مقالة منهجية

اختبار القدرة الأوعية الدموية الغازية من خلايا السرطان في الزرد (

11.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55007

⸱

نوفمبر 3, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

في هذه المقالة

ملخص

هذه الطريقة تستخدم الأجنة الزرد لاختبار كفاءة القدرة الغازية الأوعية الدموية للخلايا السرطانية. يتم حقن الخلايا السرطانية الفلورسنت في الجيوب الأنفية أو أمام القلب الكيس المحي من الأجنة النامية. ويتم تقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية والتسرب عن طريق الفحص المجهري مضان من منطقة الذيل في وقت لاحق 24-96 ساعة.

الملخص

غزو الأوعية الدموية للخلايا السرطانية والتسرب هو السمة المميزة للتقدم النقيلي. عادة ما تفتقر النماذج التقليدية في المختبر لغزو الخلايا السرطانية للبطانة إلى ديناميكيات السوائل التي تتعرض لها الخلايا الغازية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن الأنظمة في الجسم الحي مثل نماذج الفئران ، على الرغم من أنها أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية ، تتطلب نطاقات زمنية تجريبية أطول وتمثل تحديات فريدة مرتبطة بالمراقبة وتحليل البيانات. نصف هنا اختبار الزرد الذي يسعى إلى سد هذه الفجوة التقنية من خلال السماح بالتقييم السريع لغزو الأوعية الدموية للخلايا السرطانية والتسرب منها. يتضمن النهج حقن الخلايا السرطانية الفلورية في الجيب قبل القلب لأجنة الزرد الشفافة التي يبلغ عمرها يومين والتي تتميز الأوعية الدموية بها بمراسل فلوري متناقض. بعد الحقن ، يجب أن تعيش الخلايا السرطانية في الدورة الدموية ثم تتسرب من الأوعية الدموية إلى الأنسجة في المنطقة الذيلية من الجنين. يتم تحديد الخلايا السرطانية المتبخلة بكفاءة وتسجيلها في الأجنة الحية عن طريق التصوير الفلوري في نقطة زمنية محددة. يمكن تعديل هذه التقنية لدراسة التقويم الداخلي و / أو المنافسة بين خليط غير متجانس من الخلايا السرطانية عن طريق تغيير موقع الحقن إلى كيس الصفار. يمكن لهذه الطرق معا تقييم السلوك المميز للخلايا السرطانية والمساعدة في الكشف عن الآليات التي تشير إلى تطور الخبيث إلى النمط الظاهري النقيلي.

المقدمة

المرض المنتشر هو سبب رئيسي لوفيات السرطان والعديد من الآليات التي تمكن من نشر الخلايا السرطانية ولا يزال يتعين اكتشافها 1. من أجل خلية السرطانية metastasize بنجاح، يجب أن غزو أولا من خلال سدى الذي يحيط الورم الرئيسي، أدخل (intravasate) في نظام الدورة الدموية، والبقاء على قيد الحياة في العبور، الخروج (يتسرب) من التداول، وإقامة أخيرا مستعمرة قابلة للحياة في موقع الجهاز البعيد 2. دخول الوعاء والتسرب وبالتالي فهي خطوات حاسمة في تتالي النقيلي، ولكن كل الخلايا السرطانية ليست بارعة بطبيعتها على تعطيل والهجرة من خلال تقاطعات البطانية 3. في الواقع، هناك سلسلة من الضغوط اختيار الفريدة التي تحيط الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية وعملية يمكن زيادة يتأثر بمجموعة من العوامل 4 الداخلية والخارجية. لهذه الأسباب، التقنيات التي تحقيق في السلوك العدواني من السرطان مرحلة متقدمة غالبا ما تركز على الخامسascular القدرة الغازية كوسيلة للتنبؤ انتشار النقيلي.

