مقالة منهجية

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

ديسمبر 12, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف البروتوكولات التجريبية لإعداد ذبابة الفاكهة في مراحل نمو مختلفة وإجراء التصوير البصري الطولي لذبابة الفاكهة بنبضات القلب باستخدام نظام مجهري التماسك البصري المخصص (OCM). يمكن تمييز التغيرات المورفولوجية والديناميكية القلبية كميا من خلال تحليل المعلمات الهيكلية والوظيفية للقلب من صور OCM.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساهم الدراسة الطولية لنبضات القلب في الصغيرة في فهم التغيرات الهيكلية والوظيفية أثناء نمو القلب. ثبت أن الفحص المجهري للتماسك البصري (OCM) قادر على تصوير قلوب الصغيرة بدقة مكانية عالية وسرعة تصوير فائقة. يجعل تباين الصورة العالي والخصائص غير الغازية OCM مثاليا لإجراء الدراسات الطولية دون الحاجة إلى تشريح الأنسجة أو تلطيخها. ذبابة الفاكهة تم استخدامها على نطاق واسع ككائن حي نموذجي في دراسات نمو القلب نظرا لعددها الكبير من جينات الأمراض البشرية المتعامدة ، وتشابهها في الآليات الجزيئية والمسارات الجينية مع الفقاريات ، ودورة حياتها القصيرة ، وتكلفتها المنخفضة للثقافة. هنا ، يتم وصف البروتوكولات التجريبية لإعداد ذبابة الفاكهة والتصوير البصري لنبضات القلب باستخدام نظام OCM مخصص طوال دورة حياة العينة. باتباع الخطوات الواردة في هذا التقرير ، يمكن الحصول على صور عرضية للوضع M و 3D OCM لإجراء دراسات طولية لمورفولوجيا القلب ذبابة الفاكهة ووظيفتها. كما تم عرض صور OCM المقطعية والمحورية والرسوم البيانية لمعدل ضربات القلب (HR) وفترة نشاط القلب (CAP) ، لتحليل التغيرات الهيكلية للقلب وتحديد ديناميكيات القلب أثناء ذبابة الفاكهة ، جنبا إلى جنب مع مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها باستخدام صور الوضع M لتتبع نشاط القلب بشكل حدسي. نظرا للتشابه الجيني بين ذبابة الفاكهة والفقاريات ، يمكن أن تساعد الدراسة الطولية لمورفولوجيا القلب وديناميكياته في ذباب الفاكهة في الكشف عن أصول أمراض القلب البشرية. سيوفر البروتوكول هنا طريقة فعالة لإجراء مجموعة واسعة من الدراسات لفهم آليات أمراض القلب لدى البشر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة طولية من القلب في الحيوانات الصغيرة تساهم في فهم مجموعة متنوعة من أمراض القلب والشرايين المتصلة بها الإنسان، مثل المتعلقة الجين عيوب القلب الخلقية 1،2. في العقود الماضية، نماذج حيوانية مختلفة، مثل 3،4 الماوس، القيطم 5،6، 7،8 الزرد، الطيور 9، وذبابة الفاكهة 10-16، وقد استخدمت لإجراء الإنسان القلب وتطوير الأبحاث ذات الصلة. وقد استخدم على نطاق واسع في نموذج الفأر لدراسة تطوير القلب العادية وغير العادية والظواهر عيب في القلب بسبب التشابه مع 3،4 قلب الإنسان. الجنين القيطم يكون مفيدا بشكل خاص في دراسة التنمية القلب نظرا لسهولة التعامل والجزئي 5،6 الشفافية. الشفافية في جنين واليرقة في وقت مبكر من طراز الزرد يسمح للمراقبة البصرية سهلة من 7،8 تطوير القلبية. نموذج الطيور هو موضوع مشترك للدراسات القلب التنموية becausالبريد قلب يمكن الوصول إليها بسهولة بعد إزالة قشر البيض والتشابه الصرفي من قلوب الطيور إلى البشر 9. نموذج ذبابة الفاكهة لديه بعض الميزات الفريدة التي تجعله مثاليا لإجراء دراسات طولية من القلب. أولا، وأنبوب القلب من ذبابة الفاكهة هو ~ 200 ميكرون تحت السطح الظهري، التي توفر الراحة للوصول البصرية ومراقبة القلب. بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها العديد من الآليات الجزيئية ومسارات الوراثية بين ذبابة الفاكهة والفقاريات. تم العثور على orthologs أكثر من 75٪ من جينات المرض الإنسان في ذبابة الفاكهة، والتي جعلت من استخدامها على نطاق واسع في الدراسات المعدلة وراثيا 11،13. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه دورة حياة قصيرة وانخفاض تكاليف الصيانة، وكان يشيع استخدامها كنموذج عينة للبحوث البيولوجيا التطورية 14-16.

