مقالة منهجية

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

DOI:

10.3791/55030

⸱

يناير 10, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, 2California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), University of California Berkeley

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لهندسة مرحلة الهالة للأنابيب النانوية الكربونية أحادية الجدار الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (SWNTs) باستخدام البوليمرات البرمائية والحمض النووي لتطوير أجهزة استشعار للأهداف الجزيئية بدون عناصر التعرف المعروفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنابيب النانوية الكربونية أحادية الجدار (SWNTs) هي فئة من المواد النانوية النشطة بصريا التي تتألق في الأشعة تحت الحمراء القريبة ، بالتزامن مع النافذة البصرية حيث تكون العينات البيولوجية أكثر شفافية. هنا ، نحدد تقنيات لامتصاص البوليمرات البرمائية والأحماض متعددة النوى على سطح SWNTs لهندسة مراحل الهالة وإنشاء مستشعرات جزيئية جديدة للجزيئات والبروتينات الصغيرة. مستشعرات SWNT الوظيفية هذه متوافقة حيويا ومستقرة. يتم امتصاص البوليمرات على سطح الأنبوب النانوي إما عن طريق صوتنة مباشرة من SWNTs والبوليمر أو عن طريق تعليق SWNTs باستخدام خافض للتوتر السطحي متبوعا بغسيل الكلى مع البوليمر. يتم تأكيد انبعاث التألق واستقرارها واستجابتها لاستهداف التحليلات باستخدام الامتصاص والتحليل الطيفي الفلوري القريب من الأشعة تحت الحمراء. علاوة على ذلك ، نظهر تثبيت سطح المستشعرات على الشرائح الزجاجية لتمكين الفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء لتوصيف امتصاص البوليمر وحركية ربط التحليل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحد الجدران أنابيب الكربون النانوية (SWNTs) هي بالذرة طبقات رقيقة من ذرات الكربون دخلت طويلة، واسطوانات رقيقة تظهر خصائص الإلكترونية والبصرية فريدة من نوعها. (1) تشمل هذه الخصائص لإنتاج القريب الأشعة تحت الحمراء (نير) الانبعاثات مضان عبر إعادة التركيب الأكسيتون التي تعتبر حساسة للغاية لبيئته المحلية الفرقة الفجوة. انبعاث نير من SWNTs يندرج ضمن إطار الأشعة تحت الحمراء القريب الذي عمق تغلغل الضوء القصوى للالأنسجة البيولوجية. 2،3 بالإضافة إلى ذلك، SWNTs يحمل العديد من المزايا الفريدة الشاذة على النقيض من fluorophores العضوية: SWNT المعرض تحول ستوكس كبيرة، لا photobleach، ولا وميض. 4 في الآونة الأخيرة، واستغلال هذه الخصائص أدت إلى تطوير مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار الجزيئية الجديدة مع تطبيقات لعلم الأحياء. 5،6 معدلة، ومع ذلك، SWNTs هي غير قابلة للذوبان في الماء، ويمكن الحصول على تعليق من SWNTs فرد أن يكون تحديا. 7،8 Bundliنانوغرام وتجميع SWNTs في حل يمكن أن تعتم مضان الفرقة الفجوة، و2 مما يجعلها غير صالحة للتطبيقات الاستشعار عن بعد.

تفريق الأنابيب النانوية الكربونية الفردية في محلول مائي يتطلب تعديل سطحها لمنع تجميع يحركها للا مائية. 9 بينما التساهمية التعديل يمكن أن تجعل SWNTs للذوبان في الماء، و 10 وكذلك نقلها الكيمياء ملزم معين، ومواقع الخلل في شعرية SWNT تقلل أو تهدأ مضان الانبعاثات الخاصة بهم. بدلا من ذلك، SWNT functionalization ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام السطحي، والدهون، والبوليمرات والحمض النووي 9،11 - 13 أن كثف على سطح أنابيب من خلال التفاعل التراص مسعور وبي-بي. يشار إلى البيئة الكيميائية الناتجة المحيطة SWNTs-functionalized السطح لكمرحلة الاكليل لها. الاضطرابات إلى مرحلة الهالة يمكن أن يكون لها تأثير كبير على excitons السفر على سطح الأنابيب النانوية، مما تسبب التحويرات إلى SWNT فلورescence الانبعاثات. ومن هذه العلاقة الحساسة بين مرحلة الهالة ومضان SWNT التي يمكن استغلالها لتطوير أجهزة الاستشعار الجزيئية الجديدة من خلال دمج طرائق محددة ملزمة على مساحة كبيرة من SWNT. الاضطرابات إلى مرحلة الهالة SWNT على تحليلها ملزمة يمكن أن يؤدي إلى تغيرات في البيئة المحلية عازلة، تهمة نقل، أو إدخال عيوب شعرية، والتي يمكن أن تعدل الانبعاثات مضان من SWNTs لتكون بمثابة آلية نقل الإشارة. يستخدم 14 هذا النهج في تطوير أجهزة استشعار الفلورسنت جديدة للكشف عن العديد من فئات مختلفة من جزيئات الحمض النووي بما في ذلك، 15،16 الجلوكوز 17 و جزيئات صغيرة مثل ATP، 18 أنواع الاكسجين التفاعلية 19 وأكسيد النتريك. 20،21 ومع ذلك، فإن هذه النهج محدودة وذلك لأنها تعتمد على وجود طريقة ملزمة المعروفة لالحليلة المستهدفة.

في الآونة الأخيرة، والمزيد من التطبيق عاموقد وضعت روتش لتصميم أجهزة استشعار الفلورسنت باستخدام SWNTs functionalized غير تساهمي مع heteropolymers محبة للجهتين الدهون الفوسفاتية، والأحماض polynucleic. هذه الجزيئات كثف على السطوح أنابيب الكربون لإنتاج تعليق مستقرة للغاية من SWNTs فردية 22-25 مع مراحل الهالة الفريدة التي يمكن أن تربط خصيصا بروتينات 26،27 أو جزيئات صغيرة بما في ذلك الدوبامين ناقل عصبي. يشار 30 الهندسة المرحلة الاكليل لتفريق SWNTs وتحديدا التحاليل الهدف ربط المرحلة كما الهالة الاعتراف الجزيئي (CoPhMoRe) - 28. 28 حجم صغير، سمية منخفضة، وارتفاع الاستقرار وunbleaching مضان نير من أجهزة الاستشعار CoPhMoRe SWNT جعلها المرشحين ممتازة للاستشعار في الجسم الحي لقياسات حل زمنية ممتدة. وقد أظهرت 6 العمل الزوار تطبيقاتها في الأنسجة النباتية للكشف بصري من أنواع النيتروجين والاكسجين التفاعلية. 31تطبيق مثيرة بشكل خاص لأجهزة الاستشعار CoPhMoRe SWNT هو احتمال تسمية كشف خالية من الناقلات العصبية مثل الدوبامين في الجسم الحي، حيث تقنيات أخرى، مثل الاستشعار الكهروكيميائية أو المناعية، وتعاني من نقص في القرار المكانية، القرار الزماني، وخصوصية.

