مقالة منهجية

تحليل مفيد آثار المكملات الغذائية على وظائف الأمعاء طلائي الحاجز أثناء التجريبية التهاب القولون

DOI:

10.3791/55095

⸱

يناير 5, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاجات الحالية للأمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) تهدف إلى التخفيف من حدة أعراض المرض ولكن قد تتسبب في آثار جانبية خطيرة. وهكذا، ويجري التحقيق في استراتيجيات بديلة في نماذج التهاب القولون الحيوانية. هنا، نحن شرح كيفية تحليل الآثار المفيدة للملاحق النظام الغذائي على علامات مرض التهاب الأمعاء السريرية في مثل هذا النموذج التهاب القولون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمراض الالتهابية الأمعاء (IBD)، بما في ذلك مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، واضطرابات الانتكاس المزمنة للأمعاء. أنها تسبب مشاكل خطيرة، مثل تقلصات في البطن، والإسهال الدموي، وفقدان الوزن، في الأفراد المتضررين. للأسف، لا يوجد علاج حتى الآن، والعلاجات تهدف فقط لتخفيف الأعراض. وتشمل العلاجات الحالية العقاقير المضادة للالتهابات والمثبطة للمناعة التي قد تتسبب في آثار جانبية خطيرة. هذا يستدعي البحث عن خيارات العلاج البديلة، مثل المكملات الغذائية، التي لا تتسبب في آثار جانبية. قبل تطبيقها في الدراسات السريرية، مثل هذه المركبات يجب أن تكون اختبارات صارمة للفعالية والأمن في النماذج الحيوانية. نموذج تجريبي يمكن الاعتماد عليها هو النموذج التهاب القولون ديكستران سلفات الصوديوم (DSS) في الفئران، الذي يستنسخ العديد من العلامات السريرية لالتهاب القولون التقرحي في البشر. طبقنا مؤخرا هذا النموذج لاختبار الآثار المفيدة من المكملات الغذائية التي تحتوي علىالفيتامينات C و E، L-أرجينين، والأحماض الدهنية غير المشبعة ω3 (بوفا). قمنا بتحليل المعلمات أمراض مختلفة، ووجدت أن هذا الملحق كان قادرا على تحسين تشكيل ذمة، وتلف الأنسجة، وتسلل الكريات البيض، والإجهاد التأكسدي، وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات، مما يؤدي إلى حدوث تحسن عام في مؤشر نشاط المرض. في هذه المقالة، نحن يشرح بالتفصيل التطبيق الصحيح للالمكملات الغذائية باستخدام نموذج التهاب القولون مفاجآت صيف دبي في C57BL / 6 الفئران، وكذلك كيف يتم تقييم المعلمات المرض مثل الأنسجة، الاكسدة، والالتهابات. تحليل الآثار المفيدة للحمية مختلفة المكملات قد ثم في نهاية المطاف فتح آفاقا جديدة لتطوير استراتيجيات علاجية بديلة تخفف من أعراض مرض التهاب الأمعاء و / أو التي تطيل مراحل مغفرة من دون التسبب في آثار جانبية خطيرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التهاب القولون هو حالة التهاب القولون التي يمكن أن تسبب الإسهال وآلام في البطن. التهاب القولون يمكن أن تكون حادة، وذلك استجابة للإصابة أو الإجهاد، أو أنها يمكن أن تتطور كمرض مزمن، مثل التهاب القولون التقرحي (UC)، الذي ينتمي إلى مجموعة من امراض التهابات الامعاء (IBD). على الرغم من أن علامات سريرية من جامعة كاليفورنيا قد تم وصفها بشكل جيد، والتسبب لا تزال غير مفهومة 1. ومن المتفق عليه بين الخبراء أن UC هو مرض متعدد العوامل، مع الطفرات الوراثية والاستجابات المناعية الشاذة لعب دورا رئيسيا 2. ومع ذلك، والعوامل البيئية، مثل أسلوب المعيشة والتغذية، وتسهم أيضا في تطور المرض وتقدم 3.