ووصفت التقارير السابقة البروتوكولات لرصد وظائف القلب ذبابة الفاكهة مثل انهartbeat. ومع ذلك، كان مطلوبا إجراءات تشريح 17،18. يوفر التصوير الضوئي وسيلة فعالة لتصور تطور القلب في الحيوانات نظرا لطبيعتها غير الغازية. وقد تم تطبيق مختلف طرائق التصوير الضوئي في أداء الحيوان دراسة القلب، مثل ثنائي الفوتون المجهري 19، الفحص المجهري متحد البؤر 20،21، وعلى ضوء ورقة الفحص المجهري 22، والتصوير المقطعي التماسك البصري (أكتوبر) 16،23-26. نسبيا، أكتوبر قادرة على توفير عمق التصوير عظيم في قلوب الحيوانات الصغيرة دون استخدام عوامل التباين، مع الحفاظ على دقة عالية وسرعة التصوير عالية جدا، والتي هي مهمة لتصوير الحيوانات الحية. بالإضافة إلى ذلك، انخفاض تكلفة تطوير نظام أكتوبر وقد عمرت هذه التقنية للتصوير الضوئي من العينات. وقد استخدم أكتوبر بنجاح لدراسة طولية من ذبابة الفاكهة. باستخدام أكتوبر، وقد تم إجراء القلب التصوير المورفولوجية والوظيفية لدراسة هياكل القلب، وظائفهاالأدوار tional من الجينات، وآليات عيوب القلب والأوعية الدموية في نماذج متحولة خلال تطوير القلب. على سبيل المثال، تم تأكيد تعتمد على سن انخفاض وظيفة القلب مع (ACER) الجين التنظيم أسفل المحول للأنجيوتنسين المتعلقة الانزيم في ذبابة الفاكهة مع 27 أكتوبر. وقد تجلى Phenotyping من اعتلال عضلة القلب المتعلقة الجيني في ذبابة الفاكهة باستخدام أكتوبر 28-33. كما كشفت الأبحاث التي تستخدم أكتوبر دور وظيفي من الجينات SOX5 البشري في قلب ذبابة الفاكهة 34. مقارنة مع أكتوبر، يستخدم OCM هدفا مع الفتحة العددية أعلى لتوفير تحليل أفضل عرضية. في الماضي، وقد تمت دراسة الخلل القلب الناجم عن إسكات الجينات الساعة البيولوجية البشرية ortholog dCry / dClock باستخدام نظام OCM مخصصة 15،16، فضلا عن تأثير ارتفاع الدهون الحمية على بعضلة القلب في ذبابة الفاكهة لفهم السمنة التي يسببها الإنسان أمراض القلب. 15

هنا، التتلخص البريد بروتوكول تجريبي لدراسة طولية من التغيرات الشكلية والوظيفية القلب في ذبابة الفاكهة في الطور الثاني (L2)، الطور الثالث (L3)، يوم خادرة 1 (PD1)، يوم خادرة 2 (PD2)، خادرة يوم 3 (PD3) ، خادرة يوم 4 (PD4)، يوم خادرة 5 (PD5)، والكبار (الشكل 1) باستخدام OCM لتسهيل دراسة أمراض القلب الخلقية المتعلقة الإنسان. وقد تم تحليل المعلمات الوظيفية القلب، مثل الموارد البشرية وCAP كميا في مراحل النمو المختلفة للكشف عن ملامح التطوير في القلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد نظام OCM للتصوير الضوئي من ذبابة الفاكهة 16

  1. حدد مطياف وخط عالية السرعة كاميرا المسح الضوئي التي توفر الإطار معدل لا يقل عن 80 إطار / ثانية وبالتالي فإن النظام OCM سوف تكون قادرة على حل ضربات القلب من ذبابة الفاكهة.
