مقالة منهجية

أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة

16.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55016

⸱

ديسمبر 23, 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحقيق دقة قريبة من زوج القاعدة لتفاعلات البروتين والحمض النووي. يتم الحصول على ذلك عن طريق معالجة نوكلياز خارجي لشظايا الحمض النووي المخصب بشكل انتقائي بالترسيب المناعي للكروماتين (ChIP-exo) متبوعا بتسلسل عالي الإنتاجية.

الملخص

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة لا غنى عنها في مجالات علم التخلق وتنظيم الجين الذي يعزل تفاعلات البروتين-DNA محددة. يستخدم رقاقة بالإضافة إلى التسلسل إنتاجية عالية (رقاقة وما يليها) عادة لتحديد الموقع الجيني من البروتينات التي تتفاعل مع لونين. ومع ذلك، ويعوق رقاقة وما يليها من قبل منخفضة نسبيا قرار رسم الخرائط من عدة مئات من أزواج قاعدة وعالية إشارة الخلفية. طريقة الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها أن تحسن بشكل كبير على كل من قرار والضوضاء. والفرق الرئيسي للمنهجية الشذرة إكسو هو إدماج الهضم امدا نوكلياز خارجية في سير العمل إعداد مكتبة للبصمة فعال اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي. ثم يتعرض للمكتبات رقاقة إكسو إلى ارتفاع التسلسل الإنتاجية. يمكن الاستفادة من البيانات الناتجة لتقديم رؤى فريدة وفائقة الدقة في التنظيم س الوظيفيو الجينوم. هنا، نحن تصف طريقة الشذرة إكسو أن لدينا الأمثل وتبسيط نظم الثدييات والجيل القادم من منصة التسلسل عن طريق التوليف.

المقدمة

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لدراسة آليات تنظيم الجينات من خلال إثراء انتقائي لشظايا الحمض النووي التي تتفاعل مع بروتين معين في الخلايا الحية. وقد تطورت أساليب اكتشاف شظايا الحمض النووي المخصب الشذرة كما يحسن التكنولوجيا، من الكشف عن مكان واحد (معيار الشذرة QPCR) إلى التهجين على ميكروأرس النوكليوتيد (رقاقة رقاقة) إلى التسلسل الإنتاجية العالية (رقاقة وما يليها) 1. على الرغم من رقاقة وما يليها شهدت تطبيق على نطاق واسع، والتباين لونين والتفاعلات الحمض النووي غير محددة أعاقت نوعية البيانات التي تؤدي إلى المغلوطة ورسم الخرائط غير دقيقة. وللتغلب على هذه القيود، طور الدكتور فرانك بف طريقة الشذرة إكسو 2. والسمة البارزة لالشذرة إكسو هو أنه يشتمل على 5 'إلى 3' نوكلياز خارجية، البصمة بشكل فعال عامل النسخ المواقع ملزمة. ونتيجة لذلك، فإن منهجية الشذرة إكسو تحقق دقة أعلى، أكبر مجموعة ديناميكية من detectioن، وانخفاض الضوضاء في الخلفية.

على الرغم من أن الشذرة إكسو هو أكثر تحديا من الناحية الفنية لسيده من رقاقة وما يليها، واعتمادها على نطاق واسع بأنها تهدف الدراسات للحصول على أفكار ذات دقة عالية جدا فريدة من نوعها باستخدام النظم البيولوجية المتنوعة 3-8. في الواقع، تم تطبيق الشذرة إكسو بنجاح إلى البكتيريا والخميرة والجرذان والفئران، ونظم خلايا الإنسان. وكدليل على المبدأ، تم استخدام رقاقة-إكسو في الأصل لتحديد عزر ملزم دقيق لعدد قليل من الخميرة النسخ عوامل 2. وقد استخدمت هذه التقنية أيضا في الخميرة لدراسة تنظيم النسخ مجمع قبل البدء، وإلى فك هيكل subnucleosomal من مختلف الهستونات 9،10. وفي الآونة الأخيرة، ونحن الاستدانة الشذرة إكسو لحل TFIIB المجاورة وبول الثاني الأحداث في المروجين الإنسان ملزمة، وأظهرت أن النسخ متباينة على نطاق واسع ينشأ من بدء متميزة مجمعات 11.

تم تحسين سير العمل المعروضة هنا والصورةtreamlined لالثدييات الشذرة إكسو (الشكل 1). أولا، يتم التعامل مع الخلايا الحية ثقافة الأولية أو الأنسجة مع الفورمالدهايد للحفاظ على الجسم الحي في تفاعلات البروتين الحمض النووي من خلال تشعبي التساهمية. وهي lysed الخلايا ولونين المنفصمة إلى ~ 100-500 زوج قاعدة شظايا الحجم. رقاقة ثم يغني بشكل انتقائي لشظايا الحمض النووي crosslinked للبروتين من الفائدة. عند هذه النقطة، يتم إعداد مكتبات رقاقة وما يليها عادة، مما يحد بطبيعتها القرار كشف أن متوسط ​​حجم جزء من بضع مئات من أزواج قاعدة. ومع ذلك، الشذرة إكسو يتغلب على هذا التحديد عن طريق تقليم اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي مع نوكلياز خارجية امدا. ثم يتم إنشاء مكتبات التسلسل من نوكلياز خارجية الحمض النووي يهضم كما هو موضح أدناه. تمثل المتداخلة 5 الحدود الناتجة 'بصمة في الجسم الحي للتفاعل البروتين الحمض النووي (الشكل 1، الخطوة 14)، ويتم الكشف عنها بواسطة عالية التسلسل الإنتاجية. بديلهوغ منهجية الشذرة إكسو هي أكثر انخراطا من رقاقة وما يليها، والتحولات بين معظم الخطوات تتطلب غسل حبة بسيط، الذي يقلل من فقدان العينة وتقلب التجريبية. الأهم من ذلك، منذ الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها، أي عينة غير ناجحة مع رقاقة وما يليها ينبغي أيضا أن تكون ناجحة مع رقاقة-إكسو.

في الجسم الحي البصمة للتفاعلات البروتين الحمض النووي مع النتائج الشذرة إكسو في بنية بيانات متميزة جوهريا عن رقاقة وما يليها. على الرغم من المتصلين رقاقة وما يليها المشترك يمكن تطبيقها على البيانات الشذرة إكسو، للحصول على مكالمات الذروة أدق نوصي المعلوماتية الحيوية الأدوات المصممة خصيصا مع بنية فريدة من نوعها من البيانات الشذرة إكسو في الاعتبار. وتشمل هذه Genetrack، GEM، صولجان، Peakzilla، وExoProfiler 12-15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: مزدوج المقطر H 2 O أو الجزيئي يعادل الصف يوصى به لجميع المخازن وردود الفعل يمزج.

اليوم 0: إعداد المواد وخلية الحصاد

1. إعداد العازلة

  1. إعداد تحلل المخازن 1-3 (الجداول 1-3)، وإضافة 100 ميكرولتر كامل الأسهم مثبط البروتياز (CPI) إلى 50 مل من كل العازلة فقط قبل استخدامها. إعداد الأوراق المالية مؤشر أسعار المستهلكين عن طريق إذابة قرص واحد في 1 مل الصف الجزيئية H 2 O.
  2. إعداد الشذرة المخازن (الجداول 4-7). إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من الحجب ومخازن المعهد الملكي. لا تضيف مؤشر أسعار المستهلك إلى تريس ورقاقة شطف المخازن.

2. التليين من محول أليغنوكليوتيد]

ملاحظة: يمكن الاطلاع على متواليات النوكليوتيد محددة في الإضافي قسم المعلومات.

  1. إعداد يمزج محول التليين (الجداول 8-9). دوامة خلط لفترة وجيزةتدور أنابيب لجمع محتويات. قسامة 100 ميكرولتر من كل مزيج إلى 0.5 مل أنابيب.
  2. هجن [أليغنوكليوتيد عن طريق تشغيل برنامج (الجدول 10) في Thermocycler.
    متجر مطوع أليغنوكليوتيد] في -80 درجة مئوية.

3. في فيفو لونين يشابك مع الفورمالديهايد

ملاحظة: للحصول على تجربة الشذرة نموذجية، ينبغي أن يتضمن مادة البداية ما يقرب من 50 مليون خلية.

  1. إضافة جديدة 37٪ خالية من الميثانول حل الأسهم الفورمالديهايد لالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) غسلها زراعة الخلايا إلى تركيز النهائي من 1٪ (ت / ت)، تخلط جيدا، وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، ونحن عادة إضافة 1.4 مل من 37٪ الفورمالديهايد خالية من الميثانول إلى خلايا في 50 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. أيضا، وتجنب الفورمالديهايد يشابك في وسائل الإعلام منذ البروتينات في وسائل الإعلام وإرواء بعض الفورمالديهايد.
  2. إخماد يشابك رد فعل عن طريق إضافة 2.5 M glycinه لتركيز النهائي من 125 ملم. تخلط جيدا.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل على الجليد. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 1000 x ج في 4 درجات مئوية. طاف صب.
  4. إضافة 1 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X إلى الخلية بيليه و resuspend من قبل pipetting. نقل إلى 1.5 مل أنبوب.
  5. تدور الخلايا لمدة 3 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. نضح طاف.
  6. فلاش على الفور تجميد الكريات خلية في 1.5 مل أنابيب مع النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية. خلايا Crosslinked مستقرة إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية.

يوم 1: تحلل الخلايا، صوتنة، والشذرة

4. تحلل الخلايا

ملاحظة: خلال جميع أقسام خلية تحلل، يجب أن تبقى العينات على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من انعكاس تشعبي.

  1. ذوبان الجليد لفترة وجيزة بيليه خلية crosslinked. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 1 و تتحد مع 4.5 مل الاحتياطي تحلل 1 في أنبوب البوليسترين 15 مل.
  2. أنابيب الصخور لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئويةلعلى منصة هزاز. تدور لمدة 4 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. طاف صب.
  3. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 2 وإضافة 4.5 مل الاحتياطي تحلل 2 مرة معلق.
  4. موسيقى الروك لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية على منصة هزاز. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف استفادة من فائض على منشفة ورقية.
  5. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 3 وإضافة 1 مل الاحتياطي تحلل 3 مرة معلق. الحفاظ لست] النووية على الجليد والشروع فورا في صوتنة.

5. صوتنة من لست] النووية

ملاحظة: خلال جميع أقسام صوتنة، يجب أن تبقى العينات على الجليد للحد من انعكاس تشعبي. ويمكن الاطلاع على نموذج معين من sonicator تستخدم في بالاشتراك مع بروتوكول أدناه في الجدول المواد. ويمكن الاطلاع على التفاصيل حول استخدام sonicator محددة ومبادئ توجيهية لغيرها من الصكوك في الإضافي قسم المعلومات.

  1. ررمحولات بالرنين الآس في 15 مل أنابيب البوليسترين تتضمن مقتطفات النووية (يجب أن شريط معدني لا تلمس جدار الأنبوب).
  2. لست] النووية يصوتن في حمام الماء البارد الثلج لمدة 2 × 15 جلسات دقيقة مع 30 ثانية ON / OFF 30 ثانية في قوة متوسطة. يصوتن سوى اثنين من 15 مل أنابيب في المرة الواحدة. وتعمل هذه الإعدادات على مجموعة واسعة من خطوط الخلايا وأنواع الخلايا الأولية، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين إذا القص لونين غير كامل.
  3. للتحقق النتائج صوتنة، ونقل 2 × 10 عينات ميكرولتر من المحللة إلى 1.5 مل أنابيب.
    1. لعكس crosslinks، والجمع بين أول قسامة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر TE-ريبونوكلياز وو 0.2 ميكرولتر من بروتين ك احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 4 6X ميكرولتر صبغة زيلين الحمض النووي.
    2. للحفاظ على crosslinks، والجمع بين الثانية قسامة 10 ميكرولتر مع 2 6X ميكرولتر صبغة زيلين الحمض النووي.
    3. تشغيل كل من العينات على هلام الاغاروز 1.5٪ عند 140 V لحوالي 30 - 45 دقيقة حتى الصبغة برموفينول في سلم طالصورة ¾ من الطريق هلام.
  4. إذا كان صوتنة الناجحة (معظم شظايا الحمض النووي المنفصمة إلى 100-500 بي بي)، ونقل sonicated لست] إلى 2 مل أنابيب تحتوي على 150 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100. دوامة لخلط.
  5. لتكوير لونين غير قابلة للذوبان والحطام، sonicated تدور المحللة النووي لمدة 10 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية.
  6. نقل طاف لأنبوب 2 مل الجديد. الشروع فورا في الشذرة أو تخزين العينات في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. يجب مقتطفات Sonicated لا يتم تجميد وإذابة أكثر من مرة.