توجد أنظمة نموذج مختلف لتسهيل دراسة الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية في المختبر. الأكثر استخداما في فحوصات المختبر ينطوي إما أنظمة transwell لتقييم هجرة الخلايا السرطانية من خلال حاجز غشائي 5 أو التكنولوجيا الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS) لمراقبة اضطراب في الوقت الحقيقي من أحادي الطبقة البطانية سليمة من الخلايا السرطانية 6. هذه المقايسات تفتقر عادة ديناميات السوائل والعوامل اللحمية التي من شأنها أن تؤثر على خلاف ذلك مرفق الخلية السرطانية إلى جدار البطانية. وتحايلت هذه المسألة إلى حد ما عن طريق شبكات الأوعية الدموية perfusable التي تنشأ عن الثقافة 3D من بطائن مع دعم خلايا انسجة، وهذه النظم ميكروفلويديك 3D تمثل الآن طليعة الخيارات الحالية في المختبر 7،8. ومع ذلك، هذه النهج حذفت المكروية قوية لنظام الدورة الدموية وظيفيةوبالتالي فقط في بديل جزئي لنماذج في الجسم الحي.

الأكثر استخداما في نموذج الجسم الحي من غزو الأوعية الدموية هو الفأر، الذي يتم تنفيذ المقايسات الانبثاث التجريبية عادة لأنها تحدث على فترات زمنية قصيرة نسبيا وتدل عموما من قدرة النقيلي 9. وتشمل هذه المقايسات الحقن المباشر للخلايا السرطانية في الدورة الدموية وبالتالي نموذج المراحل النهائية من ورم خبيث، وهي التسرب والخلايا السرطانية الاستعمار الأعضاء. تختلف المقايسات الانبثاث التجريبية القائمين على الموقع من حقن الخلايا السرطانية وأجهزة تحليلها في نهاية المطاف. في أول نوع الفحص، يتم حقن الخلايا السرطانية في الوريد ذيل الفئران والبذر الخلايا السرطانية في الرئتين ويتم رصد 10،11. الفحص الثاني القيام الحقن داخل القلب لتوجيه البذر المنتشر نحو المكروية العظام 12-14، ولكن أيضا للدماغ (15). في مقايسة الثالث، سرطان جيتم حقن ملتعلمي اللغة اإلنكليزية في الطحال للسماح الاستعمار الكبد 16 في حين أن الطريق تسليم الرابع في الشريان السباتي يحمل خلايا السرطان إلى الدماغ 17،18. بغض النظر عن طريقة التسليم الخلايا السرطانية والاستعمار الجهاز هو نقطة النهاية التجريبية المقبولة ويتم تحديد عموما عبر التلألؤ، الأنسجة، أو التقنيات التي تعتمد PCR. على الرغم من المزايا الفسيولوجية إجراء فحوصات الانبثاث التجريبية ضمن مجموعة الفئران، وهذه التجارب لا تزال بحاجة إلى أسابيع أو أشهر لاستكمال وتحليل.

وقد ظهرت (دانيو rerio) نموذج الزرد مؤخرا نظاما جديدا لدراسة سرطان التقدم 19،20، وتتيح لتقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية في نظام الدورة الدموية وظيفية على مدى زمني أقصر بكثير بالمقارنة مع الفئران 21-24. طريقة تستخدم سلالة الزرد شفافة الذي بطائن لها الموسومة مع فلوو الشعاب المرجانية الخضراءrescent البروتين مراسل مدفوعا المروج kdrl، ومستقبلات الزرد لبطانة الأوعية الدموية عامل النمو 25. في الفحص، وصفت الخلايا السرطانية مع علامة فلوري الحمراء وحقنها في الجيوب الأنفية أمام القلب من الأجنة القديمة 2-اليوم. في أي مكان بين 48-96 ساعة بعد الحقن، والخلايا السرطانية التي غزت من الأوعية الدموية وفي المنطقة الذيلية من الأجنة يمكن سجل بكفاءة على المجهر الفلورسنت. نحن هنا تطبيق هذه التقنية لفريق من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية تستخدم عادة لإظهار الفوارق الصارخة في قدرة الغازية الأوعية الدموية الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، علينا أن نبرهن على تغيير موقع الحقن إلى كيس الجنين صفار يسمح لدراسة التفاعلات الخلية غير متجانسة، والسكان الخلايا السرطانية يمكن أن توصف بشكل مختلف مع الأصباغ الفلورية وحقنها في أجنة الزرد تفتقر الأوعية الدموية الفلورسنت. في هذا الاختبار الأخير، الخلايا السرطانية التي غزت صفار البيض وintravasated في vasculaturوسجل الإلكترونية في المنطقة الذيلية 24-48 ساعة بعد الحقن. نظرا لفعالية وراحة من هذا النموذج، ويعمل الزرد على نحو متزايد لاختبار بسرعة قدرة الغازية الأوعية الدموية من الخلايا السرطانية في ظل وضع فيزيولوجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: تم إنشاؤها الأجنة الزرد وفقا لبروتوكول IACUC المعتمدة. وقد أجريت هذه التجارب في الامتثال لتوصيات لجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة جورج تاون.

1. تنظيم الأجنة لحقن وخلق الحلول المالية

  1. توليد المطلوبة اليرقات الزرد لتقييم الخلايا السرطانية غزو الأوعية الدموية.
    1. اقامة الزوج الحكيم أو مجموعة في عبر التزاوج مع تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1، mitfa b692، ednrb1 B140 الأسماك.
      ملاحظة: نحن ولدت تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1، mitfa b692، ednrb1 B140 الزرد، عن طريق عبور تيراغرام (kdrl: grcfp) zn1 25، التي تعبر عن الشعاب المرجانية الخضراء المرجانية بروتين فلوري في الخلايا البطانية، مع الخط الذي يفتقر إلى الخلايا الصبغية، mitfa b692، ednrb1 B140، وضعت في مركز الزرد الدولي للموارد.
    2. شاركالبيض llect، نظيفة، وإزالة أجنة غير مخصبة أو المشوهة في اليوم التالي 22.
    3. احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية لتصبح جاهزة للحقن الخلايا السرطانية، لتحدث عند الأجنة الزرد هي 2 يوما بعد الإخصاب (2 DPF).
  2. جعل لوحات الحقن.
    1. تذوب 25 مل من 1.5٪ الاغاروز في DH 2 O لكل لوحة.
    2. صب 12 مل من الاغاروز إلى 100 ملم × 15 ملم طبق بتري والسماح لها تتصلب.
    3. إعادة تذوب ثم صب الاغاروز المتبقية في اللوحة.
    4. وضع على الفور قالب قطع الزجاج (3 ملم × 7.2 سم واسعة × 7.5 سم طويلة) بحيث تكون في زاوية 30 درجة إلى الاغاروز وضعه في وسط اللوحة.
      ملاحظة: هذا سيخلق حاد 60 درجة الجدار و30 درجة منحدر منحدر.
    5. الشريط القالب الزجاج في المكان والسماح للتتصلب الاغاروز.
    6. إزالة بلطف العفن والزجاج، ويجب الحرص على عدم المسيل للدموع الاغاروز.
      ملاحظة: قوالب يمكن تخزينها في DH 2 O في 4 درجات مئوية.
  3. تتوازن لوحة حقن مع أسماك المياه (0.3 جم / لتر ملح البحر).
    1. لوحة شطف مرتين مع الماء المقطر.
    2. تتوازن لوحة بإضافة 10 مل من الماء الأسماك إلى لوحة ومكان على شاكر لمدة 10 دقيقة.
    3. تتوازن لوحة للمرة الثانية مع أسماك المياه.
  4. تقسيم 2 يوما بعد الإخصاب (DPF) الأجنة إلى مجموعات حقن بتحويلها إلى أطباق تحتوي على أسماك المياه 22.
  5. إعداد أطباق انتعاش لكل مجموعة للاستفادة من بعد الحقن. ضمان أن الطبق الانتعاش يحتوي ماء 10 مل الأسماك، بالإضافة إلى البنسلين (25 ميكروغرام / مل)، والستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل).
  6. يعد حل تريكين 2X بإضافة 4 مل من الأسهم تريكين مخزنة (4 ملغ / مل، 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7) إلى 50 مل من الماء الأسماك بالإضافة إلى البنسلين والستربتومايسين.
  7. حل 15 ملغ انصهار منخفضة نقطة الاغاروز في 10 مل من 2X حل تريكين لتوليد المتوسطة مخدر متزايدة من شأنها أن شل الأجنة الحية لIMAGINز.
    يتكون تركيب المتوسط ​​من 1.5٪ الاغاروز: ملاحظة.
  8. سحب microinjection الإبر.
    1. وضع الزجاج الشعرية أنابيب في مجتذب ماصة العمودي. سحب الماصات مدبب طويل باستخدام 20 MAMP الحالية وعنصر التدفئة 2 لفائف.

2. خلايا السرطان وصفها مع محبة للدهون صبغ نيون

  1. الحفاظ على الخلايا السرطانية في ظروف ثقافة الموصى بها.
    ملاحظة: تم الحفاظ على هذه الخطوط في DMEM + 10٪ FBS: BT-474، قدم مكعبة-7، MDA-MB-231، MDA-MB-468، وSK-BR-3. واستمرت هذه السطور في RPMI + 10٪ FBS: HCC 1806 و T-47D. تم الحفاظ على جميع خطوط الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 أثناء الحضانة.
  2. تولد وحيدة الخلية تعليق من قبل النأي ثقافة ملتصقة الخلايا السرطانية.
    1. غسل الخلايا أولا مع برنامج تلفزيوني وثم التعامل مع 0،05٪ حل التربسين-EDTA.
      ملاحظة: وقت التعرض التربسين سوف تعتمد على خط الخلية.
    2. تحييد الحل التربسين مع ذاتهوسائل الإعلام ثقافة الخلية بعد فصل الخلايا التي تحتوي على الروم.
  3. الطرد المركزي تعليق خلية التربسين تحييد لمدة 5 دقائق في 200 x ج، ثم resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام ثقافة جديدة للعد الخلايا.
  4. عد تعليق الخلية باستخدام عداد الآلي وإعداد 1000000 الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
    1. تحقق بقاء الخلية مع التريبان الاستبعاد الزرقاء صبغ قبل الحقن في الأجنة الزرد.
      ملاحظة: يجب أن يتم حقنه السكان خلية قابلة للحياة فقط في الأجنة الزرد، وحقن الخلايا الميتة لن تعكس غزو الأوعية الدموية صحيح.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من صبغ محبة للدهون الأحمر إلى وقف الخلايا السرطانية عن التخفيف 1: 100، وتخلط جيدا، ثم احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: تركيز الوقت صبغ ووضع العلامات قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية.
  6. بعد الحضانة، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام جديد لأنبوب ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في200 × ز.
  7. يغسل صبغة الفلورسنت المتبقية من الخلايا السرطانية.
    1. نضح طاف من الخلية بيليه، resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
    2. كرر الخطوة غسل مرة ثانية: نضح طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة وثم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
    3. تكرار غسل الخطوة مرة الثالثة: ونضح طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة وثم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
  8. نضح طاف و resuspend بيليه الخلية التي تحتوي على 1 مليون خلية السرطان المسمى في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة.
    ملاحظة: 0.5 ملي EDTA يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام لمنع تكتل الخلية.