  2. استخدام مصدر ضوء النطاق العريض لضمان القرار المحوري من 2 ميكرون لتحديد بنية القلب ذبابة الفاكهة.
  3. استخدام هدفا 10X للحصول على قرار عرضية عالية.
  4. استخدام مرآة 45 ° قضيب لتعكس شعاع ضوء ذراع المرجعية ولتوليد شعاع ضوء ذراع عينة حلقي تمديد عمق التركيز في العينات.
  5. تطوير برنامج كمبيوتر مخصص للسيطرة على النظام OCM وإجراء القياسات.

2. ذبابة الفاكهة الثقافة

  1. معيار يطير إعداد الطعام
    1. وضع ~ 5 مل صيغة ذبابة الفاكهة فورية إلى قارورة البوليسترينأنبوب بمساعدة من ورقة شلال.
    2. صب ~ 8 مل من الماء إلى صيغة لتشبع الطعام بشكل سليم.
    3. إضافة المكملات الغذائية المختلفة إلى الطعام ذبابة القياسي لتجارب مختلفة. عند التحضير للعموم -retinal (ATR) الغذاء عبر لعلم البصريات الوراثي سرعة التجربة 35، واستخدام ماصة لاستخراج 100 ملي ATR وتذوب في ~ 8 مل من الماء للحصول على تركيز ATR من 1 ملم في الغذاء. بعد خلط حل موحد، من أجل حل في الصيغة ويحرك بشكل كاف.
    4. لإعداد بالدهون على النظام الغذائي لدراسة المرتبطة بالسمنة الاختلالات القلب في ذبابة الفاكهة، 10،15 مزيج ~ 10 مل صيغة مع 15 مل من الماء في كوب والحرارة لمدة 30 ثانية في فرن الميكروويف. وضع بعض عضوي زيت جوز الهند البكر الممتاز في كوب آخر وتسخينها لمدة 90 ثانية في فرن الميكروويف.
    5. استخراج 7.5 مل زيت جوز الهند وتخلط مع الصيغة مستعدة بدرجة كافية لجعل وزن / حجم نسبة زيت جوز الهند في الغذاء ~ 30/100، وعشرأون استخراج ~ 2 مل مختلطة المواد الغذائية ووضعها على الجزء السفلي من الأنبوب.
    6. الانتظار لمدة 1 دقيقة حتى يتشبع المتوسطة بدقة. ضغط الطعام بعناية مع سطح مستو لتحسين الظروف المعيشية للذبابة الفاكهة. إضافة 6-8 حبات من خميرة للصيغة المعدة، وتوصيل أنبوب مع مجموعة من القطن.
  2. ذبابة ثمار الصلبان والثقافة
    1. اخذت انبوب مع الطعام ذبابة القياسية استعداد، وإزالة القطن توصيله. نقل بعناية الذباب الكبار (الذكور والإناث) إلى أنبوب، وتوصيل أنبوب مع القطن على الفور. تحقق من القطن للتأكد من عدم وجود فجوة بين القطن وجدار أنبوب لمنع الذباب من الهروب من الأنبوب.
    2. الحفاظ على ذباب الفاكهة في الحاضنة عند 25 درجة مئوية لمدة التهجين. معظم الجينات نشط ويتم توليفها البروتينات الخلوية عند 25 درجة مئوية 36-39.
    3. خذ أنبوب الخروج من الحاضنة بعد 8 نقل يد لالكبار بإجراء الذباب من أنبوب للحصول على البيض في نفس المرحلة العمرية للسيطرة التجريبية.
    4. مواصلة زراعة البيض في الحاضنة عند 25 درجة مئوية، وهي درجة حرارة قياسية لتطوير ذبابة الفاكهة مع فترة التنمية من 8.5 أيام 40،41.
      ملاحظة: درجة الحرارة يؤثر على فترة التنموية (البيض إلى الكبار) ومستوى التعبير عن الجينات المختلفة.

3. إجراء التصوير الضوئي مع OCM

  1. جبل يطير اليرقة للتصوير الضوئي
    ملاحظة: بيضة تفقس ذبابة الفاكهة في 22-24 ساعة عند 25 درجة مئوية إلى اليرقة الطور الأول (L1). تبرز اليرقة الطور الثاني بعد 24 ساعة أخرى. أكبر شكل اليرقات هو اليرقة الطور الثالث، الذي الصوف بعد حوالي 24 ساعة. الخصائص الهيكلية في يرقة يمكن استخدامها لتمييز مراحل النمو المختلفة. حجم فمها بين الطور الأول والطور الثاني هو مختلف. الفمالسنانير أول اليرقة الطور صغيرة جدا وتبدو مثل اثنين من أزواج من البقع السوداء الصغيرة، في حين أن السنانير فم اليرقة الطور الثاني أكبر وهيكل هو أكثر وضوحا. هل تستخدم الفتحات التنفسية عادة لتحديد الطور الثاني والطور الثالث. وقد بالهراوات اليرقة الطور الثاني الفتحات التنفسية الأمامية، في حين، لالطور الثالث، وتشعبت في الفتحات التنفسية الأمامية. وسوف تبدأ حلقة البرتقالية الداكنة ليظهر في غيض من الفتحات التنفسية الخلفي في اليرقة الطور الثالث.
    1. تنطبق على قطعة من الشريط مزدوجة من جانب إلى شريحة ميكروسكوب نظيفة. طرد فقاعات الهواء تحت الشريط لتفادي الانعكاسات الناجمة عن فقاعات الهواء أثناء التصوير.
    2. تأخذ واحدة من الأنابيب مع الذباب مثقف الخروج من الحاضنة في مرحلة اليرقات.
    3. تحديد اليرقة في وسائل الإعلام، إزالته من وسائل الإعلام مع فرشاة ناعمة ومكان على منديل نظيف. إزالة أي طعام تمسك اليرقة مع فرشاة ناعمة رطبة وجافة على الأنسجة.
    4. نقل cleaneد تطير إلى الأنسجة تحت عدسة الهدف المجهر حقل واسع.
    5. ضبط بؤرة المجهر لإيجاد رؤية واضحة للذبابة. تحديد المرحلة التنموية الصحيحة لليرقة من الخصائص الهيكلية مع المجهر.
    6. ضع الطاير باستخدام فرشاة ناعمة. ضمان الجسم مباشرة مع الجانب الظهري التي تواجه التصاعدي للتحضير للتركيب على شريحة زجاجية من قبل الجانب الظهري. تنفيذ هذه الخطوة تحت المجهر.
    7. ضمان يرقة جافة تماما قبل التركيب على الشريط. وإلا فإن اليرقة لا تلتزم الشريط.
    8. عصا الجانب الظهري للذبابة وضعه على الشريط ضعف الجانب على شريحة زجاجية مع ضغط معتدل. لاحظ أن الكثير من الضغط قد تقتل ذبابة والقوة القليل جدا من شأنها أن تؤدي إلى يطير الحركة أثناء التصوير.
  2. التصوير الضوئي من ذبابة الفاكهة في أطوارها اليرقية (L2 و L3) مع OCM
    ملاحظة: التجويف واسعة من أنبوب القلب يمكن أن يكون فواوند تقع في قطاعات بين A5 إلى A8 في مراحل اليرقات (الشكل 1). تم الحصول على الصور OCM M-وضع عرضية (2D + الوقت) في الجزء A7 من أنبوب القلب لكل يرقة لتسهيل الانقباضي والانبساطي تحليل.
    1. وضع اليرقات التي شنت على المسرح عينة قابل للتعديل للنظام OCM على طول اتجاه ذ عرضية مع الجانب الظهري التي تواجه التصاعدي تحت عدسة الهدف. ثقب صغير في المرحلة عينة ضروري لوضع اليرقة لتجنب الاتصال مع الطائرة المرحلة.
    2. ضبط المرحلة عينة لتحريك أنبوب القلب من ذبابة الفاكهة إلى المستوى البؤري للشعاع التصوير. بسهولة العثور على شريحة A7، والعثور على المنطقة الخلفية لأنبوب القلب مع الوقت الحقيقي عبر قطاعات صور OCM في البرنامج الحصول على الصور. ثم نقل إلى الأمام حتى مرحلة شريحة A7 مرئيا.
    3. تعيين المعلمات من البرنامج الحصول على الصور إلى 100 ألف بالاشعة في B-الفحص (الإطار)، و 100 B-بالاشعة، وscanneص الجهد لتغطية ~ 0.28 مم في اتجاه س عرضية، و 0 V في الاتجاه ذ عرضية. انقر على زر "ابدأ" في البرنامج للحصول على البيانات من الضوضاء في الخلفية عن خلفية الطرح عن طريق عرقلة مسار الشعاع عينة بقطعة قماش سوداء.
      ملاحظة: 3 من 100 لقطة يمكن استخدامها لخلفية الطرح.
    4. تعيين المعلمات من البرنامج الحصول على البيانات إلى 128 ألف بالاشعة في B-المسح الضوئي، 4096 بمسح B، والماسح الضوئي الجهد لتغطية ~ 0.28 مم في اتجاه س عرضية، و 0 V في الاتجاه ذ عرضية. انقر على زر "ابدأ" في البرنامج للحصول على مستعرض الصور M الوضع في قطاع A7 من الأنبوب يطير القلب على منطقة تغطي 0.28 س 0.57 ملم 2 لمدة 30 ثانية.
    5. منع شعاع التصوير باستخدام قطعة قماش داكنة أثناء عملية توفير البيانات لتجنب التعرض المطول للقلب يطير إلى ضوء التصوير.
    6. تكرار القياس لمدة 5 مرات للحصول على قياس موثوق به للمتعة القلبction.
    7. تعيين المعلمات من البرنامج الحصول على الصور إلى 400 ألف بالاشعة في B-المسح الضوئي، 800 B-بالاشعة، والماسح الضوئي الجهد لتغطية ~ 1.7 مم في اتجاه س عرضية، و~ 4 مم في الاتجاه ذ عرضية. نقل المرحلة في كلا الاتجاهين لضمان ذبابة الفاكهة كامل يمكن تصوير. انقر على زر "ابدأ" في البرنامج للحصول على بيانات واحدة للحصول على صور من ذبابة الفاكهة في 3 أبعاد. ملاحظة: هيكل ذبابة 3D يمكن عرضها باستخدام برنامج أميرة 3D
    8. استخدام فرشاة ناعمة مبللة لترطيب الطاير قياس وبلطف إزالته من شريحة زجاجية. تحريكه في أنبوب منفصل عن التطوير المستمر. تسمية أنبوب للدراسة طولية من خلال المراحل التنموية القادمة.
  3. صورة ذبابة الفاكهة في مراحل العذراء
    وقد تم نقل كل ذباب الفاكهة من التصوير من PD1 إلى PD5: ملاحظة. كما هو مبين في التخطيطي يرقة في الشكل 1B، يبقى تجويف واسع في A5 إلى شرائح A8 من اله أنبوب القلب حتى PD1. من PD2، تبدأ غرفة مخروطية لتطوير بين A1 إلى شرائح A4. للحصول على صور متناسقة وتسهيل التحليل القلب، وقد تم الحصول عرضية الصور M-وضع من قطاع A7 في PD1، ومن قطعة A1 بعد PD2، كما تميز في الشكل 1B.
    1. صورة ذبابة الفاكهة في PD1
      ملاحظة: ذبابة الفاكهة لديها puparium الأبيض لنافذة زمنية قصيرة (0-1 ساعة) خلال PD1. هذه النافذة الوقت المثالي لأداء التصوير الضوئي من خادرة في وقت مبكر لأن الشفافية العالية تؤدي إلى اختراق الضوء العالي للتصوير OCM.
      1. كما تم العثور على ذباب الفاكهة على جدار الأنبوب عندما تصبح خادرة، وإزالة خادرة من أنابيب الفردية للتصوير في PD1 مع فرشاة ناعمة رطبة، وتنظيف خادرة مع الفرشاة إذا كان هناك الغذائية عالقة على الجسم.
      2. جبل ذبابة الفاكهة على شريحة زجاجية صغيرة مباشرة مع فرشاة مبللة والحفاظ على الجانب الظهري التي تواجه التصاعدي (الشكل 1A
      3. إزالة المياه الزائدة من جانب هيئة الطيران.
      4. وضع شريحة زجاجية على المسرح عينة من نظام OCM، والحفاظ على ذبابة الفاكهة على القمة. البحث عن صورة واضحة في الوقت الحقيقي من قطاع A7 من قلب الذبابة استخدام نفس الاستراتيجية موضح في قياس يرقة.
