يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55060

⸱

أبريل 23, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكول لfunctionalize الزجاج مع بقع البروتين النانومترية تحيط بها طبقة ثنائية الدهن السائل. هذه ركائز متوافقة مع المجهر الضوئي المتقدمة، ومن المتوقع أن تكون بمثابة منصة للدراسات التصاق الخلايا والهجرة.

الملخص

حاليا هناك اهتماما كبيرا في خلق صفائف أمر من الجزر البروتين لاصقة في بحر من سطح تخميلها للدراسات البيولوجية الخلية. في السنوات الماضية، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الخلايا الحية تستجيب، وليس فقط لطبيعة البيوكيميائية من الجزيئات المقدمة لهم ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها عرض هذه الجزيئات. خلق البروتين أنماط الصغرى ولذلك المعيار الآن في العديد من المختبرات البيولوجية. متعدد الأنماط نانو هي أيضا أكثر سهولة. ومع ذلك، في سياق التفاعلات خلية خلية، هناك حاجة إلى نمط ليس فقط ولكن أيضا البروتينات طبقات ثنائية الدهون. وحتى الآن لم تكن هذه المزدوجة الزخرفة-PROTEO شحمي الوصول إليها بسهولة. نحن نقدم تقنية السطحية لخلق البروتين نانو النقاط معتمدة على الزجاج واقتراح طريقة لردم مساحة بين نقطة مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). من الصور تبييض التتبع الدهون الفلورسنت المدرجة في SLB، علينا أن نبرهن على طبقة ثنائية المعارض الكبيرة في وررسيولة انو. Functionalizing النقاط البروتين مع مجموعات الفلورسنت يسمح لنا صورة لها وتظهر أنها تنظم في شعرية سداسية منتظمة. النقطة حجم النموذجي هو حوالي 800 نانومتر، والتباعد تظاهر هنا هو 2 ميكرون. ويتوقع لهذه ركائز لخدمة منصات مفيدة لالتصاق الخلايا والهجرة والدراسات والميكانيكية الاستشعار عن بعد.

المقدمة

التصاق الخلايا تتم من خلال جزيئات متخصصة التصاق الخلية (الحدب)، البروتينات الموجودة على غشاء الخلية التي هي قادرة على الربط إلى نظيرتها في نسيج خارج الخلية أو على خلية أخرى. على خلايا الالتزام، ومعظم جزيئات الالتصاق بما في ذلك إنتغرين في كل مكان وكادهيرين، وتوجد في شكل مجموعات 1. تفاعل الخلايا الليمفاوية T (خلايا T) مع خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) يوفر التوضيح ولا سيما ضرب من أهمية مجموعات مستقبلات شكلت في واجهة بين خليتين - غالبا ما يسمى المشبك المناعي. على تشكيل أول اتصال مع مستقبلات الخلايا APC، T (TCRs) على سطح T شكل خلية ميكرون مجموعات على نطاق والتي تكون بمثابة إشارات منصات 2، 3، 4، ومركزية في نهاية المطاف إلى تشكيل أكبر كتلة supramolecular المركزية (cSMAC )معشوقة = "XREF"> 5، 6، 7. مؤخرا، تبين أن على الجانب APC، وتتركز في بروابط من TCR أيضا 8.

في سياق T خلية APC التفاعل، ونشر الأنظمة الهجينة، حيث حاكت APC قبل العشب الصناعي functionalized مع البروتينات ذات الصلة، وقد تقدمت كثيرا فهمنا واجهة متشابك 2، 3، 4، 5، 6، 7 . في هذا السياق، هو ذات أهمية كبيرة لتصميم APC السطوح المحاكاة التي تستحوذ واحد أو أكثر من جوانب الخلية المستهدفة. على سبيل المثال، إذا تم المطعمة بروابط على طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، فإنها يمكن أن تنتشر في الطائرة من طبقة ثنائية، تحاكي الوضع على سطح APC، وفي الوقت نفسه تسمح تشكيلcSMAC 6 و 7. وبالمثل، وقد حاكت مجموعات على APC من خلال خلق جزر بروابط في بحر من البوليمرات 9، 10، 11، 12، 13، 14. ومع ذلك، حتى الآن لم يتم الجمع بين هذه الميزات اثنين.

نحن هنا وصف تقنية الرواية لخلق نانو النقاط مكافحة CD3 (الأجسام المضادة التي تستهدف مجمع TCR) وتحيط بها طبقة ثنائية الدهون مع الدهون نشرها. وتودع طبقة ثنائية باستخدام انجمير-بلودجيت / انجمير-شايفر تقنية 7 و 15 و 16 و إذا رغبت في ذلك، يمكن functionalized مع بروتين معين - على سبيل المثال، يجند للخلية إنتغرين T (وتسمى ICAM1). وبالإضافة إلى ذلك، ومكافحة CD3 النقاط البروتين فصول التوجيه الجامعييتم استبدال دينار مع الأجسام المضادة أو CAM آخر. في حين أننا اخترنا البروتينات لاستخدامها في المستقبل كمنصة لT الدراسات التصاق الخلية، واستراتيجية مفصلة هنا يمكن تكييفها لأي البروتين، وحتى الحمض النووي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تنظيف الزجاج غطاء الشرائح وغرف المراقبة

  1. ترتيب الزجاج غطاء الشرائح على صينية متعدد الشرائح المصنوعة من مادة خاملة مثل تترافلوروإيثيلين (PTFE).
  2. تزج صينية مع الشرائح وغرفة المراقبة في حل السطحي (أي منتج الموصى بها لتنظيف cuvettes الكوارتز هو مناسبة).
  3. استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية، فائقة يصوتن في حل السطحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  4. شطف 5 مرات مع الماء عالى النقاء (18.2 MΩ.cm، 0.059 ميكرو ثانية / سم).
  5. فائقة يصوتن في حل السطحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  6. شطف 10 مرات مع الماء عالى النقاء.
  7. كرر الخطوات من 1.5 و 1.6 ضعف.
  8. متجر في الماء في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية) لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

2. تصنيع البروتين نانو النقاط

  1. ترسب من الخرز
    1. Deposiتي تعليق الخرز السيليكا (2٪ ت / ت، 70 ميكرولتر) قطرة قطرة على غطاء الشريحة (24 × 24 مم، سماكة 170 ميكرون) الذي عقد في الميل 15 درجة.
    2. السماح للتعليق تنتشر لحوالي 1 دقيقة في حين التقليب الزجاج بنسبة 90 درجة كل 15 ثانية.
    3. اترك السائل يتبخر في ظل الظروف المحيطة.
    4. مخزن في كوب نظيف أو غرفة PTFE في الظروف المحيطة لتصل إلى 2 أيام.
  2. ترسب الألومنيوم
    1. ضع الشرائح (المعد في القسم 2.1) داخل تردد الراديو (RF) المغناطيسية المعدات الاخرق 8، على طاولة الدورية على مسافة حوالي 105 ملم من الألومنيوم (99٪): السيليكون (1٪) الهدف.
    2. ضخ أسفل غرفة ترسب إلى 2.6 × 10 -4 باسكال باستخدام مضخة توربو الجزيئية. هذه الخطوة مهمة لإزالة الشوائب الغازية المحتملة.
    3. إدخال الأرجون الجو النقي (5N، 99.999٪) مع تدفق 10 SCCM عند ضغط 0.8 باسكال (6.6 mTorr).
      ملاحظة: يتم التحكم في تدفق الأرجون واردة من خلال وحدة تحكم تدفق الكتلة ويتم مراقبة ضغط العملية باستخدام مقياس الضغط. تدفق غاز الأرجون مستمر، ويتم التحكم من قبل التوازن بين مدخل ومخرج فتح الصمامات.
    4. التبديل على مولد للطاقة الترددات اللاسلكية.
      ملاحظة: هنا، تم استخدام مجموعة نموذجية من قوة الترددات الراديوية 400-600 W في 13.56 ميغاهرتز. يستخدم مولد RF مع شبكة مطابقة في وضع اقتران البلازما بالسعة. ويتم رصد قوة ينعكس والتقليل من استخدام التكيف الشبكة.
    5. بعد استقرار البلازما، وتفل لمدة 2 دقيقة الحفاظ على مصراع الكاميرا مغلقة لإزالة الشوائب التي يمكن تقديمها من السطح من الهدف.
    6. فتح مصراع والسماح للالاخرق أن يستمر لمدة 60 دقيقة لإيداع الألومنيوم على شريحة زجاجية لسمك من 200 نانومتر.
    7. قطع تدفق الأرجون، وإغلاق صمام بوابة لعزل مضخة turbomolecular من غرفة خلع وتنفيس الغرفة مع ن نظيفةitrogen للحصول على ضغط الغرفة. استرداد الشرائح الألمنيوم المغلفة. تخزين لمدة تصل الى شهر واحد في كوب أو PTFE مربع نظيفة ومغلقة بإحكام في ظل الظروف المحيطة.
  3. ترسيب البخار من Organosilane
    1. تزج الشريحة الألمنيوم المغلفة التي أعدت في الخطوة 2.2.6 في الماء عالى النقاء في درجة حرارة الغرفة وفائقة يصوتن لمدة 30 ثانية في حمام بالموجات فوق الصوتية (50 W، 50/60 هرتز، ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
    2. إيداع 0.5 مل من (3-أمينو) -triethoxysilane (APTES) في الجزء السفلي من مجفف.
      تنبيه: APTES هو organosilane، الذي يتبخر بسهولة وسامة. يجب التعامل مع APTES إلا في ظل تدفق غطاء محرك السيارة ومع القفازات.
    3. وضع الشرائح الزجاجية (المعد في 2.3.1) على شبكة السيراميك ومكان داخل مجفف.
    4. ربط مجفف للمضخة الغشاء وتشغيلها في الطاقة القصوى لمدة 30 دقيقة لتوليد فراغ منخفض.
    5. إغلاق صمام المجفف وإيقاف المضخة.
    6. حرارة المجففإلى حوالي 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. فتح مجفف وجمع الشرائح.
    8. نقل إلى مجفف نظيف آخر للتخزين لمدة تصل إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (20-30 درجة مئوية).
  4. ترسب الطبقة الأولى من البروتين - ألبومين المصل البقري المسمى مع البيوتين (BSA البيوتين)
    1. مكان واحد من الشرائح التي أعدت في القسم 2.3 على دعم PTFE.
    2. إيداع 1 مل من 25 ميكروغرام / مل BSA-البيوتين الذائبة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-30 درجة مئوية).
    3. شطف 10 مرات مع برنامج تلفزيوني. تخزين العينة لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية بعيدا عن مصدر الضوء.
  5. إزالة قناع الألومنيوم
    1. احتضان الشرائح في حل من هيدروكسيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني (بواسطة قطرة قطرة إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم على استعداد لحوالي 100 مل PBS الحصول pH≈12) خلال الليل في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
      الحذر. هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل، وينبغي أن يتم التعامل معها باستخدام القفازات.
    2. شطف10 مرات في الماء عالى النقاء.

3. ترسب الدهون المعتمدة طبقة ثنائية (SLB)

  1. تنظيف حوض انجمير
    1. إزالة الماء في العلبة PTFE من الحوض انجمير باستخدام مضخة.
    2. نظيفة مع منشفة القابل للتصرف غير المنسوجة خالية من الوبر غارقة في الكلوروفورم.
      الحذر. الكلوروفورم غير سامة ولا ينبغي التلاعب في منطقة جيدة التهوية، مع قناع (أو تحت التدفق هود) ومع القفازات المناسبة.
    3. نظيفة 4 مرات بالماء الفاتر عالى النقاء (40-50 درجة مئوية).
    4. نظيفة 6 مرات على الأقل مع الماء عالى النقاء البارد.
  2. ترسب طبقة الدهون الأولى
    1. وضع صواني PTFE في العلبة PTFE من الحوض انجمير ثم ملء مع الماء عالى النقاء.
    2. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الجهاز انجمير لضبط الضغط قياس 0 م ن / م.
    3. استخدام حقنة gastight الزجاج / المعادن لإيداع 30 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الدهون (12-dioleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DOPC) في الكلوروفورم) على سطح الماء. الكلوروفورم يتبخر وجزيئات الدهون تشكل بشكل عفوي أحادي الطبقة.
    4. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لضغط أحادي الطبقة الدهنية عن طريق إغلاق حاجز PTFE حتى الضغط المطلوب (27 م ن / م للDOPC) يتم التوصل إليه.
    5. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الى الانخفاض الشريحة الزجاجية التي أعدت في القسم 2.5.2 في العلبة PTFE باستخدام المشبك الآلية.
    6. عقد الشريحة، في المشبك، عمودي على واجهة بين الهواء والماء. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لرفعه ببطء (15 مم / دقيقة) من خلال واجهة، مع الحفاظ على ضغط ثابت في 27 م ن / م.
    7. مكان في بيئة جافة إما استخدام الفوري أو لتخزين ما يصل إلى 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  3. ترسب طبقة الدهون الثانية
    1. الحفاظ على الضغط السطحية في حوض انجمير في القيمة المطلوبة من 27 مليون / م. ضغط باستخدامبرنامج للتحكم في جهاز انجميور و / أو إضافة كمية صغيرة من الدهون لتحقيق الضغط المطلوب.
    2. وضع الشرائح الزجاجية تحمل أحادي الطبقة الدهنية، التي أعدت في القسم 3.2.6، أفقيا على سطح الماء. تأكد من أن كل شريحة يعوم فوق علبة PTFE.
    3. دفع الشرائح الزجاجية أسفل، شريحة واحدة في كل مرة، في علبة لها PTFE المقابلة باستخدام PTFE أو المعدن ملاقط بحيث أنها مغمورة في الماء. تجنب إمالة الشرائح في حين دفع.
    4. استخدام PTFE أو المعدن ملاقط لنقل صواني PTFE التي تحتوي على الشرائح في عرض عاء التبلور مليئة جعل الماء عالى النقاء من أن الشرائح لا تتعرض للهواء.
    5. استخدام PTFE أو المعدن ملاقط لنقل، في الوقت الذي تعمل تحت الماء، وطبقة ثنائية المغلفة شريحة زجاجية إلى غرفة المراقبة.
      ملاحظة: يتم وضع غرفة المراقبة تحت الماء داخل وعاء التبلور. هو العرف غرفة المراقبة ويتكون من حلقة PTFE مع والمطاط طوقاأغلفة الصلب د، والتي يمكن تجميعها تحت الماء لجعل غرفة ضيقة في المياه التي تتم من شريحة زجاجية مغلفة سابقا مع طبقة ثنائية المادة الدهنية السطح السفلي.
    6. إغلاق الغرفة مع الاستمرار في العمل تحت الماء وضمان أن حوالي 1 مل من الماء محاصرين داخل الغرفة.
    7. خذ غرفة تجميعها من الماء. تأكد من خلوه ضيق للماء والتسرب.
    8. استبدال 1 مل من الماء عالى النقاء موجودة في غرفة المراقبة مع برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات. تأكد من أن الغرفة هي أبدا خالية من السائل.
  4. SLB خطوة حجب
    1. إدخال 100 ميكروغرام / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) في غرفة المراقبة التي تحتوي على شريحة أعدت في القسم 3.3.6 واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
    2. شطف طبقة ثنائية عن طريق إزالة وإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات. طبقة ثنائية يمكن أن تبقى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

4. Functionalization مع الليجندات

  1. إضافة الفلورسنت أو neutravidin غير فلوري (NAV، نسخة deglycosylated من أفيدين لا تحمل في الرقم الهيدروجيني 7) في 2 ميكروغرام / مل في غرفة تحتوي على الشريحة التي أعدت في القسم 3.4.2 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة C).
  2. شطف طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات.
  3. إضافة المعقدة البيروكسيديز مكافحة CD3 في 2 ميكروغرام / مل إلى غرفة تحتوي على الشريحة التي أعدت في القسم 3.4.2. لfunctionalization المزدوج للSLB والنقاط، إضافة FC-ICAM1 صاحب العلامة في 5 ميكروغرام / مل (هنا، يرصد طبقة ثنائية من DOPC + 1٪ من حامض nitrilotriacetic (NTA) الدهون). تترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
  4. شطف طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10 مرات
  5. استبدال PBS مع المتوسط ​​خلية (PBS + 0.1٪ BSA) عن طريق إضافة وإزالة 500 ميكرولتر من المتوسطة خلية 10 مرات.
  6. ترك 200 ميكرولتر من المتوسطة خلية في chambeص مع الشريحة.
  7. مكان الغرفة لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C قبل أن يضيف الخلايا.

5. ترسب الخليوي (أنظر المرجع 7 لمزيد من التفاصيل)

  1. إيداع بعناية 400 ميكرولتر من تعليق خلية في الغرفة. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح الخلية مع 2٪ من امتصاص العرق (PFA) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استبدال PFA مع برنامج تلفزيوني عن طريق إزالة المتكررة وإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

6. مراقبة

  1. PROTEO-شحمي نانو نمط وSLB سيولة
    1. استخدام المجهر مضان لصورة نمط البروتين في وضع برنامج التحصين الموسع ومضان باستخدام الطول الموجي المناسب إضاءة (639 نانومتر) ومكعبات فلتر (على سبيل المثال هنا، EX TBP 483 + 564 + 642، BS TFT 506 + 582 + 659، EM TBP 526 + 601 +688).
      ملاحظة: شدة إشارة يمكن كميا لتقدير كمية البروتين داخل وخارج نقطة. استخدام الطول الموجي المناسب إضاءة (330 نانومتر) و fمكعب إلتر لصورة طبقة ثنائية (BP 365/12، FT 395، LP 397)، والذي يظهر مشرق مع الثقوب السوداء.
    2. استخدام المستمر الصورة تبيض (CPB) تقنية 13 و 15 لقياس ثابت نشر الدهون التتبع في طبقة ثنائية. يرصد هذه الملاحظة ويفضل بعد ترسب SLB.
      ملاحظة: من أجل تحديد ثابت الانتشار، يتم قياس معلمتين أثناء عملية CPB: الوقت تبيض معين من الصبغة (مشدود) وطول اضمحلال الشخصية الفلورسنت من الهالة تشكلت حول منطقة المبيض (tauD). يتم الحصول على أول مرة من قبل المتهم بالتآمر في تطور الزمن من شدة مضان في وسط الميدان مضيئة أثناء عملية CPB. يتم الحصول على المركز الثاني قبل المتهم بالتآمر في ملف كثافة على حافة منطقة مضيئة (المتوسط ​​أكثر من 12 خطوط و5 صور بعد التوصل ثابتة للدولة). تم تجهيز منحنيات للحصول مشدود وtauD. الثابت يعطى نشر التي كتبها taUD 2 / مشدود (D = figure-protocol-1 ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم تحليل الصور مضان لقياس المسافات وحجم النقاط. تم العثور على تباعد نموذجي ليكون 1900 ± 80 نانومتر، ونموذجي نقطة بحجم كان 600 ± 100 نانومتر (الشكل 1G). تم تعيين تباعد حسب حجم حبات تستخدم لقناع. يتم تعيين حجم نقطة من حجم حبة فضلا عن ظروف الترسيب. وتودع SLB فريد حول النقاط البروتين وليس عليهم (الشكل 2)، مع التكامل المثالي بين الثقوب ينظر في قناة التصوير SLB والنقاط ينظر في القناة NAV التصوير. تحليل البيانات المست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المذكورة أعلاه إلى تشكيل البروتين نانو النقاط أو العودة ملء الفضاء حول النقاط التي كتبها طبقة ثنائية الدهون المعتمدة. الخطوة الأولى الحاسمة فيما يتعلق البروتين نانو النقاط هي إعداد حبة قناع. تنظيف غطاء الشريحة أمر بالغ الأهمية. ويجب تنظيف إما بمحلول منظف أن ينصح لتنظيف cuvettes الكوارتز، أو مع البلازما الأكسجين الشرائح. تقنيات التنظيف الأخرى مثل الغمر في الإيثانول أو المعاملة ايزو بروبانول لا تجعل الزجاج محبة للماء بما فيه الكفاية، وبالتالي لا تد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر لوران Limozin، بيير ديلارد واستريد فاهل لمواصلة مناقشات مثمرة حول التطبيقات الخلوية. كما نشكر فريدريك البدو من مرفق غرف الأبحاث PLANETE لمساعدته مع الملاحظات SEM. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس البحوث الأوروبي عبر منحة رقم 307104 FP / 2007-2013 / ERC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغطية زجاجيةمساعدة, Karl Hecht KG 
غرفة المراقبةمحلية
الصنع قلوية خافضة للتوتر السطحي مركز (Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
Ultra-sonicatorThermoFisher
DesiccatorLabbox
Crystallizer  شوت
نيوترافيدينثيرمو فيشر ساينتيف84607
PBS سيجما ألدريتشP3813
المياه MQ ELGA ، Veolia France
حبات السيليكاCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-BiotinSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Dansyl-PEAvanti Polar Lipids810330C
الكلوروفورمSigma-aldrich650471
حقنة Gastighte دومينيك داستشر ، فرنسا74453
فيلم التوازنNIMAالمجهر المتوسط
زايس ، ألمانيانظام
الألومنيوم المستهدف   ؛كورت J. Lesker Compagny, الولايات المتحدة الأمريكية
تردد الراديو Magnetron الاخرق Systè me أداة SMC 600 المعدلة بواسطة ALCATEL ، فرنسا
TIRF-III

المراجع

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398(2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عناقيد البروتين النانويةمصفوفات الربيطةتقنية قناع الخرزترسيب الألمنيومالوظيفية بـ APTESطلاء BSA-Biotinمجهر TIRFمجهر RICMسيولة الطبقة اللبيدية المزدوجة
صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.