3. خلايا السرطان عن طريق الحقن في الجيب قبل القلب من الزرد الأجنة

  1. نعلق نظام الاستغناء عن حقن مكروي مصدر الهواء المضغوط وتشغيل عشرالبريد حقن مكروي مصدر طاقة النظام الاستغناء.
    1. ضغط الاختبار بالضغط على دواسة القدم. ونبضة قصيرة من الهواء يجب أن تنبعث من حامل الإبرة.
  2. تتوازن لوحات الحقن مرتين مع الحل 2X تريكين.
    1. لكل خطوة موازنة، إضافة 20 مل من 2X حل تريكين لوحة حقن ومكان على شاكر لمدة 10 دقيقة.
  3. استخدام ماصة بلاستيكية لنقل مجموعة من الأجنة إلى صحن صغير يحتوي الحل 2X تريكين.
  4. ردم إبرة حقن حقن مكروي مع الخلايا السرطانية باستخدام هلام تحميل طرف الماصة.
    1. وضع إبرة في جرة التخزين الكهربائي مع نهاية مدببة أسفل حتى الخلايا تستقر بالقرب من الحافة.
  5. نقل 20 - 30 الأجنة تخدير لوحة حقن من خلال جمع الأجنة مع الكثير من 2X تريكين في ماصة بلاستيكية.
    1. السماح للأجنة ليستقر في غيض من ماصة.
    2. شخص مهذبلاي طرد الأجنة في الحوض الصغير من لوحة الحقن، ونشر الأجنة على طول الحوض.
    3. محاذاة الأجنة مع رؤساء مواجهة والبطون في مواجهة الحائط الحاد في الحوض الصغير.
      وينبغي أن يشمل الحل تريكين كل من طول القاع والسطح الاغاروز شقة، مع الأجنة المقيمين فقط في الحوض الصغير: ملاحظة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن.
  6. حقن 50-100 الخلايا السرطانية (2-5 NL) في الجيوب الأنفية أمام القلب من الأجنة الزرد باستخدام نظام حقن مكروي الاستغناء.
    1. إرفاق الإبرة إلى حامل إبرة micromanipulator.
    2. وضع لوحة الحقن تحت المجسام مع الجدار 60 درجة إلى اليسار والتركيز على الجنين كبير في 25X التكبير.
    3. ضع micromanipulator بحيث، عندما مددت، الإبرة سوف تخترق الجنين.
    4. تمديد إبرة بالعين حتى أنه لمس ما يقرب من الجنين.
    5. أبحث تحت المجهر، محاذاة الإبرة حتى رقبعة سيكون اختراق الجنين على تمديد آخر.
    6. بيرس الجنين من خلال الكيس المحي وضع غيض فقط في، ولكن ليس في والجيوب الأنفية قبل القلب.
    7. حقن الخلايا بالضغط على دواسة القدم. قوة الحقن يطرد الخلايا في الجيوب الأنفية القلب. سحب الإبرة.
    8. استخدام اليد اليمنى، ويمتد ويتقلص إبرة الحقن. مع اليد اليسرى، وجعل تعديلات دقيقة لوضع الجنين القادم.
    9. العودة الإبرة إلى جرة التخزين الكهربائي أثناء إعداد لحقن وحة أخرى.
  7. نقل الأجنة إلى طبق الانتعاش مرة واحدة يتم حقن وحة كاملة.
    1. إمالة لوحة حقن لتجميع الأجنة في الجزء السفلي، وغسل أي الأجنة المتبقية من الحوض الصغير، وجمعها مع ماصة بلاستيكية.
    2. السماح للأجنة ليستقر في الجزء السفلي من ماصة.
    3. نقل الأجنة إلى طبق الانتعاش في حجم الحد الأدنى من تريكين.
  8. Incubaطبق الانتعاش الشركة المصرية للاتصالات عند 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    1. منفصلة الأجنة الزرد قابلة للحياة من الأجنة الميتة وغيرها من الحطام.
  9. احتضان الطبق عند 33 درجة مئوية لتصبح جاهزة لتصحيحها، عادة 24-96 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحديد درجة الحرارة هذه كحل وسط بين 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لخلايا السرطان، و 28.5 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لالزرد.

4. يحرز التسرب

  1. تخدير دفعة من الأجنة إلى أن سجل عن طريق وضعها في طبق مع حل تريكين.
  2. وضع اليرقات تخدير على شريحة الاكتئاب المجهر في قطرة من تريكين.
    1. اليرقات توجيه أفقيا للتصوير الأمثل في المنطقة الذيلية.
  3. إحصاء عدد الخلايا السرطانية التي غزت بنجاح من الأوعية الدموية من خلال التركيز صعودا وهبوطا من خلال المنطقة ذيل لتبين بوضوح خلايا سليمة.
    ملاحظة: من الأفضل أن يكون اثنين على الأقل من الأفراد المشاركين في تيعملية له، حيث الفرد يحرز السمك الأعمى إلى حالة تجريبية يجري تقييم.
    1. يسجل اليرقات على المجهر المركب مضان مع عدسة الهدف 10X. استخدام الهدف 20X عن أي مكالمات الصعبة.