      5. تعيين نفس المعلمات من البرنامج الحصول على البيانات كما في القسم 3.2، وصورة ضربات القلب في الجزء A7 لاكتساب عرضية M-وضع والصور 3D.
      6. بعد التصوير، واستخدام الملقط لوضع شريحة زجاجية مع خادرة مرة أخرى في أنبوب للثقافة مستمرة.
    2. صورة ذبابة الفاكهة في PD2 إلى مراحل PD5
      ملاحظة: منذ العينة يصبح أكثر وأكثر غموضا خلال المراحل العذراء، سيتم تخفيض عمق الاختراق من نظام التصوير.
      1. استخدام الملقط لإزالة بعناية الزجاج الصورةشنت LIDE مع الذبابة في PD2 من أنبوب للتصوير. في PD2، وقذيفة عينة تصبح صفراء ويصبح الجسم أقل شفافية مقارنة PD1 (الشكل 1).
      2. وضع الشريحة على المسرح عينة من نظام OCM.
      3. ضبط المرحلة عينة لتحريك الطيران في طائرة الوصل من شعاع التصوير من نظام OCM. العثور على نهاية الأمامي من أنبوب القلب في الوقت الحقيقي مع صورة OCM مستعرضة. نقل ~ 50 ميكرون في الاتجاه الخلفي للعثور على قطعة A1 من أنبوب القلب.
        ملاحظة: عند هذه النقطة التنمية القلب (PD2)، وغرفة مخروطية تكون صغيرة جدا ولا يجوز الضرب.
      4. جمع عرضية مجموعات البيانات M-وضع من قطاع A1 فضلا عن بيانات 3D باستخدام نفس الطريقة مراحل النمو السابقة.
      5. وضع الشريحة إلى أنبوب بعناية للثقافة مستمرة.
        ملاحظة: في PD3، لون العينة في وعاء أغمق من ذلك في مرحلة PD2. في مرحلة PD4، كاليفورنيا خطوط سوداءن ملاحظتها داخل وعاء من العينات. فإن بعض الذباب تتطور الى الكبار من هذه المرحلة في اليوم التالي، في حين أن آخرين سوف تتطور إلى PD5. في مرحلة PD5، خطوط سوداء، بل هي أكثر وضوحا ينظر في ذباب الفاكهة. وسوف تصبح هذه الذباب الكبار في اليوم التالي.
  4. صورة ذبابة الفاكهة في المرحلة الكبار
    ملاحظة: في مرحلة البلوغ، الذباب الإناث والذكور يمكن تمييزها حسب حجم الجسم ولون البطن. الإناث البالغين لديهم حجم أكبر، في حين أن الذكور أصغر حجما وفي أسفل البطن الداكنة اللون.
    1. خذ أنبوب الخروج من الحاضنة عندما تطور ذبابة الفاكهة إلى الكبار، ونقل الكبار يطير إلى ~ 45 مل قارورة فارغة.
    2. تراجع نهاية ماصة (~ 1 سم طول، ~ مم 3) من عصا في التخدير، ووضع عصا في قارورة، وتوصيل أنبوب مع مجموعة من القطن للحفاظ على نهاية مخدر تحت القطن توصيل فقط و انيسthetize الطاير لمدة 3 دقائق. مدة التخدير تعتمد على حجم الذبابة، ويمكن أن تختلف بين 2،5-3،5 دقيقة (على سبيل المثال: الذكور مقابل 2.5 دقيقة، أنثى لمدة 3 أو 3.5 دقيقة).
    3. إعداد شريحة زجاجية مع قطعة من الشريط مزدوجة من جانب.
    4. نقل ذبابة تخدير على شريحة زجاجية مع الجانب الظهري تواجه أعلى باستخدام فرشاة ناعمة.
    5. فصل الأجنحة باستخدام الملقط والعصا الأجنحة على الشريط تحت المجهر لإصلاح الطاير وفضح منطقة القلب للتصوير.
    6. صورة الطاير من قطاع A1 من القلب ذبابة (الشكل 1). في نهاية التجربة، يمكن التضحية الطاير.

