مقالة منهجية

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

DOI:

10.3791/55008

⸱

يناير 11, 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد نجحنا في إنشاء طريقة لعزل الحمض النووي الريبي من بذور النباتات التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات والبوليفينول ، والتي لها تأثيرات مثبطة على عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء. طريقتنا مناسبة لمراقبة التعبير عن الجينات ذات النصوص منخفضة المستوى في البذور.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتراكم بذور النبات كميات كبيرة من احتياطيات التخزين التي تشتمل على مواد عضوية قابلة للتحلل. يعتمد البشر على احتياطيات تخزين البذور للغذاء وكمواد صناعية. تعد ملفات تعريف التعبير الجيني أدوات قوية للتحقيق في تنظيم التمثيل الغذائي في الخلايا النباتية. لذلك ، يلزم وجود ملفات تعريف مفصلة ودقيقة للتعبير الجيني أثناء نمو البذور لتربية المحاصيل. يعد الحصول على الحمض النووي الريبي عالي النقاء أمرا ضروريا لإنتاج هذه الملامح. هناك حاجة إلى طرق فعالة لعزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء من البذور. هنا ، نصف طريقة لعزل الحمض النووي الريبي من البذور التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات والبوليفينول ، والتي لها تأثيرات مثبطة على عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء. تتيح طريقتنا الحصول على الحمض النووي الريبي عالي النقاء من البذور دون استخدام الفينول أو الكلوروفورم أو العمليات الإضافية لتنقية الحمض النووي الريبي. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نبات الأرابيدوبسيس وبذور اللفت وبذور فول الصويا. ستكون طريقتنا مفيدة لمراقبة أنماط التعبير عن النصوص منخفضة المستوى في البذور النامية والناضجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النباتات تنتج البذور، والتي تؤدي إلى الجيل التالي. بذور تتراكم كميات كبيرة من احتياطيات تخزين، مثل الزيوت والكربوهيدرات، والبروتينات، للنمو بعد منتش. البشر الاستفادة من احتياطيات تخزين البذور كمصدر للتغذية الأغذية والأعلاف الحيوانية، وبالتالي بذور النباتات هي واحدة من الموردين الرئيسيين للمواد العضوية الصالحة للأكل في جميع أنحاء العالم. زيادة محصول البذور يشكل تحديا هاما في علم النبات.

منذ احتياطيات تخزين البذور هي مصادر ذات قيمة تجارية عالية من المواد الغذائية والمواد الصناعية، الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم عملية الأيض هذه الاحتياطيات تم التحقيق على نطاق واسع 1-6. وعلاوة على ذلك توضيح هذه الآليات يكون مفيدا لزيادة محصول البذور للمحاصيل. بذور تطور في المبايض المصنع بعد الإخصاب، وتنضج من خلال سلسلة من المراحل التنموية 1،6،7. فهم كذلك تطوير الآلية الجزيئية البذور الكامنة يتطلب تفصيلاودقيقة ملامح التعبير الجيني من سلسلة تطوير البذور التي يتم إنتاجها. ومع ذلك، فإن كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات، والكربوهيدرات، ومادة البوليفينول في بذور النباتات تجعل من الصعب عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء، والذي يحول دون التنميط دقيقة في التعبير الجيني.

هنا، ونحن نقدم وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي من البذور الزيتية التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات ومادة البوليفينول. باستخدام هذه الطريقة، وسوف يقوم الباحثون أن يكون قادرا على إعداد RNA عالي النقاء. وهذا RNA يكون مفيدا لرصد التغيرات النسخي في الجينات الرئيسية السيطرة على تنظيم التمثيل الغذائي للاحتياطيات تخزين البذور في البلدان النامية والبذور الزيتية ناضجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من بذور النباتات

  1. إعداد مجموعات العازلة، أعمدة الدوران، 1.5 و 2.0 أنابيب البولي بروبلين مل، وأنابيب البولي بروبلين 1.5 مل nuclease خالية.
  2. إضافة 1٪ (ث / ت) البيولوجيا الجزيئية الصف بوفيدون (يشار إليها فيما PVP) إلى الخلية تحلل العازلة لاستخراج الحمض النووي الريبي ودوامة بقوة. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية إلى حل تماما. بعد 20 دقيقة الحضانة، مزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب لمنع تشكيل فقاعات. تخزين في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
  3. ثمار الحصاد من النباتات thaliana نبات الأرابيدوبسيس ومكان في 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين على الجليد. أبقى مكان الفواكه على لوحات الألومنيوم في 4 درجات مئوية، وعزل البذور من ثمار تحت المجهر ستيريو.
    1. وضع بذور معزولة (حوالي 200 البذور) إلى 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين التي تم تخزينها في حامل الألومنيوم على الجليد وعلى الفور وضع الأنابيب في ن السائلitrogen.
  4. إزالة الأنابيب من النيتروجين السائل وإعادتها إلى الرف الألومنيوم على الجليد. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية.
  5. تجانس العينة مع مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام طاحونة المحرك لمدة 60 ثانية مع الحفاظ على أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
  6. إضافة 550 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP، ومزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
  7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 8000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 550 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 450 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
  9. استخدام طاف مثل المحللة خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي. الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عدة متاحة تجاريا.
  10. أزلRNA باستخدام حجم الحد الأدنى من شطف العازلة لضمان تركيز عال بما فيه الكفاية من الحمض النووي الريبي لرصد أنماط التعبير النصوص مستوى منخفض. تخزين الحمض النووي الريبي في التجميد العميق حتى استخدامها.

2. التأكيد من الحمض النووي الريبي الجودة

  1. ذوبان الجليد في الحمض النووي الريبي مجموع، ومزيج من خلال استغلال طيف، ووضع أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
  2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي، ونسبة A260 / A280، ونسبة A260 / A230 باستخدام معمل microvolume.
  3. تخفيف الحمض النووي الريبي مجموع في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 70 نانوغرام / ميكرولتر.

3. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي مجموع من بذور

  1. ذوبان الجليد مجموع RNA وعازلة مجموعات من عدة التجارية. الحفاظ على الانزيمات من هذه المجموعة على الجليد بعد التنصت لطيف. إعداد أنابيب 0.2 مل البولي بروبلين nuclease خالية.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع، 1 ميكرولتر من جزئية DT التمهيدي (50 ميكرون)، و 1 ميكرومتر من عشوائية 6 مير (50 ميكرومتر) إلى مل polypropy 0.2أنبوب لين على الجليد.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومكان على الجليد.
  4. الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عكس عدة نسخ-PCR.
  5. وضع منتجات النسخ العكسي على الجليد قبل الاستخدام.

4. في الوقت الحقيقي تحليل PCR الكمي

  1. بناء البلازميدات إيواء تسلسل الجين المستهدف باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. ضبط تركيزات إلى 100-500،000 نسخ / ميكرولتر لقوالب الحمض النووي للالمنحنيات القياسية.
  3. تمييع الحلول كدنا] (1: 100) مع الماء المقطر.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من الحلول كدنا] المخففة والبلازميدات لمنحنيات القياسية لمزيج الرئيسي من الوقت الحقيقي عدة PCR الكمي.
  5. إعداد الوقت الحقيقي PCR باستخدام الشروط التالية الدراجات: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ثم 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية.
  6. تحليل الأرقام نسخة وفقا للرجلتعليمات ufacturer لنظام PCR الوقت الحقيقي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علينا أولا التحقيق في تركيز الأمثل لحماية الأصناف النباتية باستخدام نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من حوالي 1،000 البذور وفقا لبروتوكول المذكورة أعلاه باستخدام عازلة خلية تحلل تحتوي على 0٪، 0.25٪، 0.5٪، 1.0٪ أو 2.0٪ PVP. بعد التجانس والطرد المركزي، تم جمع طاف مع تجنب طبقة النفط والحطام البذور (الشكل 1A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساهم ملامح التعبير الجيني في فهمنا لفسيولوجيا النبات. لذا، وضعت أساليب عزل الحمض النووي الريبي محددة لكل حالة عينة 9-12. نحن التحقيق في العمليات التي تحول دون خلال عزل الحمض النووي الريبي من البذور وجدت أن الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيليكا كانت تحول دون بشدة. كميات كبيرة من النفط، والبروتينات، والبوليفينول تمنع عزل الحمض النووي الريبي. نحن تعديل عملية استخراج الحمض النووي الريبي لإزالة هذه المركبات مع حل تحلل قبل عملية من الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر موظفي مرفق الجينوم وظيفية والتصوير الطيفي وBioimaging مرفق، NIBB مرافق البحوث الأساسية، ومرفق نموذج بحوث النباتية، NIBB مركز Bioresource.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم RNeasy Plant MiniQIAGEN74904
polyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
homogenizer S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificNDL-US-CAN
PrimeScript RT Recode Kit (Perfect Real Time)TAKARARR037A
KAPA SYBR مجموعة qPCR سريعةKapa biosystemsKK4601
Kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA PVP Real Time PCR Arabidopsis

مقالات ذات صلة