونوكلياز I من البنكرياس البقري (Dnase)Sigma-AldrichDN25-100mg
موقد بنسن البوتانWall-Lenk Mfg. Co.نموذج 65
جهاز طرد مركزيEppendorf5810R
NameCompany Catalog NumberComments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-122
طبق بتري (100 مم)بتريFB0875712
(60 مم)فيشرFB0875713A
سيروم الحصانجيبكو16050-122يمكن استخدامه بدلا من BGS ، ولكن يجب اختبار كل دفعة بسبب الاختلاف بين القطع. يوصى بتعطيل المصل بالحرارة.
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS318-1
بيروفات الصوديومسيجما-ألدريتشP2256
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM)جيبكو11-095-080
نيوروقاعدال متوسطجيبكو21-103-049
L-جلوتامين (200 ملم)جيبكو25-030-081
مكمل جلوتا ماكسجيبكو35050061يمكن استخدامه بدلا من L-Glutamine في طبق الثقافة المتوسط NBG
(60 مم)Corning، Inc353002
قوارير الثقافة (75 سم ^ 2)Greiner Bio-One658170
Cytarabine (Ara-C)Sigma-AldrichC3350000
D- (+) -GlucoseSigma-AldrichG8270
مصل نمو الأبقار (BGS)HyCloneSH3054103يوصى بتعطيل الحرارة قبل الاستخدام.
مكمل B27 (50x)Gibco17-504-044
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418-100 مل
قوارير مبردةVWR89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)Sigma-AldrichA5282
NameCompanyرقم الكتالوج< / قوي >< قوي > تعليقات < / قوي >
< قوي > إعداد الغطاء < / قوي >
ديكاهيدرات رباعي الصوديوم (البوراكس)سيجما ألدريتشB9876-1KG
بولي إل ليسين هيدروبروميدسيجما ألدريتشP2636
شمع البارافين هيستوبلاستفيشر 22-900-700
فرن الحمل الحراري بالجاذبيةVWR89511-404يستخدم لطريقة تنظيف الغطاء البديلة التي تمت مناقشتها في بروتوكول
الحمام بالموجات فوق الصوتية (Sonicator)فيشر 15337400
حامض النيتريكAnachemia62786-460
رفوف تلطيخ السيراميكتوماس سيانتيفك8542E40تستخدم لطريقة تنظيف الغطاء البديلة التي تمت مناقشتها في البروتوكول
CoverslipsGlaswarenfabrik Karl Hecht  تعتبر الشركة المصنعة GmbH1001/18مهمة جدا ، حيث أن الخلايا العصبية لا تلتصق جيدا بالزجاج منخفض الجودة ؛
حمض البوريكسيجما-ألدريتشB0252
NameCompany Catalog NumberComments
Miscellaneous
SyringeFilters VWR28145-477تستخدم مع حقنة BD ل حقنة تعقيم الترشيح
 BD302832تستخدم مع مرشحات المحاقن المعقمة VWR للتعقيم
بحمام مائيفيشر ساينتفيك15-460-16Q
مجهر مقلوبأوليمبوسCKX41
15 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة المخروطيةالحرارية العلمية339650
50 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة المخروطية339652
Tissue GE طبق فيشرSterile بفلتر

المراجع

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
  4. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  5. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
  6. Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
  7. Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
  8. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  9. Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
  10. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  11. Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
  12. Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة