نقدم بروتوكول لfunctionalize الزجاج مع بقع البروتين النانومترية تحيط بها طبقة ثنائية الدهن السائل. هذه ركائز متوافقة مع المجهر الضوئي المتقدمة، ومن المتوقع أن تكون بمثابة منصة للدراسات التصاق الخلايا والهجرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حاليا هناك اهتماما كبيرا في خلق صفائف أمر من الجزر البروتين لاصقة في بحر من سطح تخميلها للدراسات البيولوجية الخلية. في السنوات الماضية، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الخلايا الحية تستجيب، وليس فقط لطبيعة البيوكيميائية من الجزيئات المقدمة لهم ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها عرض هذه الجزيئات. خلق البروتين أنماط الصغرى ولذلك المعيار الآن في العديد من المختبرات البيولوجية. متعدد الأنماط نانو هي أيضا أكثر سهولة. ومع ذلك، في سياق التفاعلات خلية خلية، هناك حاجة إلى نمط ليس فقط ولكن أيضا البروتينات طبقات ثنائية الدهون. وحتى الآن لم تكن هذه المزدوجة الزخرفة-PROTEO شحمي الوصول إليها بسهولة. نحن نقدم تقنية السطحية لخلق البروتين نانو النقاط معتمدة على الزجاج واقتراح طريقة لردم مساحة بين نقطة مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). من الصور تبييض التتبع الدهون الفلورسنت المدرجة في SLB، علينا أن نبرهن على طبقة ثنائية المعارض الكبيرة في وررسيولة انو. Functionalizing النقاط البروتين مع مجموعات الفلورسنت يسمح لنا صورة لها وتظهر أنها تنظم في شعرية سداسية منتظمة. النقطة حجم النموذجي هو حوالي 800 نانومتر، والتباعد تظاهر هنا هو 2 ميكرون. ويتوقع لهذه ركائز لخدمة منصات مفيدة لالتصاق الخلايا والهجرة والدراسات والميكانيكية الاستشعار عن بعد.
المقدمة
التصاق الخلايا تتم من خلال جزيئات متخصصة التصاق الخلية (الحدب)، البروتينات الموجودة على غشاء الخلية التي هي قادرة على الربط إلى نظيرتها في نسيج خارج الخلية أو على خلية أخرى. على خلايا الالتزام، ومعظم جزيئات الالتصاق بما في ذلك إنتغرين في كل مكان وكادهيرين، وتوجد في شكل مجموعات 1. تفاعل الخلايا الليمفاوية T (خلايا T) مع خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) يوفر التوضيح ولا سيما ضرب من أهمية مجموعات مستقبلات شكلت في واجهة بين خليتين - غالبا ما يسمى المشبك المناعي. على تشكيل أول اتصال مع مستقبلات الخلايا APC، T (TCRs) على سطح T شكل خلية ميكرون مجموعات على نطاق والتي تكون بمثابة إشارات منصات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تنظيف الزجاج غطاء الشرائح وغرف المراقبة
- ترتيب الزجاج غطاء الشرائح على صينية متعدد الشرائح المصنوعة من مادة خاملة مثل تترافلوروإيثيلين (PTFE).
- تزج صينية مع الشرائح وغرفة المراقبة في حل السطحي (أي منتج الموصى بها لتنظيف cuvettes الكوارتز هو مناسبة).
- استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية، فائقة يصوتن في حل السطحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ما بين 20 و 30 درجة مئوية).
- شطف 5 مرات مع الماء....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم تحليل الصور مضان لقياس المسافات وحجم النقاط. تم العثور على تباعد نموذجي ليكون 1900 ± 80 نانومتر، ونموذجي نقطة بحجم كان 600 ± 100 نانومتر (الشكل 1G). تم تعيين تباعد حسب حجم حبات تستخدم لقناع. يتم تعيين حجم نقطة من حجم حبة فضلا عن ظروف الترسيب. وتودع SLB فريد حول النقاط البروتين وليس عليهم (الشكل 2)، مع التكامل المثالي بين الثقوب ينظر في قناة التصوير SLB والنقاط ينظر في القناة NAV التصوير. تحليل البيانات المست.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المذكورة أعلاه إلى تشكيل البروتين نانو النقاط أو العودة ملء الفضاء حول النقاط التي كتبها طبقة ثنائية الدهون المعتمدة. الخطوة الأولى الحاسمة فيما يتعلق البروتين نانو النقاط هي إعداد حبة قناع. تنظيف غطاء الشريحة أمر بالغ الأهمية. ويجب تنظيف إما بمحلول منظف أن ينصح لتنظيف cuvettes الكوارتز، أو مع البلازما الأكسجين الشرائح. تقنيات التنظيف الأخرى مثل الغمر في الإيثانول أو المعاملة ايزو بروبانول لا تجعل الزجاج محبة للماء بما فيه الكفاية، وبالتالي لا تد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر لوران Limozin، بيير ديلارد واستريد فاهل لمواصلة مناقشات مثمرة حول التطبيقات الخلوية. كما نشكر فريدريك البدو من مرفق غرف الأبحاث PLANETE لمساعدته مع الملاحظات SEM. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس البحوث الأوروبي عبر منحة رقم 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أغطية زجاجية | مساعدة, Karl Hecht KG | ||
| غرفة المراقبة | محلية | ||
| الصنع قلوية خافضة للتوتر السطحي مركز (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | شوت | ||
| نيوترافيدين | ثيرمو فيشر ساينتيف | 84607 | |
| PBS | سيجما ألدريتش | P3813 | |
| المياه MQ | ELGA ، Veolia France | ||
| حبات السيليكا | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| الكلوروفورم | Sigma-aldrich | 650471 | |
| حقنة Gastighte | دومينيك داستشر ، فرنسا | 74453 | |
| فيلم التوازن | NIMA | المجهر المتوسط | |
| زايس ، ألمانيا | نظام | ||
| الألومنيوم المستهدف ؛ | كورت J. Lesker Compagny, الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| تردد الراديو Magnetron الاخرق Systè me | أداة SMC 600 المعدلة بواسطة ALCATEL ، فرنسا |
المراجع
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminate....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