وقد تم حتى الآن ضبط النفس تصميم واكتشاف أجهزة الاستشعار CoPhMoRe SWNT حسب حجم والكيميائية تنوع مكتبة مشتتة، مما يحد من احتمال العثور على جهاز استشعار لهدف معين. حتى الآن، وقد الباحثين خدش السطح فقط من مترافق المتاحة، وشارك في كتلة والبيولوجية والبوليمرات الجزيئية الحيوية التي يمكن أن تكون المشتتات كما الفعالة وظيفيا لأجهزة الاستشعار SWNT. هنا، فإننا نقدم طرق مختلفة لكلا تفريق SWNTs وتميز مضان من أجل فحص عالية الإنتاجية وتحليل استشعار SWNT واحد. على وجه التحديد، ونحن الخطوط العريضة للإجراءات SWNTs طلاء مع oligom حمض polynucleicالمتطلبات البيئية باستخدام صوتنة مباشرة، فضلا عن كيفية functionalize SWNT مع البوليمرات محبة للجهتين من خلال تبادل السطحي بواسطة غسيل الكلى. نحن نستخدم (GT) 15 -DNA والبولي ايثيلين جلايكول functionalized مع رودامين ثيوسيانات (RITC-PEG-RITC) على سبيل المثال. ونحن لشرح استخدام (GT) 15 -DNA SWNTs كجهاز استشعار CoPhMoRe للكشف عن الدوبامين. وأخيرا، فإننا تتخذه من إجراءات لتنفيذ قياسات الاستشعار جزيء واحد، والتي يمكن استخدامها لتوصيف أو الاستشعار عن جزيء واحد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبيه: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (SDS) قبل الاستخدام. قد يكون متناهية الصغر الأخطار إضافية مقارنة بنظيره المواد السائبة بهم. استخدام كل ممارسات السلامة المناسبة بما في ذلك الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، الضميمة الضوضاء)، ومعدات الحماية الشخصية (النظارات الواقية، نظارات واقية، معطف المختبر، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية).

1. إعداد العازلة، السطحي، وحلول البوليمر

  1. إعداد 100 حل ملي كلوريد الصوديوم
    1. حل 584 ملغ من كلوريد الصوديوم في 80 مل من الماء منزوع الأيونات. يضاف الماء منزوع الأيونات لجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل.
  2. إعداد 3٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) حل
    1. حل 3 غرام من SDS في 80 مل من الماء منزوع الأيونات. يضاف الماء منزوع الأيونات لجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل.
  3. إعداد 2٪ كوليت الصوديوم (SC) حل
    1. حل 2 غرام من الاحمقالبوتاسيوم كوليت هيدرات في 80 مل من الماء منزوع الأيونات. يضاف الماء منزوع الأيونات لجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل.
  4. إعداد العازلة التصوير (1X تريس: 20 ملي تريس، 100 مم كلوريد الصوديوم)
    1. حل 22.23 غرام من قاعدة تريس و58.44 غرام من كلوريد الصوديوم في 500 مل من الماء منزوع الأيونات باستخدام شريط مغناطيسي ولوحة.
    2. بعناية إضافة حمض الهيدروكلوريك المركز حتى يتم التوصل إلى الرقم الهيدروجيني من 8.1.
    3. يضاف الماء منزوع الأيونات لتصل إلى الحجم النهائي من 1 L.
  5. توليف RITC-PEG-RITC البوليمر
    1. حل الأمينات difunctionalized البولي ايثيلين جلايكول (PEG) (5 كيلو دالتون أو 20 كيلو دالتون، 0.1 مول / لتر) وثيوسيانات رودامين (RITC، 0.2 مول / لتر) في 1 مل من 1: 1 خليط من ثنائي كلورو ميثان وثنائي ميثيل الفورماميد (DMF).
    2. إضافة 0.2 مول / لتر من N، N -diisopropylethylamine (DIEA).
    3. بعد 3 ساعات، يعجل مع 10x حجم ايثر تليها الترشيح فراغ.
    4. تنحل في DMF وتكرار الأثير اتباعه هطول الأمطارالزواج عن طريق الترشيح فراغ.
      ملاحظة: ثيوسيانات الجزيئات المعدلة أخرى (على سبيل المثال، ثيوسيانات فلوريسئين، FITC) يمكن تركيبها على الربط أو غيرها من أمين تعديل البوليمرات باستخدام طريقة مشابهة.
  6. إعداد مضاد للفيروسات الحمض النووي (PEG-DNA)
    1. الجمع بين 100 ميكرولتر من تريس (2-carboxyethyl) حل الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) (0.5 M، ودرجة الحموضة 7.0) مع 44.9 ميكرولتر من 5'-ثيول المعدلة الحمض النووي (1 ملغ / 10 ميكرولتر في 0.1 M كلوريد الصوديوم) وإضافة إلى 4.855 مل من الماء منزوع الأيونات.
    2. يقلب لمدة 1 ساعة.
    3. حل 500 ملغ من methoxypolyethylene غليكول maleimide في 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة.
    4. الجمع بين الحمض النووي وPEG حلول (10 مل الكل) ويقلب لمدة 24 ساعة.

2. إعداد واحدة المسورة الكربون الأنابيب الجزيئية (SWNTs) المعلقات

  1. غسل من SWNTs لإزالة محفز والشوائب.
    1. إضافة 200-300 ملغ من SWNTs غير مغسولة في البلاستيك أنبوب الطرد المركزي المآخذ الكهربائيةining 45 مل من الماء منزوع الأيونات.
    2. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة ويصوتن يستخدم sonicator الحمام لمدة 5 دقائق. لاحظ أن sonicator الإعدادات تختلف من أداة إلى أداة، لذلك تأكد من أن الكثافة الضوئية للزيادات حل SWNT (أي سوداء) لضمان أن يتم تفريق SWNTs.
    3. أجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 20 دقيقة في 16100 x ج وتجاهل طاف.
    4. إضافة حوالي 45 مل من الماء منزوع الأيونات الطازجة.
    5. كرر الخطوات 2.1.2-2.1.4 يصل إلى 8 مرات.
    6. إزالة الماء قدر الإمكان والحرص على عدم تعكير صفو SWNTs مكعبات والسماح SWNT بيليه الهواء الجاف.
  2. تعليق الحمض النووي من SWNTs
    1. حل الأحماض النووية (NA) في 0.1 م كلوريد الصوديوم إلى تركيز 100 ملغ / مل.
    2. إزالة الكهرباء الساكنة من ملعقة القابل للتصرف، أنابيب microcentrifuge والأسهم SWNT باستخدام بندقية مكافحة ساكنة. في غطاء الدخان، إضافة 20 ميكرولتر من الحل NA 980 ميكرولتر من 00.1 M كلوريد الصوديوم تليها إضافة 1 SWNTs ملغ.
    3. باستخدام ultrasonicator مع 3 مم قطر الحافة، يصوتن الحل لمدة 10 دقيقة في 40٪ السعة في حمام الثلج.
    4. أجهزة الطرد المركزي في حل الحمض النووي SWNT مرتين لمدة 90 دقيقة في 16100 ز س. في حالة استخدام الربط بين الحمض النووي، وتنقية من الغلو والحمض النووي غير المتفاعل وPEG باستخدام 100 كيلو دالتون تدور التصفية. إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني لملء تدور تصفية وتدور في 9300 x ج لمدة 1.5 دقيقة، كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات.
    5. جمع والحفاظ على طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه تحتوي على حزم المركز الوطني للاستشعار والركام. تجاهل بيليه وفقا للإجراءات النفايات الخطرة المؤسسية المناسبة للمواد النانوية.
    6. قياس الامتصاصية حل في 632 نانومتر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية / فيس معمل لتحديد تركيز تقريبي من SWNTs مع وقف التنفيذ باستخدام ε = 0.036 لتر / سم · ملغ وفقا للقانون لامبرت-البيرة وعامل التخفيف المناسبة.
  3. تعليق البوليمر محبة للجهتينمن SWNTs
    1. إزالة الكهرباء الساكنة من ملعقة القابل للتصرف، أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، والأوراق المالية SWNT. في غطاء الدخان، إضافة 5 SWNTs ملغ إلى 5 مل من 2٪ من محلول SC (بدلا من ذلك، SDS الحل يمكن استخدامها).
    2. باستخدام ultrasonicator مع 6 مم طرف، يصوتن الحل لمدة 1 ساعة على 40٪ السعة في حمام الثلج.
    3. عينة الطرد المركزي في 150000 x ج لمدة 4 ساعات باستخدام نابذة وجمع بعناية طاف.
    4. حل 1٪ بالوزن من البوليمر محبة للجهتين (على سبيل المثال، RITC-PEG-RITC) في حل SC-SWNT.
    5. Dialyze الحل البوليمر-SC-SWNT باستخدام غشاء غسيل الكلى 3.5 كيلو دالتون ضد 1 لتر من الماء منزوع الأيونات أو المخزن المؤقت لمدة 5 أيام. تغير من الماء أو المخزن المؤقت بعد ساعة 2 و ساعة 4. غشاء غسيل الكلى أكبر يمكن استخدامها، طالما أنه يسمح إزالة التوتر السطحي من خيار، ولكن الإبقاء على كل من SWNT والبوليمر محبة للجهتين.
    6. قياس الامتصاصية حل في 632 نانومتر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية / فيس معمل لتحديدتركيز تقريبي من SWNTs مع وقف التنفيذ باستخدام ε = 0.036 لتر / سم * ملغ وفقا للقانون لامبرت-البيرة وعامل التخفيف المناسبة.

