مقالة منهجية

زراعة انواع معينة ايليجانس في ثلاثة أبعاد في المختبر

DOI:

10.3791/55048

⸱

ديسمبر 12, 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة بسيطة لبناء 3D أنظمة زراعة الخيطية يسمى NGT-3D وNGB 3D. ويمكن استخدام هذه لدراسة اللياقة البدنية الخيطية والسلوكيات في الموائل التي هي أكثر مماثلة لانواع معينة ايليجانس الموائل الطبيعية من المختبر جيم لوحات ثقافة ايليجانس 2D القياسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى استخدام الكائنات الحية النموذجية الجينية مثل Caenorhabditis elegans إلى اكتشافات أساسية في علم الأحياء على مدى العقود الخمسة الماضية. معظم ما نعرفه عن C. ايليجانس يقتصر على الزراعة المختبرية للديدان الخيطية التي قد لا تعكس بالضرورة البيئات التي تعيش فيها عادة في الطبيعة. زراعة C. ايليجانس في موطن ثلاثي الأبعاد يشبه إلى حد كبير المصفوفة ثلاثية الأبعاد التي تواجهها الديدان في الفاكهة الفاسدة والسماد الخضري في الطبيعة يمكن أن يكشف عن أنماط ظاهرية وسلوكيات جديدة لم يتم ملاحظتها في 2D. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتناول التجارب في 3D كيف أن الأنماط الظاهرية التي نلاحظها في 2D ذات صلة بالدودة في الطبيعة. هنا ، طريقة جديدة تنمو فيها C. ايليجانس وتكاثر بشكل طبيعي في ثلاثة أبعاد. يمكن أن تسمح لنا زراعة C. ايليجانس في أنبوب نمو الديدان الخيطية 3D (NGT-3D) بقياس اللياقة الإنجابية ل C. ايليجانس سلالات أو ظروف مختلفة في بيئة ثلاثية الأبعاد. نقدم أيضا طريقة جديدة تسمى زجاجة نمو الديدان الخيطية-3D (NGB-3D) ، لزراعة C. ايليجانس في 3D للتحليل المجهري. تسمح هذه الأساليب للعلماء بدراسة C. ايليجانس بيولوجيا في ظروف أكثر انعكاسا للبيئات التي يواجهونها في الطبيعة. يمكن أن تساعدنا هذه على فهم الأهمية التطورية الكامنة لفسيولوجيا وسلوك C. ايليجانس التي نلاحظها في المختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت دراسة الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans في المختبر إلى اكتشافات أساسية في مجال علم الأحياء على مدى العقود الخمسة الماضية1. C. ايليجانس كان أول كائن حي متعدد الخلايا يتم تسلسل جينومه في عام 19982 ، وكان لا يقدر بثمن في فهم مساهمات الجينات الفردية في تطور وعلم وظائف الأعضاء وسلوك الكائن الحي بأكمله. يتطلع العلماء الآن إلى فهم أكبر لكيفية مساهمة هذه الجينات في بقاء الكائنات الحية ولياقتها الإنجابية في بيئاتها الطبيعية ، وطرح أسئلة حول البيئة والتطور على المستوى الجيني3-5.

C. يمكن أن يوفر مرة أخرى نظاما ممتازا للإجابة على هذه الأسئلة. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن C. ايليجانس بيولوجيا في موائل الديدان الخيطية الطبيعية ، ولا توجد طرق حالية لمحاكاة الظروف الطبيعية الخاضعة للرقابة ل C. ايليجانس في المختبر. في المختبر ، C. ايليجانس يزرع على سطح ألواح أجار المصنفة ببكتيريا الإشريكية القولونية 6. ومع ذلك ، في الطبيعة ، C. ايليجانس والديدان الخيطية ذات الصلة يمكن العثور عليها في التربة بشكل ضئيل في جميع أنحاء العالم ، ولكنها توجد على وجه التحديد تزدهر في الفاكهة المتعفنة والمواد النباتية7،8. تختلف هذه البيئات المعقدة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) تماما عن البيئات ثنائية الأبعاد البسيطة التي تتعرض لها الديدان في المختبر.

للبدء في الإجابة على أسئلة حول بيولوجيا الديدان الخيطية في بيئة ثلاثية الأبعاد أكثر طبيعية ، قمنا بتصميم موطن ثلاثي الأبعاد للزراعة المختبرية للديدان الخيطية التي أطلقنا عليها اسم Nematode Growth Tube 3D أو NGT-3D باختصار9. كان الهدف هو تصميم نظام نمو ثلاثي الأبعاد يسمح بنمو وتطور وخصوبة مماثلة للوحات 2D Nematode Growth Media (NGM) القياسية10. يدعم هذا النظام نمو البكتيريا والديدان الخيطية على مدار دورات حياتها بأكملها في 3D ، ويسمح للديدان بالتحرك والتصرف بحرية في ثلاثة أبعاد ، وهو سهل وغير مكلف في التصنيع والتوظيف.