4. التصوير تحليل 16

  1. تطوير برامج ماتلاب لتحويل 2D و 3D الملفات الثنائية التي تم جمعها مع البرنامج الحصول على صورة لملفات الصور.
  2. استخدام يماغيج لتحديد المنطقة أنبوب القلب في مستعرض الصور M-وضع وخوارزمية عصا سحرية ليخلققناع عصام المنطقة القلب لكل صورة M-وضع عرضية. شريحة المنطقة ملثمين واستخدام خوارزمية لتقصي الذروة لتحديد المواقع الانقباضي والانبساطي. حساب الوقت تعتمد التغييرات قطرها القلب من مستعرض الصور M واسطة.
  3. على أساس الوقت اكتسب أقطار القلب التابعة، حساب المعلمات القلب مثل الموارد البشرية، وفترة النشاط القلبي (CAP)، نهاية قطرها انبساط (إد)، نهاية قطرها إنقباض (ESD)، نهاية منطقة انبساط (EDA)، ووضع حد لمنطقة انقباض ( وكالة الفضاء الأوروبية). حساب تقصير كسور (FS) مع figure-protocol-1
  4. استخدام يماغيج لتحليل الصور 3D OCM لتصور التطوير الهيكلي للقلب الذبابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجري تصوير القلب طولية باستخدام ذبابة الفاكهة مع 24B-GAL4 / + السلالة في درجة حرارة الغرفة مع OCM. أجريت القياسات في L2، L3، وفي 8 فترات ساعة من PD1 إلى PD4، ويوم والكبار 1 (AD1) لتتبع عملية التحول (الجدول 1). وقد شنت يرقة، خادرة في وقت مبكر، في وقت متأخر خادرة والكبار الذباب على الشرائح الزجاجية كما رأينا في الشكل 1A. وقد أظهرت ملامح جزء من القلب لالذباب اليرقات والكبار في التمثيل التخطيطي في الشكل 1B.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسرعة ضربات القلب من ذبابة الفاكهة، مع حد أقصى لHR حوالي 400 نبضة في الدقيقة في مراحل اليرقات والكبار، يتطلب عالية السرعة التصوير لحل الإنبساط القلب والإنقباضات (ما لا يقل عن 80 لقطة / ثانية استنادا إلى الخبرات). نظرا لصغر حجم الغرفة القلب وميكرون على نطاق وسمك جدار القلب (5-10 ميكرون)، وهو قرار مكانية عالية (أفضل من 2 ميكرون) مطلوب لحل الهياكل أنبوب القلب. في هذه الدراسة تم تطوير استبانة عالية ونظام OCM سرعة عالية جدا، حيث تم استخدام مطياف مع انتقال 600 خطوط / مم صريف وك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بالدراسة الحالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء تشغيل جامعة ليهاي ، والمعاهد الوطنية للصحة (R00EB010071 إلى CZ ، R15EB019704 إلى CZ و LED ، R03AR063271 إلى LED ، و R01AG014713 و R01MH060009 إلى R.E.T.) ، و NSF (1455613 إلى CZ و SALT ) ، وصندوق علاج الزهايمر (إلى R.E.T.) ، ومستشفى ماساتشوستس العام (جائزة اللجنة التنفيذية للأبحاث إلى LL). تم دعم MC و YM من قبل البرنامج الوطني للبحوث الأساسية الرئيسية من الصين (برنامج 973) بموجب المنحة رقم 2014CB340404.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام تصوير OCM مخصصتم تطويره في مختبرنا
بلدي Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
غطاء زجاجيAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
فورية ذبابة الفاكهة صيغةCAROLINA4-24
خميرةActiveDry
مجهرSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bيستخدم لنقل العينات برنامج
LabviewNational Instruments
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة
MatlabMathworks
TweezerWihaAA SAلإصلاح الفاكهة أجنحة الطيران
FlyNapCarolina Biological Supply Company4،224،898
سكوتش الشريط الدائم على الوجهين ، 3 Mسكوتش
ماصةفيشربراندMU18837
زيت جوز الهند العضوي الإضافي SpringValley13183
مجهر شريحةCapitolالعلامة التجاريةM3504-E
ذبابة الفاكهة < / أنا > قواريرSEOH8401SS
Sigma-Aldrichعبر الشبكيةR2500
شركة بالكامل.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila M OCM

مقالات ذات صلة