3. إعداد السطح مشلول مجسات SWNT

  1. إعداد BSA-البيوتين والحلول الأسهم NeutrAvidin
    1. حل 10 ملغ مجفف بالتجميد BSA-البيوتين في 1 مل من الماء منزوع الأيونات لجعل 10 ملغ / مل حل الأسهم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. حل 10 ملغ من البروتين NeutrAvidin (NAV، deglycosylated البروتين أفيدين) في 2 مل من الماء منزوع الأيونات لجعل 5 ملغ / مل محلول المخزون. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية. قسامات إذابة يمكن أن تبقى لعدة أيام في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد BSA-البيوتين شرائح المجهر المغلفة
    1. تنظيف شريحة المجهر و 0.17 ملم الغطاء الزجاجي (أو بما يتناسب مع الهدف المجهر) مع الماء منزوع الأيونات، تليها الميثانول، والأسيتون وشطف النهائي من الماء منزوع الأيونات.
    2. إنشاء قنوات عن طريق وضع عدة قطع من الشريط على الوجهين ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر على شريحة المجهر نظيفة. اغلاق القنوات من خلال اتخاذ ساترة الزجاج طويل والضغط عليه على الجزء العلوي من الشريط مزدوجة من جانب. مما لا شك فيه أنها تمحورت على شريحة المجهر حتى حواف الغطاء زلة والانزلاق ليست دافق.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من BSA-البيوتين حل الأوراق المالية إلى 900 العازلة ميكرولتر من 1X تريس إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل.
    4. تدفق 50 ميكرولتر من الحل BSA-البيوتين في القناة من قبل pipetting الحل في نهاية واحدة وفتل بعيدا حل في الطرف الآخر باستخدام الأنسجة. احتضان لمدة 5 دقائق تليها 3-5 الإحمرار مع 50 ميكرولتر من 0.1 M كلوريد الصوديوم.
    5. تمييع 40 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الأسهم NAV في 960 العازلة ميكرولتر 1X تريس إلى تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل.
    6. تدفق 50 ميكرولتر من الحل NAV في القناة من قبل pipetting الحل في نهاية واحدة وفتل بعيدا حل في الطرف الآخر باستخدام الأنسجة. احتضان لمدة 2-5 دقائقتليها 3-5 الإحمرار مع 50 ميكرولتر من 0.1 M كلوريد الصوديوم.
    7. تمييع الحلول الأسهم من SWNTs علقت في المخزن التصوير لتركيز 1-10 ملغم / لتر وتدفق 50 ميكرولتر من الحل في القناة واحتضان لمدة 5 دقائق.
    8. شطف بلطف بعيدا SWNTs الزائدة باستخدام 50 ميكرولتر من العازلة التصوير.
  3. إعداد APTES silanized شرائح المجهر
    silanized APTES الشرائح تسمح وسيلة لشل سالبة الشحنة SWNTs الملفوفة الحمض النووي على سطح الركيزة الزجاج: ملاحظة.
    1. يعد حل 10٪ من (3-أمينو) triethoxysilane (APTES) في الإيثانول.
    2. عن طريق القنوات التي تستخدم الخطوات المذكورة في 3.2.2، تتدفق في 100 العازلة ميكرولتر من 1X تريس.
    3. طرد القناة مع حل APTES واحتضان لمدة 5 دقائق. يغسل مع العازلة 1X تريس.
    4. تمييع الحلول الأسهم من علق الحمض النووي SWNTs في المخزن التصوير لتركيز 1-10 ملغ / تدفق الأرض 50 ميكرولتر من الحل في القناة وincubأكل لمدة 5 دقائق.
    5. شطف بلطف بعيدا SWNTs الزائدة باستخدام 50 ميكرولتر من العازلة التصوير.