6. اقتران الأجسام المضادة لالخرز

ملاحظة: لا يوجد دوامة أو تجميد / ذوبان الجليد حبات مغناطيسية لأنها سوف تتحطم وزيادة إشارة الخلفية.

  1. بعد خلط دقيق الأوراق المالية، قسامة Y ميكرولتر الطين حبة إلى 1.5 مل أنبوب، حيث Y = 1.1 × 2.5 ميكرولتر س (عدد العينات رقاقة). قدرة ملزمة 2.5 ميكرولتر حبة الطين تصل إلى 13 ميكروغرام مفتش. تغسل حبات المجمعة 3X مع 1 مل حجبالعازلة.
  2. لaliquotting أكثر اتساقا من الخرز يغسل بعد، والخرز resuspend في 10X حجم الطين الأصلي (25 ميكرولتر / رقاقة) مع عازلة تمنع. قسامة 25 ميكرولتر لكل عينة الشذرة إلى 1.5 مل أنابيب.
  3. إضافة 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة لقسامة من Resuspend الخرز المقابلة. جلب الحجم النهائي إلى 250 ميكرولتر مع عازلة تمنع. احتضان العينات لمدة 4 ساعة (بدلا من ذلك، بين عشية وضحاها لمدة 16 ساعة) على منصة دوارة في 4 درجات مئوية.
  4. نضح طاف. لإزالة الأجسام المضادة غير منضم أو الزائد، وغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل عازلة تمنع.
  5. بعد الشفط غسل الماضي، إضافة على الفور 50 مليون حكمه خلية مقتطفات sonicated (~ 1.6 مل) إلى الأجسام المضادة: تقارن حبة. إذا مقتطفات sonicated ليست مستعدة، والخرز resuspend في 100 ميكرولتر عازلة تمنع حتى تكون جاهزة. فمن الأهمية بمكان أن لا تجعل حبات جافة.

7. لونين مناعي (رقاقة)

  1. لكل عينة الشذرة، والجمع بين 1.5 مل من يصوتنمقتطفات د مع الأجسام المضادة: تقارن حبة في 1.5 مل أو 2 مل أنابيب.
  2. احتضان الأنابيب على محور دوار صغير أنبوب بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) في تحديد السرعة من 9 في 4 ج. تحقق بعد دقائق قليلة لضمان العينات لا يتم تسريب والاختلاط بشكل صحيح.

يوم 2: الشذرة يغسل وعلى الراتنج التفاعلات الأنزيمية

8. رقاقة يغسل

ملاحظة: للحد من التلوث، لفترة وجيزة تدور الأنابيب بين كل غسل. لطموح الأول، تغيير نصائح بين كل عينة. خلال يغسل اللاحقة، وهو نفس طرف يمكن استخدام طويلة كما لم يتطرق الخرز. رؤية إضافية القسم معلومات عن الاتجاهات في غسل رقاقة السليم.

  1. جدا تدور لفترة وجيزة الأنابيب باستخدام microcentrifuge ل(~ 3 ثانية في 500 x ج) لجمع السائل في مباراة دولية ووضع على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. في حين لا تزال على الرف المغناطيسي، واستخراج نضح.
  2. إضافة 0.75 مل RIPA العازلة إلى كل أنبوب. إزالة الأنابيب من رف المغناطيسيوعكس عدة مرات لخلط. استبدال أنابيب على الرف المغناطيسي وطاف نضح. كرر 7X.
  3. إضافة 0.75 مل 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) إلى كل أنبوب. إزالة الأنابيب من رف المغناطيسي وعكس عدة مرات لخلط. استبدال أنابيب على الرف المغناطيسي وطاف نضح. كرر 2X.
  4. بعد الشفط غسل الماضي، انتقل إلى تلميع.
    ملاحظة: بعد كل رد فعل حضانة في أقسام 9.3، 10.3، 11.3، 12.3، 13.3، 14.3، و 15.3، وأنابيب تدور لفترة وجيزة ومكان ضد حامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وطاف نضح. غسل 2X مع 0.75 مل RIPA العازلة و 2x مع 0.75 مل تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة).

9. تلميع رد الفعل

  1. ملء تلميع الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 11). جعل تلميع المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد ويستنشق آخر غسل رقاقة، إضافة 50 ميكرولتر من تلميع المزيج إلى كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x جفي 30 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى A-المخلفات.

10. A-المخلفات رد الفعل

  1. ملء-المخلفات والحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 12). جعل A-المخلفات المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد تلميع القسم، إضافة 50 ميكرولتر من A-المخلفات المزيج إلى كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى P7 محول ربط.

11. P7 محول من ربط رد الفعل

  1. ملء الحسابات مزيج من ربط الرئيسي (الجدول 13). جعل من ربط خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. ماصة لخلط.
  2. فور A-المخلفات القسم، إضافة 48 ميكرولتر مزيج الرئيسي P7 من ربط و 2 ميكرولتر من مختلف ر مؤشر محولس كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 2 ساعة في 3 x ج في 25 مئوية في thermomixer.
    ملاحظة: سيتم استخدام مؤشرات مختلفة لكل عينة يسمح مزيد من العينات لتكون متسلسلة في خلية تدفق واحدة.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى Φ 29 إصلاح نيك.

12. فاي-29 نيك إصلاح رد الفعل

  1. ملء Φ 29 حسابات مزيج الرئيسي (الجدول 14). جعل Φ 29 المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم P7 الربط، إضافة 50 ميكرولتر من Φ 29 مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في 3 x ج 30 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رد فعل كيناز.

13. كيناز رد الفعل

  1. ملء كيناز الحسابات مزيج الرئيسي ( الجدول 15). جعل كيناز خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد Φ 29 قسم، إضافة 50 ميكرولتر من كيناز مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رد فعل لامبدا نوكلياز خارجية.

14. امدا نوكلياز خارجية ردود الفعل

  1. ملء امدا نوكلياز خارجية الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 16). جعل امدا نوكلياز خارجية خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم كيناز، إضافة 50 ميكرولتر من امدا نوكلياز خارجية مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى RecJ رد فعل و.

15. RecJ ورد الفعل نوكلياز

  1. ملء الحسابات مزيج RecJ و الرئيسي (الجدول 17). جعل مزيج و RecJ في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم امدا نوكلياز خارجية، إضافة 50 ميكرولتر من مزيج و RecJ لكل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رقاقة شطف.

16. شطف وتشعبي عكس

  1. تحضير مزيج الرئيسي: عدد العينات س 1.1 س (200 ميكرولتر الشذرة الاحتياطي شطف + 1 ميكرولتر 20 ملغ / مل بروتين كاف) في أنبوب 1.5 مل. إضافة 200 ميكرولتر مزيج الرئيسي رقاقة الاحتياطي شطف + بروتين كاف لكل الراتنج العينة.
  2. احتضان عينات بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) في 3 x ج ب 65 ج في thermomixer مع غطاء ساخنة لمنع التكثيف.

يوم 3: استخراج الحمض النوويأيون ومحول من ربط

17. شطف وتشعبي عكس (تابع)

  1. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها في 65 ج، وتدور لفترة وجيزة عينات لجمع المكثفات. مكان العينات على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
  2. نقل 200 ميكرولتر طاف لأنبوب جديد 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر TE العازلة (7.5 درجة الحموضة).

18. الفينول الكلوروفورم كحول أيزو أميلي (PCIAA) استخلاص

  1. إضافة 400 ميكرولتر الفينول الكلوروفورم كحول أيزو أميلي لكل عينة. دوامة لخلط لمدة 20 ثانية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20000 x ج في درجة حرارة الغرفة (RT). نقل بعناية 325 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا لأنبوب جديد.
    ملاحظة: احرص على عدم نقل أي من العضوية (الطبقة السفلى) في أنبوب جديد.
  3. إضافة 10/01 حجم 3 M NaOAc (5.5 درجة الحموضة) و 1 ميكرولتر 20 ملغ / مل الجليكوجين إلى كل عينة. للحصول على عينات متعددة، وإعداد مزيج الرئيسي.
  4. إضافة 3 مجلدات من الجليد البارد الإيثانول بنسبة 100٪ على كل عينة. دوامةلخلط. احتضان لمدة 15 دقيقة في -80 مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 20000 x ج في 4 ج. بعناية صب طاف، مع التأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
  6. إضافة بلطف 500 ميكرولتر تقدم طازجة الجليد الباردة الايثانول 70٪، مع التأكد من عدم تعكير صفو بيليه. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 20000 x ج في 4 ج. صب بعناية طاف.
  7. بيليه الجافة لحوالي 20 دقيقة (أو حتى الجافة) في فراغ سرعة 45 مئوية.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف في البروتوكول. ويمكن تخزين الكريات DNA الجافة في -20 مئوية.
  8. الكريات Resuspend في 10 ميكرولتر ده 2 O. الماصة مرارا فوق المنطقة حيث الحمض النووي مكعبات، على الرغم من أن بيليه المجففة لا يمكن أن ينظر إليه.
  9. نقل 10 ميكرولتر من كل عينة إلى الطازجة 0.3 مل أنبوب PCR أو 8-رف، اعتمادا على عدد من العينات.

19. P7 التمهيدي تمديد رد الفعل

  1. ملء P7 التمهيدي تمديد الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 18). جعل التمديد خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج ملحق (ناقص Φ 29 البلمرة) لكل عينة 10 ميكرولتر. الماصة إلى المزيج.
  3. عينات تشغيل في Thermocycler باستخدام برنامج (الجدول 19) لالتمهيدي يصلب إلى القالب حتى 30 ج "عقد" خطوة.
  4. إضافة 1 ميكرولتر Φ 29 البلمرة أثناء ج 30 "عقد" خطوة في البرنامج. الماصة إلى المزيج. استئناف ما تبقى من البرنامج (الجدول 19).

20. A-المخلفات رد الفعل

  1. ملء-المخلفات والحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 20). جعل A-المخلفات المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من A-المخلفات مزيج لكل عينة. الماصة إلى المزيج.
  3. في Thermocycler، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 C، ثم تسخين تعطيل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 75 مئوية.

21. P5 محول من ربط رد الفعل

  1. فيللتر من P5 محول من ربط الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 21). جعل من ربط خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من P5 من ربط مزيج لكل عينة. الماصة إلى المزيج.
  3. في Thermocycler، احتضان عينات لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية.

22. حبة النظيفة المتابعة

ملاحظة: يرجى الاطلاع على قسم المواد للحصول على تفاصيل الشركة المصنعة على حبة تنظيف.

  1. نقل كل عينة 50 ميكرولتر لأنبوب 1.5 مل جديد.
  2. و resuspend تنظيف الخرز على محور دوار مصغرة أنبوب في تحديد سرعة 15 لمدة 15 دقيقة في RT. لا تدع حبات تسوية قبل pipetting ل.
  3. إضافة 60 ميكرولتر تنظيف الخرز لأخذ عينات (1.2: 1 تنظيف حبات لعينة نسبة أمر بالغ الأهمية لإزالة الحمض النووي الذي هو أقصر من 200 زوج قاعدي). الماصة لخلط لمدة 20 ثانية.
  4. و resuspend تنظيف الخرز على محور دوار مصغرة أنبوب في تحديد سرعة 15 لمدة 3 دقائق على RT. تدور لفترة وجيزة الأنابيب.
  5. وضع أنابيب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.الماصة قبالة وتجاهل طاف.
    ملاحظة: لا تستخدم الشفط في هذا القسم لأنها سوف تمتص حبات التنظيف.
  6. إضافة 400 ميكرولتر من تقدم طازجة RT 70٪ من الإيثانول على كل عينة أثناء وجودهم على الرف المغناطيسي. لا تخلط. نضح طاف. كرر 2X.
  7. تجف حبات تنظيف لمدة 10 دقيقة في RT. وهذا اللون من الخرز بدوره الظلام إلى الشقوق البني والصغيرة جدا الخفيفة ستكون مرئية في بيليه الراتنج عندما حبات جافة.
  8. إلى أزل الحمض النووي، وإضافة 40 ميكرولتر 10MM تريس (7.5 درجة الحموضة). الماصة جيدا لخلط لمدة 20 ثانية.
  9. وضع العينات على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. ببطء الماصة ونقل 36 ميكرولتر شطافة مباشرة إلى 0.3 مل أنابيب PCR.
  10. الانتقال مباشرة إلى تفاعل PCR أو تخزين eluates في -20 مئوية.

يوم 4: PCR وجل تحليل

23. PCR

  1. ملء الحسابات مزيج الرئيسي PCR (الجدول 22). جعل مزيج PCR. الماصة بلطف جدا لخلط لتجنبفقاعات.
  2. إضافة 14 ميكرولتر من PCR مزيج لكل عينة DNA 36 ميكرولتر. الماصة إلى المزيج. الحفاظ على عينات على الجليد حتى جاهزة للوضع في Thermocycler.
  3. لمراقبة إيجابية PCR، وتشمل مكتبة معدة مسبقا. للسيطرة PCR سلبية، وتشمل المياه. عينات تشغيل في Thermocycler باستخدام برنامج PCR (الجدول 23).

24. جل إعداد والحمض النووي الختان، والتخيل

  1. تماما نظيفة وشطف مربع هلام حجم مناسب مع الماء منزوع الأيونات. إعداد agarose هلام 1.5٪ (التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل إيثيديوم بروميد) مع سميكة مشط، في جميع أنحاء البئر التي يمكن أن تعقد 60 ميكرولتر.
    ملاحظة: بروميد إيثيديوم (EtBr) هي مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بحذر.
  2. تدور باستمرار PCR أنابيب العينات لفترة وجيزة لجمع التكثيف.
  3. إضافة 1/5 حجم 6X صبغ زيلين الحمض النووي لعينة مجتمعة. لا تستخدم برموفينول الأزرق في صبغ الحمض النووي لأنه يهاجر في نفس الموقع مثل الحمض النووي عينة.
  4. تحميل كامل عينة كثافة العملياتس كل بئر، ويفضل أن يكون مع الآبار الفارغة بين العينات.
    يجب عدم تشغيل المكتبات بنفس الأرقام القياسية في نفس هلام: مذكرة.
  5. تحميل 7 ميكرولتر 100 سلم غليان على جانبي العينات. تشغيل هلام في 140 V لحوالي 30-45 دقيقة حتى صبغ برموفينول في سلم هو ¾ الطريق هلام.
  6. صورة وتصور هلام على نقل transilluminator في إعداد الأشعة فوق البنفسجية منخفضة. استئصال أجزاء من الاغاروز تحتوي على شظايا الحمض النووي 200-500 نقطة أساس. كن حذرا جدا لتجنب الاستغناء عن الفرقة محول ديمر الذي يمتد على 125 سنة مضت.
  7. وضع كل شريحة هلام رفعه في أنبوب 15 مل. رقم قياسي الوزن الصافي من كل شريحة هلام. أكتب هذا الوزن مباشرة على أنبوب.
  8. الصورة، حفظ، والحواشي هلام المستأصل لتأكيد الصحيح نطاق حجم المحدد.

25. جل تنقية

  1. تنقية الحمض النووي من شريحة هلام رفعه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع إجراء التعديلات التالية.
  2. حل شريحة هلام بواسطة هزازفي RT على منصة هزاز. وسوف يستغرق حوالي 20 دقيقة إلى حل.
  3. للحصول على الحمض النووي عالي النقاء، وغسل الأعمدة مع 0.5 مل العازلة QG هلام بعد حل مر العمود.
  4. بعد غسل العازلة المؤسسة العامة، وترك الأعمدة الجلوس على RT لمدة 2-5 دقيقة. تدور لمدة 1 دقيقة في 13000 x ج في RT.
  5. للسماح للغرفة لمزيج الرئيسي تفاعل PCR، وعينات أزل مع 40 ميكرولتر EB العازلة في أنبوب 1.5 مل الطازجة.

26. الحمض النووي الكمي

  1. إعداد العينات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الجدول 24). عينات قياس في أداة المحدد مع أنابيب البصرية.
  2. بمجرد كميا المكتبات الشذرة إكسو، تقديم لتسلسل على منصة يستخدم التسلسل عن طريق التوليف الكيمياء 16 متوافق مع محولات الحمض النووي في هذا البروتوكول.
    ملاحظة: عادة، 2 ميكرولتر من عينة كافية لتقدير، ولكن أكثر قد يكون ضروريا إذا تركيز العينة أقل. الحمض النووي ينتج نموذجيمجموعة لاي بين 50 و 200 نانوغرام.
  3. بعد الكمي، وعينات مخزن في -20 مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتوضح الأرقام التالية نتائج ممثلة من بروتوكول الشذرة إكسو المقدمة هنا. وعلى النقيض من المنهجيات التقليدية رقاقة وما يليها مع بضع خطوات الأنزيمية، الشذرة إكسو يتطلب أحد عشر التفاعلات الأنزيمية التي تعتمد بشكل تسلسلي (الشكل 1). وبالتالي، يجب توخي الحذر في كل خطوة لضمان أن تتم إضافة كل عنصر رد فعل على مزيج رد فعل الماجستير الخاصة به. نوصي بإنشاء جدول صيغية تعتمد على الجداول رد فعل لأداء العمليات الحسابية مزيج رد فعل سيد تلقائيا، طباعة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم بروتوكول الجيني وظيفية لتحديد موقع ملزم دقيق لونين تتفاعل البروتينات بطريقة غير متحيزة، على نطاق الجينوم في القريب قرار الزوج القاعدة. الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق قرب قاعدة قرار التعيين الزوج هو العلاج نوكلياز خارجية من الحمض النووي المخصب الشذرة في حين لا يزال immunoprecipitate على الراتنج المغناطيسي. ظاهريا، يمكن أن بروتين المجمعات يحتمل أن يعثرا في الجسم الحي البصمة من أي فرعية معينة (على سبيل المثال، المجمعات إعادة عرض لونين أو الجسيمات الأساسية الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر مختبر Venters وأعضاء قسم علم وظائف الأعضاء الجزيئي والفيزياء الحيوية على المناقشات المفيدة. شكر خاص لفرانك بوغ على توجيهه وتوجيهه والعديد من المناقشات الثاقبة حول الفروق الدقيقة في ChIP-exo عندما كنت زميلا لما بعد الدكتوراه في مختبره.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
37٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانول ، 10 × 10 مل أمبولاتThermoFisher Scientific28908القسم 3
كوكتيل كامل لمثبطات البروتياز (CPI)Roche Life Science11873580001الأقسام 4 ، 8
Bioruptor sonicatorDiagenodeUCD200القسم 5
أنابيب البوليسترين 15 ملBD Falcon352095القسم 5
MagSepharose Protein G Xtra BeadsGE Healthcare28-9670-66القسم 6
DynaMag-1.5 مل الرف المغناطيسي الجانبيInvitrogen12321Dالأقسام 6-17 ، 22
صغير دوارفيشر Scientific05-450-127الأقسام 7 ، 22
T4 DNA PolymeraseNew England BioLabsM0203القسم 9
Polymerase I ، KlenowNew England BioLabsM0210القسم 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2)New England BioLabsB7002الأقسام 9-11 ، 13 ، 15 ، 20
Thermomixer CEppendorf5382الأقسام 9-16
ATPRoche Life Science010419979001الأقسام 9 ، 11 ، 13
dNTPsNew England BioLabsN0447الأقسام 9 ، 12 ، 19 ، 23
T4 بولي النوكليوتيدات كينازNew England BioLabsM0201الأقسام 9 ، 13
dATPNew England BioLabsN0440الأقسام 10 ، 20
Klenow 3'-5 'Exo ناقصNew England BioLabsM0212الأقسام 10 ، 20
T4 DNA ligase   ؛نيو إنجلاند BioLabsM0202الأقسام 11 ، 21
& phi ؛ -29 DNA PolymeraseNew England BioLabsM0269الأقسام 12 ، 19
10x & phi ؛ -29 BufferNew England BioLabsB0269الأقسام 12 ، 19
Lambda ExonucleaseNew England BioLabsM0262القسم 14
10x Lambda BufferNew England BioLabsB0262القسم 14
RecJf< / sub> ExonucleaseNew England BioLabsM0264القسم 15
Proteinase KRoche LifeScience 03115828001القسم 16
GlycogenRoche Life Science010901393001القسم 18
10x T4 Ligase BufferNew England BioLabsB0202القسم 21
AMPure XP (تنظيف) الخرز   ؛بيكمان كولترA63881القسم 22
Q5 بدء ساخن DNA Polymerase New England BioLabsM0493القسم 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)New England BioLabsB9027القسم 23
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704القسم 25
كيوبت الفلورومترInvitrogenQ33216القسم 26
أنابيب الكيوبت البصرية الشفافة   ؛InvitrogenQ32856القسم 26
كيوبيت dsDNA مجموعة فحص عالية الحساسيةInvitrogenQ32851القسم 26
أنبوب DNA

المراجع

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RecJf

مقالات ذات صلة