5. الأجنة تصاعد على الشرائح واللاحقة التصوير الإسفار

  1. تذوب 1.5٪ محلول الاغاروز / تريكين وتقديمهم إلى 37 درجة مئوية.
  2. تخدير الجنين ليتم تصويرها عن طريق وضعها في محلول تريكين.
  3. نقل الأجنة في قطرة من حل تريكين إلى السطح التصوير. اختياريا استخدام صحن أو شريحة المجهر والزجاج السفلي.
  4. استخدام ماصة الزجاج لإزالة حل تريكين الزائد، والإبقاء على الجنين على سطح التصوير.
  5. تراكب قطرة واحدة من الحل الاغاروز ذاب على الجنين.
  6. بسرعة، قبل أن تتصلب في الاغاروز، استخدم أداة حساسة، مثل فرشاة رمش، لتوجيه الجنين أفقيا للتصوير، وإعطاء مزيد من الحذرلضمان الجنين وسويت بالأرض على طول سطح التصوير.
  7. غمر انخفاض الاغاروز بلمرة الآن تحت الحل تريكين.
  8. تعرض الجنين الزرد يعيش التصوير المجهري.

6. تعديل: حقن الخلايا السرطانية في الكيس المحي من الجنين اسماك الزرد

  1. إعداد النظام وحقن لوحات حقن مكروي الاستغناء كما هو موضح سابقا في الفقرة (3) من هذا البروتوكول.
  2. تسمية اثنين من سكان الخلية المتناقضة مع الأصباغ الفلورية كما هو موضح سابقا في الفقرة (2) من هذا البروتوكول.
  3. حقن 5-10 نيكولا لانغ من 2 × 10 ^ 7 خلية / مل في الكيس المحي. الحفاظ على ثبات الحجم حقن لحقن أعداد الخلايا متطابقة (100-200 الخلايا السرطانية) من كل خلية السكان
    ملاحظة: يمكن للمرء أن استخدام الأجنة الزرد شفافة تفتقر الأوعية الدموية الفلورسنت لهذا الاختبار. يمكن التحكم دخول السلبي للجسيمات في الأوعية الدموية للعن طريق حقن الخرز الفلورسنت (<10 ميكرون)، أو تغييرأصلا، وهو خط الخلية التي لا intravsate.
  4. استرداد حقن الأجنة كما هو موضح سابقا في الفقرة (3) من هذا البروتوكول وثم كشف عن حقن ناجحة.
    1. استخدام المجسام لفحص ونقل الأجنة قابلة للحياة التي تم حقنها بنجاح إلى طبق جديد.
      ملاحظة: يجب أن يكون لجميع الأجنة كتلة الحجم باستمرار من الخلايا الموجودة في صفار البيض. يتم تجاهل الأجنة إذا اختلف حجم الشامل أو إذا تقع أي الخلايا خارج صفار البيض.
    2. نقل الأجنة قابلة للحياة إلى طبق جديد إذا تم النظر إلى الخلايا السرطانية بشكل واضح في الكيس المحي.
  5. احتضان الطبق عند 33 درجة مئوية لتصبح جاهزة لتصحيحها، عادة 24-48 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحديد درجة الحرارة هذه كحل وسط بين 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لخلايا السرطان، و 28.5 درجة مئوية، ودرجة الحرارة المثالية لالزرد.
  6. ليسجل دخول الوعاء، اتبع الإرشادات الواردة في الفقرة (4) من هذا البروتوكول، ولكن بدلا من ذلك الاعتماد على عدد من جخلايا ancer التي غزت بنجاح في الأوعية الدموية في المنطقة الذيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن هنا اختبار القدرة الغازية الأوعية الدموية من خطوط خلايا سرطان الثدي التي يشيع استخدامها في نموذج جنين الزرد (الشكل 1). تم توظيف معايير صارمة في التهديف تسرب لهذه خطوط مختلفة من الخلايا، حيث احصي الأحداث الإيجابية إلا إذا كانت الخلايا السرطانية قد extravasated بشكل واضح، وهذا يجري القيام به بصورة رئيسية للحد من أي ايجابيات كاذبة التي يمكن أن تنشأ من تسجيل الحطام الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذه التقنية تستخدم نموذج الزرد لاختبار كفاءة القدرة الغازية الأوعية الدموية لخلايا السرطان (انظر الشكل 1). نحن هنا تطبيق هذه التقنية لفريق من خطوط خلايا سرطان الثدي من أجل توفير قاعدة على الذي المحققين الآخرين ويمكن بعد ذلك بناء الدراسات الخاصة بها (انظر الجدول 1؛ الأرقام 2-3). إن الملاحظة التي MDA-MB-231 الخلايا غزت بسهولة في المنطقة الذيلية من الأجنة الزرد جعل هذا الخط خلية مثالية لاختبار العوامل التي قد تحول دون غزو الأوعية الد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