4. مضان الطيفي والمجهري من SWNT مجسات

  1. نير الإسفار المجهر
    1. أداء التصوير من SWNTs يجمد السطح باستخدام الإثارة ليزر ومجهر مقلوب تجهيزه مع مجموعة أجهزة الاستشعار InGaAs للتصوير.
    2. توجيه شعاع ليزر لدخول ميناء الإضاءة الخلفي للمجهر مقلوب باستخدام المرايا على يتصاعد الحركية للتعديل وزوج من قزحية العين بعد تركيبه لتعيين ارتفاع الميناء. ضمان شعاع هو مستوى ومباشرة بتأكيد أنها تمر عبر كل من القزحيات عندما وضعت بين المرايا لاحقة، وقبل أن يدخل ميناء الإضاءة. إذا لزم الأمر، وضبط ارتفاع شعاع باستخدام المنظار التجمع. إزالة أي مرشحات الحرارة القصير تمر على منفذ الإضاءة التي من شأنها التخفيف من شعاع.
    3. إدراج مرشح مكعب المناسب إلى المجهرلتعكس ضوء الإثارة إلى الهدف وجمع ضوء الانبعاثات. هذا ويتكون عادة من مزدوج اللون مرشح تمريرة طويلة مع قطع فوق الطول الموجي الإثارة، (على سبيل المثال، 750 ليرة لبنانية) والانبعاثات تمريرة طويلة فلتر (على سبيل المثال، 850 ليرة لبنانية) لمزيد من تقليل ضوء الإثارة متناثرة من ضرب أجهزة الاستشعار. بالإضافة إلى ذلك، تصفية الانبعاثات يمكن اختيار أن تكون انتقائية لانبعاث SWNTs من شرليتي معين.
    4. أداء تعديلات دقيقة إلى محاذاة شعاع من خلال إدخال مكعب محاذاة المناسب ليحل محل الهدف مع اثنين من تعويض، وأقراص بلوري تحتوي على 1 الثقوب ملم. محاذاة شعاع إلى مركز كل من أقراص الدنيا والعليا المحاذاة.
    5. نعلق جهاز استشعار 2D InGaAs مجموعة إلى ميناء التصوير جانب المجهر باستخدام المحول المناسب وعدسة 0.5X إذا لزم الأمر لاستيعاب حجم الاستشعار.
    6. باستخدام 100X الهدف غمر النفط (1.4 NA)، وتطبيق النفط الغمر خالية من مضان ووضع immobiعينة SWNT lized على خشبة المسرح المجهر.
    7. رفع الهدف حتى الاتصالات للنفط في الجزء السفلي من الزجاج غطاء (# 1.5، 170 ميكرون سمك). إجراء تعديلات على طوق موضوعي إذا لزم الأمر لظروف التصوير، على سبيل المثال، ودرجة الحرارة، وسمك الزجاج، الخ
    8. رفع ببطء الهدف مع مصدر الإثارة على ورصد إشارة مضان من كاميرا InGaAs. كثافة مضان ينبغي أن تزيد تدريجيا مع اقتراب طائرة الوصل السطح وأجهزة الاستشعار يجمد حيز التركيز.
  2. نير الإسفار الطيفي
    ملاحظة: مضان الطيفي يمكن القيام بها باستخدام الإعداد المجهر نفسه ولكن عن طريق توجيه الضوء جمعها خارج الجسم المجهر وفي مطياف وInGaAs مجموعة خطية كاشف.
    1. باستخدام يتصاعد والمرايا الحركية تصنيف لنير، ويوجه مسار الضوء نحو فتحة مدخل مطياف. تركيز الضوء وصولا الى البويالإقليم الشمالي على مدخل شق باستخدام عدسة التركيز (على سبيل المثال، بلانو محدب، F = 150 مم). ويتم إنجاز هذا التوافق من خلال التخفيف من قوة الليزر ل<1 ميغاواط واستبدال الهدف المجهر مع "مرآة 1 واستخدام 50/50 شعاع تقسيم مرشح مكعب. وعلى ضوء الإثارة ثم تترك الجسم المجهر من خلال فتحة الخروج، ويمكن أن تستخدم لضبط المرايا والعدسات لتركيز شعاع على فتحة المدخل.
    2. بعد استبدال الهدف المجهر وفلتر تمريرة طويلة، وضع لوحة جيدا على خشبة المسرح وتسجيل الأطياف من عينة في التركيز باستخدام مطياف وInGaAs مجموعة.
  3. قياس استجابة عكسها من (GT) 15 الحمض النووي SWNTs إلى الدوبامين
    1. جبل استشعار المغلفة القنوات على خشبة المسرح المجهر وتجلب إلى التركيز باستخدام هدف النفط 100X وكاميرا InGaAs. إضافة 50 ميكرولتر من 100 ميكرومتر حل الدوبامين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى قناة تدفق وسجلالتغير في كثافة مضان.
    2. تغسل حل الدوبامين باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة ومراقبة التغيير في مضان من أجهزة الاستشعار SWNT الفردية.
  4. فحص جيد لوحة للاستجابة تحليلها من SWNTs أجهزة الاستشعار
    ملاحظة: فحص التحاليل المختلفة يمكن القيام بها باستخدام لوحة جيدا شفافة التحكم باستخدام مرحلة الآلية. لوحة جيدا مثالية غير واضحة للعيان والأشعة تحت الحمراء ولها الجوانب السوداء للحد من الحديث المتبادل بين الآبار.
    1. أحجام ماصة متساوية من أجهزة الاستشعار SWNT مع وقف التنفيذ (على سبيل المثال، 5 ملغم / لتر تركيز) في كل بئر، وهو ما يكفي لتغطية الجزء السفلي من موحد بشكل جيد، وعادة> 100 ميكرولتر لوحة 96-جيدا و> 30 ميكرولتر لوحة 384 جيدا .
    2. التحاليل ماصة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر، و 100 ميكرومتر الحجم النهائي) من الفرز مكتبة في لوحات جيدا. إعداد كل تحليلها في ثلاث نسخ لحساب احتمال جيد الى جيد الاختلاف، fluctuatالأيونات من شدة الإثارة، أو درجة الحرارة.
    3. رفع الهدف (على سبيل المثال، 20X achroplan، 0.45 NA) في حين رصد أطياف الانبعاثات باستخدام مطياف وInGaAs مجموعة. والموقف الأمثل لهدف وضع البؤري تقريبا في منتصف حجم العينة في البئر، التي يجب أن تتوافق مع الحد الأقصى في كثافة يقاس.
    4. لكل بئر عينة، تسجيل التعرض ل10/01 الصورة لجمع طائفة.
    5. مقارنة الأطياف الانبعاثات لكل بئر إلى عنصر تحكم يحتوي على SWNTs فقط دون تحليلها إضافية لقياس استجابة مضان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علقت SWNTs في محلول مائي باستخدام كل السطحي والبوليمرات محبة للجهتين صوتنة المباشر وعن طريق تبادل غسيل الكلى. ويبين الشكل 1 SWNTs، ونمت باستخدام طريقة الكربونيل الحديد المحفزة (HiPCO)، مع وقف التنفيذ باستخدام SC، RITC-PEF20-RITC، و (GT) 15 -DNA. الكثافة البصرية من SWNTs مع SDS (أو البوليمر) يزيد بشكل كبير بعد صوتنة والنقصان على إزالة الركام والملوثات من خلال تنقية بواسطة الطرد المركزي (الشكل 1). قياسات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلقت SWNTs بسهولة في محلول مائي عبر صوتنة المباشر مع SDS أو ssDNA، كما يدل على زيادة في الكثافة الضوئية المقدمة من تشتت الغروية من الناتج الهجين SWNT البوليمر. SDS وssDNA يشتت وsolubilizes حزم من SWNTs بواسطة التكثيف على السطح SWNT من خلال التفاعلات الطاردة للماء أو بي-بي. بالإضافة إلى ذلك، البوليمرات الأخرى، مثل الحمض النووي الجيني، والبوليمرات محبة للجهتين البوليمرات مترافق والدهون، ويمكن كثف على سطح SWNTs بواسطة غسيل الكلى من العينات علقت استخدام SC أو SDS. البوليمرات ماء، مثل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة Burroughs Wellcome Fund المهنية في الواجهة العلمية (CASI) ، ومنحة مؤسسة Simons Foundation ، ومنحة الباحث الشاب لمؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271-1
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتشL6026
هيدرات كولات الصوديومسيجما ألدريتشC6445
قاعدة تريس (قاعدة تريزما )سيجما ألدريتش93362
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA144-212
أمين - PEG - أمين ، NH 2 < / sub >-PEG-NH 2 < / sub>Nanocs IncPG2-AM-5k
الرودامين ب إيزوثيوسياناتسيجما ألدريتش283924
الفلوريسين إيزوثيوسياناتسيجما ألدريتشF7250
ثنائي كلورو ميثانسيجما ألدريتش676853
ثنائي ميثيل فورماميدسيجما ألدريتشD4551
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806
ثنائي إيثيل الأثيرSigma Aldrich673811
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريدسيجما ألدريتشC4706  
5'-الحمض النووي المعدل بالثيول  الحمض النووي المتكاملة
ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميدسيجما ألدريتش63187
100 كيلو دالتون مرشحات الدورانMillipore
HiPCO Super النقاء أنابيب الكربون النانوية أحادية الجدارIntegrisHiPco SuperPurified
الفوسفات المخزنة المالحةSigma AldrichP5493
بندقية مضادة للكهرباء الساكنةميلتيميلتي زيروستات 3
أجهزة طرد مركزيEppendorf5415 D
ultra sonicatorCole ParmerCV18
كاسيت غسيل الكلىThermo ScientificSlide-A-Lyzer G2 87722
BSA-biotinThermo Scientific29130
بروتين نيوترافيدينThermo Scientific31000
(3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان (APTES)سيجما ألدريتش440140
مجهر مقلوبZeissAxio Observer.Z1
مرايا حركيةThorLabsKM200-E03
منظارThorLabsRS99
زيت الغمرZeissImmersol 518f
100X الموضوعيZeissPlan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000
20X الهدفZeissN-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 
غطاء زجاجيHealthrow HS159879H
الدوبامين هيدروكلوريدسيجما ألدريتشH8502   ؛
كاميرا صفيف الأشعة تحت الحمراء 2DPrinceton InstrumentsNIRvana
أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء 1DPrinceton InstrumentsPyLoN IR
nIR مطيافPrinceton InstrumentsSCT-320
عدسة محدبةThorLabsLA1384
ألواح البئر (قاع زجاجي)كورنينج4580
تقنيات مجموعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
  2. O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
  3. Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
  4. Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
  5. Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
  6. Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
  7. Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
  8. Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
  9. Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
  10. Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
  11. Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
  12. Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
  13. Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
  14. Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
  15. Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
  16. Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
  17. Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
  18. Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
  19. Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
  20. Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
  21. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
  22. Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
  23. Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
  24. Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
  25. Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
  26. Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241(2016).
  27. Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
  28. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
  29. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
  30. Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
  31. Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
  32. Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
  33. Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
  34. Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة