مقالة منهجية

توسع الأوعية السفن المعزولة وعزل مصفوفة خارج الخلية من الفئران ضيق الجلد

DOI:

10.3791/55036

⸱

مارس 24, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> نصف عزل مصفوفة القلب خارج الخلية من الفئران الضابطة C57Bl / 6J والفئران ذات الجلد المشدود والفئران ذات الجلد المشدود المعالجة بالببتيد المثبط IRF5. نصف أيضا دراسات توسع الأوعية على الأوعية المعزولة من C57Bl / 6J والفئران ذات الجلد المشدود والفئران ذات الجلد المشدود المعالجة بالببتيد المثبط IRF5.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد العامل التنظيمي للإنترفيرون 5 (IRF5) أمرا بالغ الأهمية للخلايا لتحديد ما إذا كانت تستجيب بطريقة مؤيدة للالتهابات أو مضادة للالتهابات. تعد قدرة IRF5 على تبديل الخلايا من مسار إلى آخر جذابة للغاية كهدف علاجي. لقد صممنا ببتيد شرك IRF5D مع برنامج نمذجة جزيئية لتصميم الجزيئات والببتيدات الصغيرة.

IRF5D يثبط IRF5 ، وقلل من التغيرات في المصفوفة خارج الخلية ، وحسن توسع الأوعية البطانية في الفأر ذو الجلد المشدود (Tsk / +). KD ل IRF5D ل IRF5 المؤتلف هو 3.72 ± 0.74 × 10-6 M كما هو محدد من خلال تجارب الربط باستخدام تجارب قياس تداخل الطبقة الحيوية. لم يتغير تكاثر الخلايا البطانية (EC) وموت الخلايا المبرمج باستخدام تركيزات متزايدة من IRF5D (0 إلى 100 ميكروغرام / مل ، 24 ساعة). عولجت الفئران Tsk/+ ب IRF5D (1 ملغم/كغ/يوم تحت الجلد، 21 د). انخفضت تعبيرات IRF5 و ICAM بعد علاج IRF5D. تم تحسين وظيفة البطانة كما تم تقييمها عن طريق توسع الأوعية في شرايين الوجه من الفئران Tsk/+ المعالجة ب IRF5D مقارنة بالفئران Tsk/+ بدون علاج IRF5D. كعامل نسخ ، ينتقل IRF5 من العصارة الخلوية إلى النواة. تم تقييم الإزاحة عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية على الخلايا العضلية القلبية المزروعة على مصفوفات القلب خارج الخلية المختلفة. أدى علاج IRF5D للفأر TSK / + إلى انخفاض عدد النوى الإيجابية ل IRF5 مقارنة بالحيوانات التي لم تتم معالجتها ب IRF5D (50 ميكروغرام / مل ، 24 ساعة). توضح هذه النتائج الدور المهم الذي يلعبه IRF5 في الالتهاب والتليف في فئران Tsk / +.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم نمو الخلايا وموت الخلايا الاستجابات المناعية أمر أساسي لدور الأسرة عامل النسخ من العوامل التنظيمية مضاد للفيروسات. يتم تمييز IRF5 بأنها حاسمة لتنظيم الاستجابات المناعية بين النوع 1، وتعزيز الاستجابة الالتهابية والنوع 2، وإصلاح الأنسجة الاستجابة المناعية الاستهداف. IRF5 أساسية في سرطان 1، والمناعة الذاتية 2، 3، 4، 5.

الماوس ضيق الجلد (تصك / +) هو نموذج لتليف الأنسجة وتصلب الجلد بسبب طفرة الازدواجية في الجينات fibrillin-1. هذه الطفرة النتائج في الجلد محكم وزيادة في النسيج الضام. هذه الفئران تطوير التهاب عضلة القلب، والتليف وأخيرا فشل القلب 5، 6، 7،> 8، 9. تصلب الجلد هو اضطراب المناعة الذاتية التي تؤثر متليفة ما يقرب من 150،000 مريض في الولايات المتحدة (6). السمات المميزة لهذا المرض هي تليف الأعضاء الداخلية بما في ذلك القلب 7، 8، 9، 10، 11.

طبيعة الدراسة طالبت تصميم الببتيد المثبطة. وقد تم اختيار نهج البرامج على النهج التقليدي باستخدام عرض فج. النهج البرنامج هو أسهل وأقل استهلاكا للوقت. يستخدم البنك بيانات RCSB لتحديد مواقع الربط المناسبة 12. لدراسة التفاعل بين الببتيد المصممة حديثا مع البروتين المؤتلف والتركيز على معايير ملزمة، تم استخدام تقنية تسمى biolayer التداخل. Biolayer التداخل هو techniq جهاز الاستشعار البيولوجي تستندرق الذي يحدد ملزمة تقارب وتكوين الجمعيات وتبرؤ باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي وعينة ملزمة. وجهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن يكون fluorescently، luminescently، وصفت radiometrically وcolorimetrically. ويستند هذا القياس على إضافة جماعية أو نضوب تشبه الجمعيات وتبرؤ 13 و 14. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى فهم دور IRF5 في التهاب عضلة القلب وتليف. وكان الهدف هو التبصر في دور IRF5 في تطوير تليف الأنسجة وتصلب الجلد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (البروتوكول: AUA # 1517). وقد أجريت جميع البحوث التي تنطوي على الفئران بما يتفق مع سياسة خدمات الصحة العمومية.

1. تصميم شرك الببتيد

  1. البحث عن هيكل 3D من IRF5 وقاعدة التصميم على ذلك. تصميم 17 مير، ووصف IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD)، حيث يتم استبدال اسبارتاتي (D) ل(S) سيرين لتقليد الفسفرة في IRF5 في 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). اقترح تحليل مجموعة 3D سلفهيدريل ومعرفة آلية IRF5 للتفعيل، أي سيرين الفسفرة، أن استراتيجية واحدة لاستهداف IRF5 كانت لتوليد الببتيد شرك. انظر الشكل 1. لتحديد أفضل منطقة في هيكل 3D، استخدام برنامج النمذجة الجزيئية لتصميم molecul صغيروفاق و الببتيدات 15.
    ملاحظة: خطوة حاسمة في هذه العملية هو توافر هيكل 3D من البروتين المستهدفة والمواقع المحتملة ملزمة. هيكل 3D من IRF5 يمثل بدقة dimerizes كيف IRF5 بعد الفسفرة. والاستعانة بمصادر خارجية استبدال اسبارتاتي لسيرين أو ثريونين. ويتم تصنيع الببتيد على حدة دون ربطها IRF5.
  2. تكرار الفوسفات المجال ببساطة عن طريق استبدال D لS. استنادا إلى تسلسل الأصلي (ELSWSADSIRLQISNPD، وجعل IRF5S الببتيد جديدة مع تسلسل الأحماض الأمينية من 2 ايه سي ELDWDADDIRLQIDNPD-نيو هامبشاير (IRF5D).

2. Biolayer التداخل (BLI)

ملاحظة: تم الاستعانة بمصادر خارجية وتنقية IRF5 المؤتلف. 16

  1. التسمية البيوتين IRF5 في نسبة المولي 1: 1 من البيوتين ليجند مع كاشف biotinylation دمج رابط سلسلة طويلة. سوف رابط سلسلة طويلة ضمان الدوري الاسباني أكثر نشاطا ومتجانسةسطح الثانية.
    1. إضافة 1 مل من 2 ملغ / مل IRF5 إلى 13 ميكرولتر من 20 ملي البيوتين كاشف أو زيادة الكميات إذا لزم الأمر. احتضان على الجليد لمدة 2 ساعة. بعد وضع العلامات، واستخدام عمود تحلية تدور لإزالة خليط التفاعل من البروتين المسمى.
  2. احتضان يجند المسمى البيوتين مع أجهزة الاستشعار لمدة 15 دقيقة. تجنب الإفراط في وضع العلامات وضبط نسبة 1: 1 الرحى. بعد وضع العلامات، واستخدام عمود تحلية تدور لإزالة خليط التفاعل من البروتين المسمى.
  3. احتضان البيوتين وصفت أجهزة الاستشعار IRF5 لمدة 10 دقيقة في تركيزات مختلفة من الببتيد IRF5 شرك. تم تحديد معدلات تكوين الجمعيات والتفكك كما هو موضح 10، 17، 18.

3. موت الخلايا المبرمج وانتشار فحوصات

  1. انتشار الفحص عبر bioreduction من نتروبلو
    1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ /كغ / د، حقن حجم 20 ميكرولتر في 20 غ الماوس) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران لمدة 21 يوما.
    2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
    3. ليز قلوب مع العازلة البروتين تحلل تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و 0.5٪ NP-40، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 50 ملي ناف 10 وتحديد تركيز البروتين برادفورد فحص 19.
    4. معطف لوحات 96-جيدا مع C57BL / 6J مصفوفة القلب معزولة كما هو موضح في قسم 7. تمييع برنامج تلفزيوني علقت C57BL / 6J مصفوفة القلب إلى تركيز 20 ميكروغرام / مل وإضافة 30 ميكرولتر من C57BL / 6J القلب إلى كل بئر. السماح لها تسوية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    5. ثقافة خلايا الوريد السري الإنسان باستخدام 500 مل من البطانية القاعدية مالقانونين مع 0.4٪ مستخلص البقري الدماغ، 0.1٪ حمض الاسكوربيك، 0.1٪ الهيدروكورتيزون، 0.1٪ عامل نمو البشرة البشري، 2٪ مصل بقري جنيني و 0.1٪ أضاف جنتاميسين / الأمفوتريسين B إليها. ثقافة الخلايا على 96 لوحات جيدة في 5٪ CO 2 و 95٪ هواء الغرفة مع كثافة من 25000 خلية لكل جيدا. حفز مع زيادة تركيزات IRF5D بين 0-100 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام (وبلغ حجم التداول بين 0 و 50 ميكرولتر / مل).
    6. تحديد تكاثر الخلايا بعد ثلاثة أيام وتقييم الاختلافات في الامتصاصية على قارئ صفيحة. رد الفعل هو bioreduction من MTS نتروبلو المجمع. ويتم إنتاج NADPH أو NADH من الانزيمات نازعة في خلايا نشطة عملية الأيض.
    7. كما يتم تخزين نتروبلو مجمع MTS المجمدة في -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد المجمع ببطء على مدى ما يقرب من 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ماصة 20 ميكرولتر في كل بئر من 96 لوحة جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة لذلك. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات في humidified، 5٪ CO 2 غرفة.
    8. قراءة الامتصاصية عند طول موجي 490 نانومتر.
  2. موت الخلايا المبرمج فحص عن طريق النشاط كاسباس
    ملاحظة: انشاء التجريبية هو نفسه على النحو الوارد أعلاه 3.1.1 إلى 3.1.5.
    1. تحفيز الخلايا مع زيادة تركيزات IRF5D بين 0-100 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام.
    2. إضافة كشف الأخضر لالركيزة كاسباس 3/7 إلى ECS واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تقييم مضان على قارئ صفيحة ميكروسكوبية في وقت واحد مع الطول الموجي امتصاص / انبعاث 502/530 نانومتر. تشغيل تجارب في ثلاث نسخ.
      ملاحظة: عامل الفلورية الخضراء هو الببتيد حمض أميني أربعة بد أن صبغة ملزمة الحمض النووي. هذا كاشف يصبح الفلورسنت عندما المشقوق بعد كاسباس 3 و 7 التنشيط. يتم قياس هذه مضان. ميزة هي انخفاض في خطوات غسل.

4. تقييم IRF5 وICAM-1 التعبير في اسمعواتي

  1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ / كغ / يوم، حقن حجم 20 ميكرولتر في 20 غ الماوس) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران مرة واحدة في اليوم لمدة 21 يوما.
  2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
  3. ليز قلوب مع العازلة البروتين تحلل تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و 0.5٪ NP-40، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 50 ملي ناف 10 وتحديد تركيز البروتين برادفورد فحص 19.
    1. إجراء طخة غربية على لست] من القلوب. تمييع عينات إلى 25 ميكروغرام البروتين الكلي وبلغ حجم التداول 40 ميكرولتر مع العازلة عينة Laemmli تحتوي على 5٪ المركابتويثانول. تشغيل العينات على 4-15٪ TGX هلام في 50 فولت لمدة 5 دقائق. زيادة الجهد إلى 100 فولت لمدة 1 ساعة حتى تدير الجبهة صبغ بها.
    2. وضع الجل في 1X العازلة نقل (25 ملي تريس، 190 ملي الجلايسين، 20٪ الميثانول، وضبط درجة الحموضة إلى 8.3 إذا لزم الأمر)، واحتضان ل10-15 دقيقة.
    3. تجميع ساندويتش نقل (الإسفنج، والتصفية، هلام، غشاء السليلوز، مرشح، الإسفنج). تأكد من عدم وجود فقاعات المحاصرين في بين. يجب أن يكون وصمة عار على الكاثود والجل على الأنود. نقل لمدة 1 ساعة في غرفة باردة في 100 مللي أمبير.
    4. في اليوم التالي، شطف وصمة عار ثم منع الخلفية في 5٪ الحليب الجاف الخالي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف وصمة عار مع تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على 5٪ توين ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. احتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية باستخدام الأجسام المضادة الأولية لIRF5 أو ICAM-1. تمييع الأجسام المضادة في تريس مخزنة المالحة في التخفيف 1: 1000.
    6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في تريس مخزنة المالحة واحتضان وصمة عار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. عن الأجسام المضادة الثانوية، واستخدام الفجل البيروكسيداز مترافق حمار لمكافحة فأر الإيجG (1: 10000) والفجل البيروكسيديز حمار المضادة للماعز مفتش (1: 10000)، على التوالي.
    7. تطبيق التوهج إلى وصمة عار بعد مكونات الخلط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان لمدة 3 دقائق لluminesce عصابات الفائدة. فضح وصمة عار إلى فيلم الأشعة السينية. استخدام يماغيج لقياس كثافة. تطبيع قيم الكثافة إلى عصابات تحكم 10.

5. تقييم أرقام الخليوي التهابات بعد IRF5 تثبيط

  1. إدارة IRF5D مخففة في برنامج تلفزيوني (1 ملغ / كغ / د) تحت الجلد بإبرة 27 عيار بواسطة تقنية scruffing القياسية أو برنامج تلفزيوني وحدها لتصك / + وC57BL / 6J الفئران لمدة 21 يوما.
  2. تخدير الفئران مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب. المفاجئة تجميد وتخزين قلوب رفعه حتى التحليل.
  3. جبل قلوب المجمدة على TISSأصحاب رق المناسبة لناظم البرد في الاستخدام. قطع 10 ميكرون أقسام المجمدة سميكة على ناظم البرد لالمناعية.
  4. إصلاح الأجزاء المجمدة مع 1٪ امتصاص العرق في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize الأقسام مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    تحذير: لامتصاص العرق هو مادة مسرطنة للتنظيم ويجب التعامل معها بحذر.
  5. تخفيف المضادة للأرنب CD64، وهو الوحيدات / بلعم علامة 1: 200 في برنامج تلفزيوني. تنطبق على الأبواب الثابتة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
  7. تمييع لمكافحة الفئران NIMP، العدلات علامة الابتدائية 1: 200 في برنامج تلفزيوني. تنطبق على الأبواب الثابتة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق ومكافحة فأر اليكسا 488 مترافق 1: 200 في برنامج تلفزيوني.
  10. تطبيق المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق ومكافحة فأر اليكسا 488 الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى أقسام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لذلك. حجم الأجسام المضادة تختلف وفقا لحجم القسم. وينبغي أن يشمل المبلغ الذي قسم بسخاء. في معظم الحالات حجم ما بين 100 و 200 ميكرولتر.
  11. استخدام 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) باعتباره وصمة عار النووية في التخفيف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 ميكرولتر إلى 1 مل برنامج تلفزيوني واستخدام دابي في خطوة غسل الماضية. إضافة وسائط تصاعد مائي لزلة غطاء ووضعه على الشريحة.
  12. تحليل الأقسام fluorescently المسمى بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام الهدف النفط 40X. استخدام الإثارة الأطوال الموجية 488 وانبعاث موجات أكبر من 530 نانومتر لCD64 وNIMP. كان متحمس دابي مع 360 نانومتر، وتنبعث عند 460 نانومتر في اللون الأزرق. التمييز حيدات / الضامة والعدلات (ن = 10 صور في الضد من 3 الفئران مختلفة في كل مجموعة) عن طريق وضع العلامات على مختلف وعدها. التعبير عن البيانات وعدد الخلايا فرزها.

6. خلية توسع الأوعية تابع بعد IRF5 تثبيط

  1. تخدير C57BL / 6J السيطرة على الفئران وتصك / + الفئران مع وبدون علاج الببتيد مع الكيتامين (80-100 ملغ / كلغ) / زيلازين (10-12،5 ملغ / كلغ) الخليط. حقن خليط الكيتامين / زيلازين البريتونى. كبح الماوس يدويا.
    1. استخدام مقياس 25 أو إبرة أصغر. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن. سحب الغواص قبل الحقن لضمان أن الإبرة لا يدخل أحد الأوعية الدموية أو الأمعاء.
  2. مرة واحدة وقد وصلت إلى مستوى كاف من التخدير، وتأمين الماوس في موقف ضعيف، يمسح الفراء مع الكحول غارقة الشاش، واستخدام زوج من مقص فتح التجويف الصدري وإزالة القلب.
    ملاحظة: سوف استنزاف الموت ببطء الماوس وجعل تشريح أسهل عن طريق تخفيف الضغط في الأوعية الدموية مما يقلل النزيف عندما قطع الأوعية الدموية.
    1. فتح النقيب الجلدجا زوج من مقص، وقطع حتى من جانبي الصدر إلى عظم الفك مع الرعاية حتى لا تعكر صفو الأنسجة الكامنة نحو الجزء الأمامي من الفك.
    2. تشريح الشريان الوجهي عن طريق إزالة الأنسجة الناعمة المحيطة بها.
    3. تحذير: لا تجرح السفينة أو الساحبة على الشريان الوجهي مع الحفاظ على النسيج يتعرض استحم في المخزن اجتماعات الأطراف (2.0 ملي CaCl 2 · 2H 2 O، 0.02 ملي EDTA، 5.0 ملي الجلوكوز، 4.7 ملي بوكل، 1.17 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، 3.0 اجتماعات الأطراف مم، 145 مم كلوريد الصوديوم، 1.2 ملي ناه 2 ص 4 · H 2 O، 2.0 ملي حمض البيروفيك) لمنع جفاف. أداء تحت التكبير تشريح ستيريو المجهر مجهر (التكبير من 3.5X إلى 45X) ومصدر ضوء الألياف البصرية.
  3. عزل الشريان الوجهي.
    1. فهم الأقرب الوجهية إلى التشعب الأول والبعيدة إلى حيث سيتم قطع الشريان. قطع الشريان من الشريان الأم، الشريان السباتي الخارجي. إزالة arterie الوجهيةالصورة من السيطرة على الفئران، تصك / + الفئران مع وبدون علاج IRF5D.
    2. في حين لا يزال يمسك الشريان في ملقط، وقطع فرعين نزوله الوجهية، والسماح للسفينة أن رفع بلطف بينما يمكن تحديد أي نوع من الأنسجة المحيطة المصقول، وقطعت.
    3. الاستمرار بهذه الطريقة حتى يتم الوصول إلى التشعب قطع كلا الشرايين ابنة لتحرير السفينة. ليست هناك حاجة لكبح السفن قبل قطع بسبب خففت الضغط في الأوعية الدموية من إزالة القلب. وضع السفينة في المخزن اجتماعات الأطراف في حين يتم تشريح الشريان الوجهي الآخرين ومعزولة.
    4. يقني؛ يدخل القنية السفن عن طريق ربط لهم على الماصات الزجاجية التي يبلغ قطرها محطة من 125-175 ميكرون. تهيئة تحميلها على الماصات الزجاجية وخزانات عازلة العازلة مع اجتماعات الأطراف.
      تنبيه: منع فقاعات الهواء من تشكيل في ماصات.
    5. ربط السفن على ماصات باستخدام الخيوط الجراحية في طب العيون.
  4. جبل غرف السفينة بناء على ميكر triocular مقلوبoscope مع مرفق كاميرا الفيديو. تشغيل الفيديو من خلال نظام قياس الفيديو الفرجار لفي قياسات الشاشة من السفن. 20
    1. تضغط عليهم في عملية من خطوتين. أولا، مع خزانات مملوءة اجتماعات الأطراف، على ارتفاع فوق سفينة تساوي الضغط 20 مم زئبق، يدويا فتح الصمامات والديوك في خطوط الخزان إلى السفينة. تفتيش السفينة بحثا عن علامات على تسرب حول العلاقات ونزولا على طول السفينة. ثانيا، رفع الخزانات إلى 60 مم زئبق وreinspect السفينة.
    2. مرة واحدة الضغط على 60 مم زئبقي، والسماح للسفن لتتوازن لمدة 30 دقيقة.
  5. من أجل تقييم توسع الأوعية ردا على أستيل كولين (10 -7 إلى 10 -4 م)، preconstrict السفينة إلى قطر 50-75٪ من الحد الأقصى قطرها باستخدام 1-3،0 × 10 -8 إلى 10 -7 M U46619. بعد السماح للسفينة لتحقيق الاستقرار لمدة 6 دقائق، إضافة أستيل إلى الحمام في خطوات مدة 2 دقيقة مثل أنتركيزات النهائي في الحمام هي 10 -7 و 10 -6، 10 -5 و 10 -4. قياس توسع الأوعية في المجموعات الثلاث.

7. عزل القلب خارج الخلية مصفوفة

  1. تخدير C57BL / 6J السيطرة على الفئران وتصك / + الفئران مع وبدون علاج الببتيد مع isoflurane (5٪) وإجراء خلع عنق الرحم. استئصال قلوب بقطع مفتوح الصدر على طول عظمة القص. وترفع من القلب مع ملقط وإزالة القلب.
  2. وضع قلوب إزالتها في كوب وإضافة 15 مل مفرط التوتر 1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS). تستنهض الهمم قلوب في حل SDS 1٪ لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتفريق الخلايا عن طريق إضافة شريط ضجة في حل SDS 1٪ ووضع الكأس على طبق من ضجة.
    تحذير: كن على علم بأن المصفوفة خارج الخلية سوف تتفكك إذا تركت فترة طويلة جدا في حل مفرط التوتر. على العكس من ذلك، إذا لم يتم تحريكها قلوب طويلة بما فيه الكفاية في حل مفرط التوتر، ثم سوف الخلايا غير صحيححل، وسوف يكون هناك حطام الخلايا المتبقية في الكأس.
  3. يغسل لمدة 30 دقيقة في 15 مل 0.5٪ تريتون X-100. ثم يغسل لمدة 15 دقيقة مع 15 مل من برنامج تلفزيوني. Decellularize كل قلب على حدة.
  4. الأداة الإضافية تجميد المصفوفة خارج الخلية في النيتروجين السائل وpowderize المصفوفة خارج الخلية القلب المجمدة مع هاون تبرد قبل ومدقة.
  5. جعل التعليق من المصفوفة المسحوق في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ المضادات الحيوية. حجم المضافة في معظم الحالات هو 300 ميكرولتر. يصوتن تعليق ل30 - 60 ق على الجليد على الإعداد عالية.
    ملاحظة: من المهم جدا أن العينة تبقي الباردة. كن على علم بأن تعليق غير لزجة جدا ويرجع ذلك إلى ارتفاع محتوى البروتين غليكان.
  6. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
    ملاحظة: تأكد من وجود مضادات حيوية ومضادات للفطريات في التعليق. البنسلين / الستربتوميسين هي الأكثر شيوعا والموصى بها.

8. تقييم إزفاء النووية من قبل Immunohistochemistراي

  1. لأطباق معطف والشرائح استخدام تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل من المصفوفة خارج الخلية القلبية في برنامج تلفزيوني. الماصة 500 ميكرولتر من محلول القلب خارج الخلية مصفوفة في صحن 100 مم للطلاء و 150 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية النهائي على شريحة.
  2. تمنع IRF5 بإضافة IRF5D في تركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة على الفئران myocytes القلب حديثي الولادة في الثقافة. ترك السيطرة الثقافات العضلية دون علاج.
  3. تقييم الاتجار IRF5 من العصارة الخلوية إلى النواة باستخدام المناعي وتحليل المجهري متحد البؤر. التعرف على العلامات الأخضر لIRF5، وتحديد دابي وصمة عار الأزرق للنواة
  4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية مكافحة IRF5. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية في التخفيف 1: 200 في برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، واتبع مع ثلاث خطوات غسل 5-مين. والأجسام المضادة الثانوية الماعز اليكسا 488 المسمى مكافحة فأر مفتش الأضداد.
  5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 دي lution في برنامج تلفزيوني. احتضان الضد الثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحقيق وصمة عار النووية مع دابي. تمييع دابي 1: 1000 في برنامج تلفزيوني. تغسل الشرائح ما مجموعه 3 مرات لمدة 5 دقائق وإضافة دابي إلى الخطوة غسل الثالثة والأخيرة.
  6. الاتجار التقاط باستخدام المجهر متحد البؤر وحدة قياس مضان في نوى والعصارة الخلوية كما سبق وصفها 10. التعرف على العلامات الأخضر لIRF5، وتحديد دابي وصمة عار الأزرق للنواة. الخلايا التي تظهر نوى الزرقاء مع وضع العلامات الأخضر في نفوسهم تحتوي على تنشيط IRF5، التي يتم الاتجار بهم من العصارة الخلوية إلى النواة. وجدت لصق البطاقات الخضراء عندما لم يتم تنشيط IRF5 في العصارة الخلوية.
  7. تحليل الخلايا fluorescently المسمى بواسطة المجهر متحد البؤر باستخدام الهدف النفط 40X. استخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر، وانبعاث موجات أكبر من 530 نانومتر لIRF5. استخدام الطول الموجي الإثارة من 360 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 460 نانومتر لرؤية دابي.

الحمار = "jove_title"> 9. الإحصاء

  1. إجراء تحليل التباين (ANOVA) لاتخاذ تدابير المتكررة داخل وبين المجموعات. اتبع أنوفا مع تعديل بونفيروني للطلاب اختبار (ت). التعبير عن البيانات والخطأ المعياري للمتوسط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت النتائج أظهرت في الشكل 1 كيفية تصميم الببتيد. الرقم 1، أعلى اليسار، يظهر المنطقة (بين الأسهم الصفراء 2، والأحماض الأمينية (أأ) 425-436) في IRF5 الذي فسفرته من قبل عدد من تحركات. الرقم 1، الجزء العلوي الأيمن، يظهر البيضاوي الأصفر حيث يرتبط نطاق فسفرته IRF5 ل. وقد تناوب على هيكل مثنوي من 3DSH لمراقبة شق أو الوادي إلى اليسار من اللولب 2 (aa303-312). هذا هو المكان الذي يفترض مجال الفوسفات الذيل م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الهدف هو تصميم المانع IRF5 لتوضيح دور IRF5 على الالتهاب والتليف، وظيفة الأوعية الدموية في قلوب تصك / + الفئران. النتائج هي التي IRF5D لم لحث على الانتشار أو موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض الالتهاب وظيفة الأوعية الدموية تحسنت. وتشير هذه البيانات إلى أن IRF5 تلعب دورا الآلية هاما في تطوير التهاب وتليف في قلب تصك / + الفئران، وأنه لديه القدرة ليكون بمثابة الهدف العلاجي.

وكانت الخطوة الأولى لتصميم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL-089779 (DW) و HL-112270 (KAP) و HL-102836 (KAP) و Cimphoni Life Sciences (جزء من راتب DW). يشكر المؤلفون ميغان سيتسما على تحرير المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  Triton X 100Sigma AldrichX100- 100 مل
Alexa 488-labeled الماعز المضاد للجسم المضاد IgG  كاشف Thermo FisherA11001
BardfordThermo Fisher23200Pierce 
أجهزة الاستشعار الحيويةForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
CellEvent Caspase-3/7Substrate Thermo Fisher / Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Cell Assay KitPromegaG3580Promega
DAPI (4 & prime;,6-diamidino-2-phenylindole)تخفيف Thermo FisherD-13061: 1,000 في PBS
حمار مضاد للفئران Alexa 488Thermo FisherA-212081: 1,000 تخفيف في PBS
ECL بالإضافة إلىGE healthcare / AmershamRPN2133بعد الكثير من التجربة والخطأ ، عدنا إلى هذا
المجهر Eclipse TE 200-U مع برنامج المسح بالليزر EZ C1Nikon
الماعز المضاد للأرانب Alexa 488Thermo FisherA-110081: 1,000 تخفيف في PBS
HRP & nbsp; مضاد للماعزسانتا كروز بيوتكنولوجيزsc-516086!: 10,000 تخفيف في TBS
HRP حمار مضاد للفأرسانتا كروز بيوتكنولوجيزsc-23151: 10,000 تخفيف في الجسم المضاد TBS
ICAM-1سانتا كروز بيوتكنولوجيزsc-15111:200 التخفيف في
الجسم المضاد PBS IRF5 (H56)سانتا كروز Biotechnologiessc-98651
قارئ الألواح الصغيرة Elx800Biotek
NIMP علامة العدلاتسانتا كروز بيوتكنولوجيزsc-1338211: 200 التخفيف في PBS
Octet REDForte Bioالبروتين
والبروتين ربط تصميم الببتيد   Medit SA البرمجياتRCSB.org
تخليق البروتين المؤتلف IRF5TopGene Technologiesالتعبير عن البروتين ، خدمة التوليف
فوسفات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتش436143المنظفات
صيدلية الكيتامينالجدول الثالث مادة خاضعة للرقابة ، الترسيب المطلوب   ؛
XylazineMedVet
3.5X-45X مجهر ستيريو ثلاثي العينيات مع أضواء LED معقوفةAm Scopeرمز المنتج: SM-1TSX-L6W
Zeba DesaltingColumns Thermofisher2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kitتحتوي مجموعة LonzaCC-3124على ملحقات النمو
VIA-100K& nbsp ؛ Boeckeler Instruments
4 - 15٪ TGX gelBio-Rad5671081
برنامج MedSuMoMedit ، Palaiseau ، فرنسا
Laemmli BufferBioRad

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
  2. Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
  3. Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
  4. Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
  5. Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
  6. Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
  7. Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
  8. Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
  9. Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
  10. Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046(2012).
  11. Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
  12. Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
  13. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  14. Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69(2006).
  15. Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
  16. Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
  17. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882(2014).
  18. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
  21. Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).
  22. Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
  23. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  24. Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).
  25. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  26. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  27. Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
  28. Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IRF5

مقالات ذات صلة