في الدراسة الحالية ، نقدم طريقة خطوة بخطوة لتصنيع NGT-3D وتقييم تطور الديدان والخصوبة. بالإضافة إلى تقييم لياقة الدودة في 3D ، سعينا إلى تصوير وفيديو وتقييم سلوك الديدان وعلم وظائف الأعضاء في الزراعة ثلاثية الأبعاد. وبالتالي ، بالإضافة إلى NGT-3D ، نقدم هنا طريقة بديلة تسمى زجاجة نمو الديدان الخيطية 3D أو NGB-3D ، للتصوير المجهري ل C. ايليجانس أثناء الزراعة ثلاثية الأبعاد. سيكون هذا مهما بشكل خاص لدراسة السلوكيات المعروفة التي تم تحديدها في 2D ، وتحديد السلوكيات الجديدة الفريدة للزراعة ثلاثية الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول لNGT-3D وNGB-3D

  1. إعداد الحلول العقيمة التالية: 1 لتر من حل 0.1454 M كلوريد الصوديوم، 1 لتر من 1 M CaCl 2، 1 لتر من 1 M MgSO 4، استذابة مرق (LB)، 1 لتر من 1 M KPO 4 العازلة (108.3 غرام من KH 2 ص 4 و 35.6 غرام من K 2 هبو 4، وملء H 2 O إلى 1 L). إنتاج NGM استخدام هذه الحلول يمكن العثور عليها في بروتوكول السابق 10.
  2. حلول الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية، لمدة 15 دقيقة.
  3. تجهيز 50 مل من العقيمة 5 ملغ / مل حل الكولسترول. في أنبوب مخروطي 50 مل، مزيج 0.25 غرام من الكولسترول و 50 مل من 99.99٪ من الإيثانول وتخلط جيدا. لا الأوتوكلاف. تعقيم حل الكولسترول باستخدام حقنة 50 مل مع فلتر حقنة 0.45 ميكرون. وهذا أيضا إزالة أي الكوليسترول غير منحل.
  4. (اختياري) إعداد 10 مل من 150 ملي من 2'-ديوكسي-5-fluorouridine الأسهم (FUdR). في أنبوب مخروطي 15 مل، مزيج 0.3693 زمن FUdR و 10 مل من الماء المقطر. هز جيدا.

2. إعداد البكتيريا الثقافة لNGT-3D وNGB-3D

  1. تطعيم 10 مل مرق LB مع البكتيريا. البكتيريا العادية المستخدمة في C. ايليجانس التغذية هي كولاي سلالة OP50.
  2. ثقافة التلقيح البكتيرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها.
  3. استعدادا لتخفيف المسلسل، قسامة 9 مل من محلول كلوريد الصوديوم إلى العقيمة 15 مل أنابيب مخروطية. على سبيل المثال، قسامة 9 مل إلى ما مجموعه 7 أنابيب لجعل التخفيف 10 -7 من OP50 سلالة كولاي.
  4. باستخدام معقم ماصة 1000 ميكرولتر، الماصة 1 مل من ثقافة البكتيرية أو ثقافة البكتيرية المخفف في أنبوب جديد العقيمة مع 9 مل من محلول كلوريد الصوديوم ودوامة الخليط 10 مل جيدا. كرر حتى يتم الوصول إلى التخفيف البكتيرية المطلوب.
    ملاحظة: إن تخفيف البكتيرية المطلوب يعتمد على نوع وحالة من البكتيريا فضلا عن الظروف التجريبية بالضبط.على سبيل المثال، 10 -6 - كان 10 -8 التخفيف من OP50 سلالة كولاي كافية لإنتاج 1-200 المستعمرات البكتيرية في 6.5 مل أنبوب NGT 3D. الديدان وضعت بشكل موثوق وتتكرر عادة عندما بلغ عدد المستعمرات أكثر من 60، التي وقعت في التخفيف من 10 -6 - 10 -7. لNGB-3D، استخدم تخفيف من 10 -8.

3. صنع NGT-3D وNGB-3D (200 مل)

  1. بعد إعداد ثقافة البكتيرية، مزيج 0.6 غرام كلوريد الصوديوم، 1 غرام حبيبات أجار، و 0.5 ز ببتون في قارورة 500 مل. إدراج شريط مغناطيسي في قارورة.
  2. إضافة 195 مل من الماء المقطر، وتغطية الفم من القارورة بورق الألمنيوم.
  3. الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. ضع قارورة تعقيمها الساخنة على طبق من ذهب ضجة، ويقلب بسرعة معتدلة لا يقل عن 2 ساعة. تبريد قارورة إلى 40 درجة مئوية. ومن المؤكد أن تبرد بما فيه الكفاية المستمر من هنا في درجات حرارة عالية قد يؤدي إلى تغيم للأجار النهائي.ومع ذلك، قد يؤدي انخفاض درجات الحرارة في تصلب السابق لأوانه أجار.
    1. (اختياري) لتسريع عملية التبريد، ضع قارورة في 40 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة قبل وضع على لوحة ضجة.
  5. عندما تكون درجة الحرارة من وسائل الإعلام أجار تصل 40 درجة مئوية، إضافة 200 ميكرولتر 1 م CaCl 2، 200 ميكرولتر من 5 ملغ / حل الكولسترول مل، 200 ميكرولتر 1 م MgSO 4 و 5 مل 1 M KPO 4 العازلة مع استمرار حل لاثارة لتركيزات النهائي من 1 ملم CaCl الكوليسترول 2، 5 ميكروغرام / مل، 1 ملي MgSO 4، 1 ملم KPO 4.
    1. (اختياري) لNGT-3D عمر فحص إضافة 80 ميكرولتر من 150 مم FUdR إلى التركيز النهائي من 120 ميكرومتر 12.
  6. إضافة 6 مل من 10 مل مخففة ثقافة البكتيرية من الخطوة 2.4 في قارورة مباشرة.
    1. (اختياري) لNGT-3D، وإزالة 6 مل من وسائل الاعلام أجار قبل الخطوة 3.6 وإبقائه دافئا بشكل منفصل. وسيتم استخدام هذه الوسائط للبكتيريا مجاناالطبقة العليا.
  7. باستخدام الإجراءات العقيمة، والاستغناء عن وسائل الإعلام في غرفة الثقافة العقيمة. تأكد من أن غطاء حجرة يغلق بإحكام.
    1. (اختياري) لمنع المستعمرات البكتيرية من تشكيل في السطح العلوي للأجار، وجعل طبقة من وسائل الإعلام أجار خالية من البكتيريا من الخطوة 3.6.1 على رأس قبل وسائل الإعلام من الخطوة 3.7 يصلب تماما. وهذا خلق منطقة خالية من البكتيريا في الجزء العلوي من NGT 3D.
    2. لNGT-3D، صب 6.5 مل وسائل الاعلام الى 8 مل واضحة أنابيب اختبار من البلاستيك لجعل طبقة البكتيريا أجار، والاستغناء بعناية 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة البكتيريا على رأس وسائل الإعلام تصلب شبه 3D لجعل bacteria- رقيقة طبقة حرة على القمة.
    3. لNGB-3D، صب 65 مل من وسائل الاعلام الى 25 سم 2 واضح من البلاستيك زجاجة ثقافة الخلية. هذا المبلغ يجب ملء الجسم من 25 سم زجاجة الثقافة 2 الخلية.
  8. ترك غرف عموديا في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع للسماح للمستعمرات البكتيرية للنموإلى حجم كبير لا يقل عن 1 ملم قطر.
    1. (اختياري) لفحص عمر في NGT-3D، غرف غطاء بورق الألمنيوم لمنع تدهور ضوء FUdR.

اللياقة البدنية 4. قياس السكان دودة على NGT-3D (الحضنة النسبي الحجم الفحص)

  1. اختيار مرحلة دودة L4 باستخدام سلك البلاتين اختيار ونقل على لوحة NGM خالية من البكتيريا. السماح للدودة أن تتحرك بحرية في جميع أنحاء لبضع دقائق لإزالة البكتيريا التي تعلق على الجسم.
  2. كرر الخطوة 4.1 وتأكد من أن دودة خالية من البكتيريا. عموما، وهما يكرر 4.1 كافية.
  3. وضع بعناية دودة نظيفة على سطح وسائل الإعلام 3D مع اختيار سلك البلاتين. الدودة يجب أن تدخل في نهاية المطاف أجار في آغار مصفوفة 3D.
  4. أغلق الغطاء السماح فضفاضة بعض الهواء للوصول الى الأنبوب، ولكن يمنع جفاف وسائل الإعلام أجار.
  5. احتضان لمدة 96 ساعة على 20 درجة مئوية.
  6. بعد 4 أيام، إغلاق الأغطية بإحكام ووضعغرفة الثقافة NGT-3D في حمام مئوية الماء 88 درجة لإذابة أجار. الحرارة تقتل الديدان ولكن لا تزال أجسادهم سليمة.
    ملاحظة: استخدام 8 مل أنابيب لNGT-3D، 20 - 30 دقيقة الحضانة عادة ما تكون كافية.
  7. باستخدام ماصة الزجاج، ونقل وسائل الإعلام المذابة على 9 سم طبق بتري البلاستيكية. لا ينصح الماصات البلاستيكية، كما يمكن الديدان في كثير من الأحيان الالتزام بها.
  8. عن طريق ناقل حركة ستيريو تشريح المجهر، والاعتماد على عدد الديدان في L3، L4، ومراحل الكبار. لا تعول الديدان التي هي مرحلة L2 والأصغر سنا، كما أجيال F1 و F2 يمكن الخلط هنا. وهكذا، هذا الاختبار هو نسبي حجم الحضنة فحص بدلا من مجموع فحص حجم الحضنة.

5. صورة وسجل دودة السلوك في NGB-3D

  1. اختيار مرحلة دودة L4 باستخدام سلك البلاتين اختيار وإزالة أي بكتيريا عالقة على السطح من خلال نقل إلى لوحة NGM خالية من البكتيريا والسماح لها بالتحرك بحرية لدقائق قليلة.
  2. كرر الخطوة 5.1 للتأكد من التعليم الجامعيجمهورية مقدونيا خالية من البكتيريا.
  3. وضع بعناية دودة نظيفة على مركز سطح أجار في NGB-3D بالقرب من عنق الزجاجة مع اختيار سلك البلاتين. الدودة يجب أن تدخل في نهاية المطاف أجار في آغار مصفوفة 3D.
  4. أغلق الغطاء السماح فضفاضة بعض الهواء للوصول الى الأنبوب، في حين منع جفاف وسائل الإعلام أجار.
  5. صورة أو تسجيل دودة تحت انتقال ستيريو تشريح المجهر. ضبط التركيز مع تحرك دودة من خلال مصفوفة 3D.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بناء NGT-3D هو بروتوكول بسيط ومباشر الذي ينتج في أنبوب اختبار مليئة أجار مع المستعمرات البكتيرية صغيرة متباعدة في جميع أنحاء أجار (الشكل 1A). يمكن الديدان تتحرك بحرية من خلال مصفوفة أجار، وإيجاد واستهلاك المستعمرات البكتيرية. لتأكيد ما إذا C. ايليجانس يمكن أن تتكاثر وتنمو عادة في NGT-3D، قارنا الخصوبة ونمو اليرقات في 3D مع لوحات 2D NGM القياسية. في النسبي حجم الحضنة فحص وتعليم الكبار C. ايليجانس المخنثين في NGT-3D...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت زراعة مختبر جيم ايليجانس باستخدام لوحات وسائط النمو الخيطية الكلاسيكية حاسمة لمئات من الاكتشافات الهامة من ان البحث في C. ايليجانس التي قدمها. هنا، فإننا نقدم طرق جديدة لزراعة C. ايليجانس في بيئة تعكس بشكل أكثر دقة الطبيعية موائلها ثلاثية الأبعاد. رغم أن هناك طرقا أخرى استخدمت لمراقبة C. ايليجانس في 3D 13، وهذا هو البروتوكول الأول الذي يسمح زراعة الديدان في مصفوفة 3D الصلبة. طريقتين هو موضح هنا، NGT-3D وNGB-3D، تسمح للعلماء لطرح ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل نيو باحث غرانت [2014R1A1A1005553] من مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني) إلى جيل. وزعيم المستقبل جامعة يونسي التحدي غرانت [2015-22-0133] إلى جيل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق LB ، ميلر (لوريا بيرتاني)Difco224620
كلوريد الصوديومDAEJUNG7548-440058.44 ميجاوات
أجار ، ديفكو محبب214530
ببتونباكتو211677
كلوريد الكالسيوم ، ثنائي هيدراتبيو بيسكCD00502 * H 2< / sub >O ؛ 147.02 ميجاوات
الكوليسترولبيو بيسكCD0122386.67 ميجاوات
كحول إيثيليB & JRP090-199.99٪ ؛ 46.07 ميجاوات
كبريتات المغنيسيوم ، اللامائيةالبيو الأساسيةMN1988120.37 ميجاوات
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة ، اللامائيبيو بيسكPB0445136.09 ميجاوات
2'-Deoxy-5-fluorouridineطوكيو للصناعة الكيميائيةD2235246.19 ميجاوات
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدة ، اللامائيبيو بياسيكPB0447174.18 ميجاوات
أنابيب اختبار متعددة الأغراضستوكويل ScientificST.85708 مل
إغلاق أنبوبالاختبار ستوكويل ScientificST.8575
قارورة ثقافة الخليةSPL Lifescience7012525 سم 2< / sup>
مجهر ستيريو نيكونSMZ18
رأس كاميرا ملونة عالية الوضوحنيكونDS-Fi2
وحدة التحكم المستندة إلى الكمبيوترالشخصي نيكونDS-U3
NIS-Elements البحوث الأساسية، برنامج التصوير المجهريMQS32000نيكون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans NGT 3D NGB 3D

مقالات ذات صلة