للأسف، IBD لا يمكن الشفاء منه، ولكن هناك العديد من خيارات العلاج التي تهدف إلى تخفيف الأعراض السريرية. وتشمل العلاجات الحالية العقاقير المضادة للالتهابات، مثل sulfasalazine ووالستيروئيدات القشرية. مناعة، مثل azathioprine. الاجسام المضادة التي التقاط الموالية للالتهابات السيتوكينات، مثل عامل نخر الورم α (TNF-α)، أو كتلة جزيئات الالتصاق، مثل integrins، للحد من تجنيد الكريات البيض المفرط. ومثبطات التي تستهدف تحركات التي تؤدي مسارات الموالية للالتهابات، مثل يانوس كيناز (JAK) 4. ليس كل المرضى يستجيبون لجميع العلاجات، لذلك يجب أن تكون فردية الاستراتيجيات العلاجية 5. وعلاوة على ذلك، فإن معظم هذه الأدوية العلاجية تتداخل مع عملية التمثيل الغذائي والاستجابات المناعية، وغالبا ما تسبب آثار جانبية خطيرة. لهذا السبب، وقد تم التحقيق في خيارات العلاج البديلة.

وتشمل العلاجات البديلة البروبيوتيك والمكملات الغذائية، التي تم تطبيقها في النماذج الحيوانية والتجارب السريرية مع مستويات متفاوتة من النجاح 6،7. لقد وجدنا مؤخرا أن تطبيق مختلف المكملات الغذائية واحدة، مثل الفيتامينات المضادة للأكسدة والأحماض الدهنية ω3 بولي غير المشبعة (PUFAS)، هو أقل شأنا من تطبيق مزيج من هذه الملاحق في تخفيف التهاب القولون وأعراض مرض القلب والأوعية الدموية 8،9. وقد أجريت هذه الدراسات على الفئران، لذلك يجب إجراء دراسات سريرية على البشر لتحديد ما إذا كانت هذه النتائج ستكون ينطبق أيضا على البشر. قبل البدء الدراسات السريرية، يجب تقييم فعالية وسلامة خيارات العلاج الجديدة في النماذج الحيوانية.

لIBD، وقد استخدم (DSS) نموذج ديكستران كبريتات الصوديوم على نطاق واسع لدراسة آليات تطور المرض والآثار المفيدة للعقاقير والمكملات الغذائية 6،10. في معظم الدراسات، إلا مرض حاد على مدى فترة زمنية من هو فعل سبعة أيام. ومع ذلك، فإن العلامات السريرية التي لوحظت في هذه الحيوانات تشبه تلك التي لوحظت في مرضى التهاب الامعاء (أي الإسهال الدموي، وفقدان الوزن، وضعف الظهارية، وتسلل الخلايا المناعية) 10. مفاجآت صيف دبي يدفع تقرحات في الغشاء المخاطي،مما أدى إلى خلل الحاجز وفي زيادة نفاذية الظهارية في الأمعاء 11. لا تزال الآلية الدقيقة غير معروفة. ومع ذلك، تشير الدراسة إلى أن مفاجآت صيف دبي يتفاعل مع الأحماض المتوسطة سلسلة طول الدهنية لتشكيل نانو lipocomplexes التي تكون قادرة على دخول الخلايا الظهارية وللحث على إشارات التهاب الممرات 12. في هذه المقالة، نحن تصف بالتفصيل كيف هو فعل والتهاب القولون تحليلها في الفئران، كيف المكملات الغذائية يتم تطبيقها بواسطة أنبوب تغذية لضمان جرعة ثابتة في كل حيوان، وكيف يتم فحص آثار مثل هذه المكملات على مختلف أعراض التهاب القولون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية Cinvestav.

1. إعداد مفاجآت صيف دبي مياه الشرب وتحريض من التهاب القولون

  1. إعداد 3.5٪ ث / ت ديكستران سلفات الصوديوم (DSS) حل في مياه الشرب تعقيمها. مفاجآت صيف دبي يذوب بسهولة وليس مطلوبا لتصفية الحل النهائي.
    ملاحظة: 7 أيام من العلاج مفاجآت صيف دبي تحرض التهاب القولون الحاد. إذا حمل التهاب القولون معتدل، 3 - ينصح 4 أيام من العلاج. طالما أن مياه الشرب مفاجآت صيف دبي يبقى واضحا، فإنه ليس من الضروري تغيير الماء. ومع ذلك، إذا تبين عكر، فإنه يجب أن يتم استبداله.
  2. تسجيل الوزن الأساسي من ذكور الفئران. تأكد من أنها 8-12 أسابيع من العمر، وضمن مجموعة من 21 - 25 جرام من وزن الجسم.
    ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل للتركيز مفاجآت صيف دبي المناسب في كل مختبر. النتائج يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا، وهذا يتوقف على ظروف السكن. وذكرت 5٪ عادة للحث ج قوية - تركيزات بين 2.5olitis في الفئران C57BL / 6J WT 10. مفاجآت صيف دبي من شركات مختلفة، والكثير مختلفة ينبغي اختبار، والنتائج قد تختلف أيضا مع مصادر مختلفة من مفاجآت صيف دبي.
  3. توفير المياه libitum الإعلانية واستبدالها بالماء مفاجآت صيف دبي الطازجة 3.5٪ إذا لزم الأمر.

2. تطبيق المكملات الغذائية بواسطة التغذية الأنبوبية

  1. يعد حل "feedable" من المكملات الغذائية المطلوبة في مذيب مناسب. لهذه الدراسة، كنا مزيج يحتوي على 200 ملغ / كغ L-أرجينين، 83 ملغم / كغم من فيتامين C، 46 ملغم / كغم من فيتامين E، و 77 ملغ / كغ ايكوسابنتانويك حمض (EPA)، و 115 ملغم / كغم الدوكوساهيكسانويك حامض (DHA ) في 1: الحل 1 من النفط المياه والقرطم.
  2. ملء حقنة 1 مل متصلة إبرة أنبوب تغذية (15 G × 50 ملم) مع خليط المكملات الغذائية. مسح السطح الخارجي للإبرة أنبوب تغذية لإزالة أي مركب خارج الإبرة وضمان تطبيق الجرعة المناسبة.
  3. كبح الماوس عن طريق استيعاب قاعدة الذيل معيد واحدة والتي تجتاح بحزم أضعاف الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة مع الإبهام والسبابة من جهة أخرى. وضع الذيل بين الاصبع الثالث وقاعدة الإبهام من نفس اليد التي تحمل الرقبة.
  4. مع الحفاظ على الماوس في وضع مستقيم، أدخل الإبرة في الجانب الأيسر من فم الحيوان واتبع بعناية سقف الفم لتحديد موقع المريء. إذا واجهت أي مقاومة، ودفع الإبرة نحو المعدة.
    ملاحظة: تحقق من أن هذا الحيوان يتنفس بشكل صحيح قبل المتابعة.
  5. إدارة الخليط ببطء، وإزالة أنبوب عن طريق سحب ببطء من الحقنة، والافراج عن الماوس. تطبيق المكملات الغذائية مرة واحدة يوميا بواسطة التغذية الأنبوبية خلال التجربة التهاب القولون.

3. تحديد مؤشر آخر على الأمراض

ملاحظة: مؤشر نشاط المرض هو مزيج من عشرات لفقدان الوزن، ونزيف حول الشرج، وقوام البراز، والتي هي اوبtained يوميا 13.

  1. قياس وزن الجسم يوميا وتعيين بنتيجة 0-4 وفقا لنسبة فقدان الوزن (0: 0٪، 1: 1-5٪، 2: 5-10٪، 3: 10 - 20٪، و 4:> 20 ٪).
    يتم تحديد وزن الجسم الخسارة عن طريق حساب الفرق في المئة بين الوزن القاعدية قبل تحريض DSS-التهاب القولون والوزن الفعلي: ملاحظة.
  2. لتحديد مستوى من نزيف حول الشرج، وجمع عينة البراز الطازجة واستخدام أدوات تطبيقها المقدمة للتطبيق مسحة رقيقة على شريحة من البراز طقم اختبار الدم الخفي غاياك. استخدام قضيب جديدة لكل عينة.
    1. إغلاق غطاء على الجبهة وفتح نافذة على الجزء الخلفي من الشريحة. تطبيق قطرتين من الحل المطور إلى الوراء في موقع العينة.
    2. قراءة النتائج بعد 30 ثانية. أي أثر للون الأزرق هو إيجابي للدم غامض. تعيين بنتيجة 0-4 (0: لا شيء، 0،5-2،5: غاياك إيجابي البراز فحص الدم الخفي (وهذا يتوقف على قوة الإشارة)، و3-4: اللائحة العامة للمنظمةSS النزيف).
      ملاحظة: إذا كان الدم في البراز واضح، لم يكن البراز فحص الدم الخفي غاياك التي يتعين القيام بها، وعلى درجة من 3، 3.5، أو يتم تعيين 4، اعتمادا على كمية من الدم وضوحا.
  3. تحديد البراز الاتساق من خلال مراقبة عينة البراز الطازج. تعيين بنتيجة 0-4 (0: عادي / الصلبة، 0،5-2،5: البراز فطيرة، و3-4: الإسهال).

4. تحديد المعوية طلائي النفاذية في فيفو من إيفانس الأزرق الفحص

  1. تخدير الحيوانات عن طريق حقنها داخل الصفاق مع خليط من الكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم) وزيلازين (13 ملغ / كغ من وزن الجسم) المخفف في محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)، وتقييم عمق التخدير عن طريق رصد قرصة الانسحاب لا ارادي.
  2. وضع الحيوانات تخدير في موقف ضعيف وإجراء عملية فتح البطن لفضح الأمعاء.
  3. تحديد الأعور وجعل شق صغير في الجزء الأقرب من القولون لscendens (من الناحية المثالية، متاخم لالأعور).
  4. اضافة الى وجود إبرة التغذية (G22) وضمان الحصول عليها مع ربطة باستخدام خيط الحرير المشترك. بعناية تدفق وفيرة برنامج تلفزيوني من خلال أنبوب لشطف من كل البراز من القولون. غرس ايفانز حل الأزرق (1.5٪ ث / ت في برنامج تلفزيوني) في القولون حتى تصل إلى فتحة الشرج.
  5. احتضان الأزرق ايفانز لمدة 15 دقيقة. تغسل الصبغة عن طريق تنظيف الأنبوب مع وفرة في برنامج تلفزيوني حتى تبييض حول الشرج واضح.
  6. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم.
  7. استئصال القولون وشطفه مرة أخرى مع وفرة في برنامج تلفزيوني. شطف مرة واحدة مع 1 مل من 6 ملي N -acetylcysteine في برنامج تلفزيوني للقضاء على أي صبغة التمسك المخاط القولون.
  8. قطع القولون طوليا وشطفه مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني و 1 مل من 6 ملي N -acetylcysteine.
  9. تسجيل الوزن والطول. لاستخراج ايفانز صبغة زرقاء، ضع القولون في 2 مل من N، N -dimethylformamide بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع agitatio لطيفن. قياس تركيز الصبغة طيفيا في 610 نانومتر.

مجموعة 5. النسيج

  1. تخدير الحيوانات عن طريق حقنها داخل الصفاق مع خليط من الكيتامين (100 ملغم / كغم من وزن الجسم) وزيلازين (13 ملغ / كغ من وزن الجسم) المخفف في محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)، وتقييم عمق التخدير عن طريق رصد قرصة الانسحاب لا ارادي.
  2. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم.
  3. وضع الحيوانات في موقف ضعيف وإجراء عملية فتح البطن لفضح تجويف البطن.
  4. باستخدام مقص، تشريح القولون بأكمله وتسجيل طوله.
  5. تدفق القولون عدة مرات مع بعناية المبردة PBS لإزالة البراز. سجل وزن الأنسجة والتحضير للالتجارب التالية، كما هو موضح في الخطوات 5،6-5،8.
  6. لعزل الحمض النووي الريبي والميلوبيروكسيديز المقايسات (MPO)، وقطع عينة الأنسجة بشكل مناسب الحجم (100 ملغ وعادة ما يكفي)، وضعه داخل أنبوب، ونظام الحسابات القوميةف تجميده في النيتروجين السائل. تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  7. لتلطيخ المناعي وتقرير الاكسدة (أنظر أدناه)، وقطع القولون عينة صغيرة (0،5-1 سم) وsubmerse في أكواب صغيرة من الألومنيوم مليئة الأمثل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب. وضع أكواب على الثلج الجاف والسماح لهم تجميد ببطء، لتجنب تشكيل فقاعة. عينات الأنسجة المجمدة يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  8. لفات السويسري 14، فتح القولون طوليا وإزالة بعناية البراز باستخدام ملقط. لفة منه، مع الغشاء المخاطي تواجه الداخل، وذلك باستخدام ملقط غرامة الرؤوس أو رقيقة، عصا خشبية مستديرة. وضع بعناية داخل الكاسيت تضمين وتابع الخطوة 6.1.
    ملاحظة: مفاجآت صيف دبي يدفع الضرر في القولون. ومع ذلك، توزيع الضرر يختلف من الأقرب إلى القولون البعيدة، مع معظم الضرر عادة ما ينظر إليها في القولون القاصي والمستقيم. وبالتالي، فإننا نوصي تحليل الأنسجة إما في عمود القاصيأو في الأدوار السويسرية القولون بأكمله.

6. تحليل الأنسجة القولون عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين

  1. تحضير الأنسجة
    1. للتحليل النسيجي، غمر إما لفات السويسرية أو قطع صغيرة من أنسجة القولون بعض المناطق من سيطرة والفئران التي عولجت في 5 مل من 10٪ الفورمالديهايد لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتحقيق التثبيت الصحيح.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات أخرى في الخطوة 6 من في RT، ما لم ينص على خلاف ذلك.
    2. غسلها بماء الصنبور لمدة 18 ساعة.
    3. يذوى لهم 15 مل من الايثانول 70٪ لمدة 1 ساعة، 96٪ لمدة 1 ساعة، والايثانول المطلق لمدة 1 ساعة. كرر كل خطوة مع الكحول النقي قبل الشروع في تركيز المقبل.
    4. استمرار الجفاف في خليط من 7.5 مل من الايثانول المطلق و 7.5 مل من زيلين المطلق لمدة 1 ساعة. أكرر مرة واحدة قبل تمرير عينات إلى 15 مل من زيلين المطلق لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع زيلين جديدة.
    5. تضمين عينات الأنسجة القولون في البارافين
      1. تزج العينات في 50 مل من البارافين السائل لمدة 17 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة ولكن لح 3 فقط.
      2. تزج العينات في مكعبات (البلاستيك، قالب مربع، حجم: 22 × 22 × 22 ملم) في 810 مل من البارافين السائل.
      3. السماح للالبارافين مع عينات الأنسجة القولون ليصلب لمدة 24 ساعة عند RT.
    6. قطع الأنسجة عبر أقسام باستخدام مشراح
      1. قطع عينات القولون باستخدام مبضع للفحص المجهري، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، في سمك من 5 ميكرون.
      2. جمع التخفيضات في حمام مائي (1 لتر) يحتوي على 0.3٪ الجيلاتين. وهذا ما يمنع للطي من الأنسجة عبر أقسام. استرداد أقسام الأنسجة وجبل لهم على الشرائح الزجاجية.
    7. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ من الأنسجة للصليب المقاطع
      1. Deparaffinize العينات لمدة 18 ساعة عند 60 درجة مئوية في حاضنة. لهذا الغرض، واستخدام الصورة الزجاجLIDE الرف مع مقبض.
      2. بعد deparaffinization، تزج الشرائح في 70 مل من زيلين المطلق لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع زيلين جديدة.
      3. نقل العينات إلى 70 مل من الكحول المطلق لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الكحول النقي.
      4. احتضان عينات الأنسجة القولون في 70 مل من الايثانول 96٪ لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الكحول النقي.
      5. غسل العينات في مياه الحنفية مرتين لمدة 2 ق.
      6. احتضان الأنسجة في هاريس الهيماتوكسيلين لمدة 7 دقائق.
      7. غسل العينات في مياه الحنفية مرتين لمدة 2 ق.
      8. احتضان هذه العينات في الكحول الحمضية (70 مل من الايثانول 70٪ و 700 ميكرولتر من 1 M حمض الهيدروكلوريك) لمدة 7 ق.
      9. غسل العينات في مياه الحنفية مرتين لمدة 2 ق.
      10. احتضان عينات الأنسجة في 70 مل من كربونات الليثيوم (1 غرام من كربونات الليثيوم في 100 مل من الماء المقطرة) لمدة 7 ق.
      11. غسل العينات في مياه الحنفية مرتين لمدة 2 ق.
      12. احتضان العينات في 70 مل من الايثانول 80٪ لمدة 1 دقيقة.
      13. نقل العينات إلى 70 مل من يوزين-Y لمدة 15 ثانية.
      14. احتضان لهم في 70 مل من 96٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الكحول النقي.
      15. احتضان عينات الأنسجة في 70 مل من الايثانول المطلق (الكحول الإيثيلي اللامائية المطلق) لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الكحول النقي.
      16. احتضان العينات في 70 مل من خليط من 35 مل من الكحول المطلق و 35 مل من زيلين المطلق لمدة 1 دقيقة.
      17. نقل العينات إلى 70 مل من زيلين المطلق لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة لمدة 5 دقائق في 70 مل من زيلين المطلق الطازجة.
      18. إضافة 80 ميكرولتر من الراتنجات الاصطناعية للعينات الأنسجة القولون، وغطاء لهم coverslips، والسماح لهم الجافة لمدة 24 ساعة عند RT. وأخيرا، وتحليل العينات باستخدام المجهر مشرق الميدان 8.

    7. تحليل مفرق التركيب التي كتبها المناعي

    1. تحضير الأنسجة كما هو موضح في الخطوة 5.7 و قطع 8 ميكرون سميكة المقاطع العرضيةباستخدام ناظم البرد.
    2. إصلاح وpermeabilize القولون عبر المقاطع مع 96٪ من الإيثانول في -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يتولى جميع حضانات اللاحقة بها في RT، ما لم ينص على خلاف ذلك، في مربع مظلم رطب لمنع جفاف وتألقي يتلاشى.
    3. عينات من الهواء الجافة، ثم شطف لهم 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 1X
    4. احتضان هذه العينات مع عرقلة الحل (PBS تحتوي على 0.01٪ توين و 2٪ BSA) لمدة 2 ساعة.
    5. إزالة عرقلة الحل وشطفه مع برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين لمدة 10 دقيقة.
    6. خلال هذا الوقت، وتمييع الأجسام المضادة الأولية لتركيزات المطلوب في برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين.
    7. إزالة حل الغسيل، وتطبيق حل الضد من الخطوة السابقة، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في مربع مرطب.
    8. إزالة حل الأجسام المضادة ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين لمدة 5 دقائق كل ومرة ​​واحدة مع الماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقيقة، مع الإثارة لطيف جدا.
    9. أثناء الغسيل، الطرد المركزي فلورochromeconjugated، أنواع محددة الأجسام المضادة الثانوية في 14000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    10. تمييع الأجسام المضادة الثانوية دون رواسب كما هو مبين من قبل مقدم في برنامج تلفزيوني، 0.01٪ توين، تطبيقها، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    11. كرر الخطوة 7.8 وإزالة حل غسل تماما بقدر الإمكان.
    12. ماصة 4 ميكرولتر من مكافحة يتلاشى وكيل على كل عينة على الشريحة.
    13. تغطية العينات مع ساترة.
    14. الهواء الجاف لمدة 1 ساعة.
    15. شريحة ختم بطلاء الأظافر. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
    16. تحليل على المجهر ليزر متحد البؤر 8.

    8. تحديد الإجهاد التأكسدي بواسطة الأكسدة من إيثيديوم

    1. بعد 7 أيام من مفاجآت صيف دبي التهاب القولون، وإعداد الأنسجة كما هو موضح في الخطوة 5.7 وخفض أقسام القولون في ناظم البرد في سمك من 5 ميكرون. جبل الصليب المقاطع على الشرائح الزجاجية تعامل مع حل يسين بولي-L-واحتضان عينات خفة دمح 5 ميكرومتر من dihydroethidium (DHE) في الماء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    2. غسل العينات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.6) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع الإثارة لطيف في RT. الهواء الجاف العينات وإضافة قطرة من تصاعد المتوسطة لحماية مضان. مراقبة مضان من إيثيديوم المؤكسد على الليزر مسح متحد البؤر المجهر (40X التكبير، 568 نانومتر الطول الموجي).

    9. تحليل خلايا الدم البيضاء التوظيف من الخطة الرئيسية للعمليات الفحص

    1. بعد 7 أيام من مفاجآت صيف دبي التهاب القولون، وجمع الأنسجة القولون والتجانس العينات (200-400 ملغ) مع 1 مل من hexadecyltrimethylammonium (HTAB) عازلة (0.5٪ HTAB في 50 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 6.0) باستخدام الخالط على الجليد.
    2. شطف غيض من الخالط مرتين مع 1 مل من HTAB عازلة لتشمل جميع الأنسجة في المحللة ويصوتن خمس مرات في 40٪ السعة ل10 ثانية لكل منهما. تجميد ذوبان الجليد في النيتروجين السائل ثلاث مرات.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة، وجمع طاف.إعداد 2،2'-azino مكرر (3-ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك حمض) (ABTS) حل عن طريق خلط ABTS، 5 مل من سيترات الصوديوم (1 M في الماء)، 0.1 مل من بيروكسيد الهيدروجين، و 45 مل من ثنائي المياه -distilled.
    4. خلط 0.1 مل من كل طاف مع 0.1 مل من ABTS الحل في لوحة 96-جيدا مسطحة القاع. بعد 10 دقيقة، وقياس الامتصاصية في 460 نانومتر باستخدام مطياف.

    10. تقييم التعبير من السيتوكينات الموالية للالتهابات عن طريق PCR

    1. الأنسجة التجانس
      1. التجانس 50-100 ملغ من عينات الأنسجة القولون في 1 مل من خليط guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم حمض باستخدام الخالط السلطة.
      2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. مرحلة الانفصال
      1. إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم ويهز بقوة لمدة 30 ثانية.
      2. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. نقل شالمرحلة المائية pper إلى أنبوب جديد (~ 500 ميكرولتر).
    3. RNA الهطول وإعادة تعليق
      1. إضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل واحتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      3. إزالة طاف تماما.
      4. إضافة 1 مل من الايثانول 75٪ ودوامة.
      5. أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      6. إزالة طاف.
      7. السماح للالإيثانول المتبقية إلى الهواء الجاف لمدة 3-5 دقيقة.
        ملاحظة: من المهم عدم السماح للبيليه RNA يجف تماما، لأن هذا سيقلل كثيرا ذوبانه.
      8. إعادة حل بيليه في 0.3 مل من diethylpyrocarbonate (DEPC) المياه المعالجة بالإثير. على الفور نسخ من عينات الحمض النووي الريبي إلى [كدنا (أكثر استقرارا، راجع الخطوة 10.5) أو مخزن في -80 درجة مئوية.
    4. RNA الكمي
      1. تمييع 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مع 99 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.
      2. قراءة الالبريد OD في 260 نانومتر و 280 نانومتر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية / VIS معمل لتحديد تركيز العينة والنقاء.
    5. كدنا] التجميعي
      1. مزيج عينات الحمض النووي الريبي (1-5 ميكروغرام) مع 1 ميكرولتر من جزئية (DT) 12-18 (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) والمياه المعالجة DEPC (الحجم الكلي لل12 ميكرولتر) في ريبونوكلياز خالية من أنابيب معقمة.
      2. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      3. إضافة 2 ميكرولتر من 10X PCR العازلة، 1 ميكرولتر من 50 ملي MgCl 2، 1 ميكرولتر من 10 مزيج ملي dNTP، و 2 ميكرولتر من 0.1 M dithiothreitol (DTT).
      4. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      5. إضافة 1 ميكرولتر من الناسخ العكسي واحتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      6. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      7. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ويمكن تخزين [كدنا] في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    6. PCR
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من 10X PCR العازلة، 1.5 ميكرولتر من 25 ملي MgCl 2، 0.5 ميكرولتر من 10 ملي dNTP المزيج، 0.25 μL من البلمرة طق الحمض النووي، 0.25 ميكرولتر من كل التمهيدي (10 ميكرومتر) وكدنا] (100 نانوغرام)، والماء المعقم إلى الحجم الكلي لل25 ميكرولتر.
      2. تشغيل العينات على cycler الحرارية 96-جيدا. لمنع تضخيم الحمض النووي الجيني، إلى الأمام والاشعال يجب أن يكون موجودا في الإكسونات مختلفة عكس: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT وIL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT. IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA وIL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC. KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT وKC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA. وأكتين-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT وأكتين-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. استخدام شروط الاسترداد التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها 30 دورات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، بالإضافة إلى تمديد نهائي لمدة 10 دقيقة في 72 ° C .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النظام الغذائي ملاحق يمكن أن تحمي من مفاجآت صيف دبي التهاب القولون

المضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة المكملات الغذائية اتباع نظام غذائي، مثل فيتامين C، فيتامين E، وأكسيد النيتريك (NO) -source L-أرجينين، والأحماض الدهنية غير المشبعة ω3 (ω3-أومجا)، وقد استخدمت مع متفاوتة من النجاح في الحيوان نماذج لتخفيف علامات الأمراض الالتهابية 3،6،15. سوء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل استخدام المكملات الغذائية في الدراسات السريرية، وفوائد وسلامة مثل هذه المكملات يجب تقييمها بعناية في الجسم الحي في الدراسات الحيوانية. في حالة التهاب القولون، تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية المناسبة التي تشبه الأعراض السريرية لمرض التهاب الأمعاء، بما في ذلك النماذج الكيميائية باستخدام مفاجآت صيف دبي، TNBS، أو حمض الخليك. خروج المغلوب (KO) نماذج مثل IL10-KO. والتهاب القولون المناعية خلايا بوساطة استخدام نقل بالتبني تي خلية 19-21. نموذج مفاجآت صيف دب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المجلس المكسيكي للعلوم والتكنولوجيا (كوناكيت، 207268 و233395 لمايكل Schnoor). KFCO هي المستفيدة من راتب كوناكيت (396260) للحصول على درجة الماجستير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.3٪ من الجيلاتين Bioxon158
10٪ فورمالديهايدJT Baker2106-03
96 بئر صفيحة مع قاع مسطحCorning3368
الإيثانول المطلق  جي تي بيكر9000-03
الزيلين المطلقجي تي بيكر9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
مصل الأبقار الألبومينسيجما ألدريتش9048-46-8
مختبرات ColoScreenHelena5072
Corabion (مقدمة من Merck ، Naucalpan ، المكسيك)Merck
ديكستران كبريتات الصوديوم ملحAffymetrix9011-18-1(M.W. 40،000-50،000)
DihydroethidiumLife TechnologyD11347
Eosin-Y & nbsp ؛J.T. BakerL087-03
Evans blueSigma-Aldrich314-13-6
Feeding Needle Cadence Science Inc.9921
رف منزلق زجاجي بمقبضالمجهر الإلكتروني70312-16
شرائح زجاجيةCorning2947
Harris hematoxylin   ؛سيجما ألدريتشH3136
Hexadecyltrimethyammonium (HTAB)سيجما ألدريتشH6269
Histosette (تضمين كاسيت)SimportM498.2
حمض الهيدروكلوريك 1 MJ.T. بيكر9535-62
بيروكسيد الهيدروجينسيجما ألدريتشH3410
الكيتامينPiSA AgropecuariaQ-7833-028
البارافين السائل Paraplast39501-006
كربونات الليثيوم  سيجما ألدريتش2362
N ، N < / em >-ثنائي ميثيل فورماميدجي تي بيكر68-12-2
N < / em>-acetylcysteineSigma-AldrichA9165
مكعبات بلاستيكيةالمجهر الإلكتروني70181
محلول Poly-L-LysineSigma-Aldrich25988-63-0
المنشور 5 الإحصائي برنامجGraphPad SoftwarePrism 5
ملحي 0.9٪ كلوريد الصوديومCS PiSAQ-7833-009
سترات الصوديومسيجما ألدريتشW302600
راتنج صناعي   ؛بولي مونت7987
Taq DNA polymeraseInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T COMPOUNDSakura Finetek4583
حقنة توبركولينBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD وسيط تركيب مضاد للبهتان معمختبرات ناقلاتH-1200
XylazinePiSA AgropecuariaQ-7833-099
محلول DAPI

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
  2. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
  3. Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
  4. Lowenberg, M., D'Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21(2015).
  5. Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
  6. Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
  7. Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
  8. Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242(2016).
  9. Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471(2015).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  11. Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, Unit 15 25(2014).
  12. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084(2009).
  13. Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
  14. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
  15. Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
  16. Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
  17. Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
  18. Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073(2009).
  19. Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , Chapter 5, Unit 5.57 (2009).
  20. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
  21. Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
  22. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
  24. Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161(2016).
  25. Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
  26. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  27. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DSS

مقالات ذات صلة