نشكر بيتر جونسون من مركز الفحص المجهري بجامعة جورج تاون للمساعدة في تصوير أجنة الزرد. يتم دعم المورد المشترك للفحص المجهري والتصوير والموارد المشتركة لأسماك الزرد جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان P30-CA051008. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للصحة CA71508 (AW) و CA177466 (AW).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
100 مم أطباقCorning Incorporated3160-100
5 3/4 "ماصات باستور يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكاتفيشر ماركة13-678-20B
60 مم طبقكورنينج إنكوربوريتد3160-60
أغاروز ، صهر منخفض الذوبانBP165-25
شعيراتالدرجة الجزيئيةBioline BIO-41026
، قياسي ، 1.2 مم × 0.68 مم ، 4 "أنظمة AM، Inc627000
David Kopf 700C مجتذب ماصة عموديHofstra Group3600
DMEMLife Technologies11995-065
جرة تخزين القطب الكهربائي ، 1.0 ممWorld Precision Instruments، IncE210
ملح ميثان سولفونات إيثيل 3-أمينوبنزوات (تريكايين ، MS-222)فلوكاA5040
تيد بيلا ، إنك113
مصل الأبقار الجنينية ، معطل بالحرارةأوميغا ScientificFB-12
فيشربراند نقل الماصاتThermoFisher Scientific13-711-7M
تحميل الماصاتفيشر براند02-707-181
أطباق زجاجية ذات قاع زجاجي (12.0 مم)ThermoFisher Scientific150680
Glass Depression SlideVWR470005-634
ملح المحيط الفوري ، ملح البحرPentairIS50
لمبات مطاطية من اللاتكس ، 2 مل ، عبوة من 72هيثرو ساينتفيكHS20622B
SP8 مجهر متحد البؤرلايكا
MicromanipulatorNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
Penicillin-G PotassiumFisher BiotechBP914-100
لوحات بتري ، 100 مم × 15 ممFisher Brand  ؛ FB0875713
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Medium لايف تكنولوجيز11875-093
ستربتومايسين كبريتاتفيشر التكنولوجيا الحيويةBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiOThermoFisher ScientificV22886
Zebrafish المشتركة لأسماك الوحد في
DMEM + 10٪ FBS ، مع توقع خلايا BT-474 و HCC18-6 ، والتي تم الاحتفاظ بها في RPMI + 10٪ FBS.
Agarose ، زجاج دموية من فرشاة رمش نصائح تم الحفاظ على خطوط خلايا الموارد

المراجع

  1. Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
  2. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  3. Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
  4. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  5. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
  6. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  8. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
  11. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260(2012).
  13. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  14. Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
  15. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  16. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677(2014).
  17. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
  18. Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
  19. Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
  20. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
  21. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
  22. Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
  23. Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
  24. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
  25. Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
  26. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
  27. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
  28. Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  29. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  30. Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
  31. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  32. Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة