الفئران كامل سمك زرع الجلد هو نموذج راسخة لدراسة الرفض في مكان منيع للمستضد الخيفي. هنا، ونحن نقدم البرنامج التعليمي كل خطوة تشارك في أداء BALB / ج -> C57BL / 6 زرع الجلد كامل سماكة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفئران كامل سماكة الجلد زراعة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفئران كامل سمك زرع الجلد هو راسخة في الجسم الحي نموذج لدراسة منيع للمستضد الخيفي الاستجابة والرفض الكسب غير المشروع. وعلى الرغم من تطبيق محدود للبشر، وزرع الجلد في الفئران وقد استخدمت على نطاق واسع للبحث الزرع. هذا الإجراء هو سهلة التعلم وأداء، وأنها لا تتطلب تقنيات المجهرية الدقيقة ولا تدريب مكثف. وعلاوة على ذلك، رفض الكسب غير المشروع في هذا النموذج يحدث في رد فعل مناعي استنساخه جدا ويتم رصد بسهولة عن طريق التفتيش المباشر والجس. وبالإضافة إلى ذلك، زرع الجلد الثانوي مع الطعوم المطابقة المانحة أو الجلد طرف ثالث يمكن أن يؤديها على المزيد من النماذج زرع معقدة كبديل وطريقة غير معقدة لتقييم التسامح المانحين محددة. مضاعفات منخفضة وهي بشكل عام تقتصر على جرعة زائدة من المخدر أو ضيق في التنفس بعد العملية. فشل الكسب غير المشروع، من ناحية أخرى، يحدث عادة نتيجة لضعف الاستعدادات للغرامفي الخلف، وتحديد المواقع غير صحيحة في السرير الكسب غير المشروع، أو وضع غير مناسب للضمادة. في هذه المقالة، نقدم بروتوكول لكامل سماكة زرع الجلد في الفئران ووصف الخطوات الهامة اللازمة لإجراء ناجحة.
المقدمة
زرع الأعضاء هو الاختيار الامثل لعلاج المرضى الذين يعانون من فشل في نهاية المرحلة الجهاز، والنتائج قد تحسنت بشكل ملحوظ مع التقدم في العمليات الجراحية والبروتوكولات المناعة. ومع ذلك، ويرتبط كبت المناعة على المدى الطويل مع آثار جانبية كبيرة، ووضع استراتيجيات جديدة تعزز التسامح يبقى الهدف من البحوث زرع الحديث.
وقد وضعت نماذج حيوانية عديدة للبحوث الأساسية في زراعة الأعضاء، لدراسة آليات الرفض المزروع واختبار النهج كبت المناعة لمنع رفض الكسب غير المشروع وتعزيز التسامح على المدى الطويل 1-3. أصبحت نماذج الماوس الدعامة الأساسية لبحوث المناعة نظرا لتوافر الحصري واسعة من الأجسام المضادة التشخيصية والعلاجية واضحة المعالم السلالات الفطرية والمعدلة وراثيا. زرع الجلد هو إجراء بسيط لا يتطلب مهارات المجهرية الخاصة ويمكن رصدها بسهولة بعد العمل الجراحي. مجتمعة، كان زرع الجلد الماوس أداة استثنائية لدراسة العديد من الجوانب المعنية في الاستجابة منيع للمستضد الخيفي، بما في ذلك تقديم المستضد والاتجار الخلية، وتدمير الأنسجة أثناء الكسب غير المشروع الرفض 4،5.
هنا، نقدم لك مجموعة من الإجراء خطوة بخطوة لزرع الجلد كامل سماكة باستخدام نموذج الفأر، ونحن تصف الخطوات الهامة اللازمة لengraftment ناجحة من الجلد المزروع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت كافة الإجراءات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعهد الوطني للصحة (NIH) وتمت الموافقة من قبل لجنة جامعة جونز هوبكنز رعاية الحيوان واستخدام (JHUACUC). تم تنفيذ إجراءات محددة في إطار MO13M292 بروتوكولات ACUC المعتمدة وMO13M370.
1. المانحة الجلد الحصاد
- تخدير الماوس المانحة مع isoflurane (المرذاذ الحث على 4٪ والصيانة في 1-2٪ من خلال مخروط الماوس). استخدام إصبع القدم انسحاب قرصة العاكسة لرصد عمق التخدير.
- باستخدام الحلاقة الكهربائية، حلاقة الجزء الخلفي من الحيوان وتعقيمها مع 10٪ اليود البوفيدون (على سبيل المثال، Betadine).
- باستخدام مقص العقيمة، والقفازات، وتقنية العقيم، والحصاد المانحة الجلد الخلفي من الفخذ في الرقبة، مع تشريح حادة على مستوى النسيج الضام الهالي.
- الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم بعد حصادرقعة جلدية.
- تحت المجهر، فصل الأنسجة الضامة والأنسجة الدهنية، وعضلية السبلة من الجلد مرة أخرى باستخدام مقص بضع وتر الجميلة. وعضلية السبلة هو رقيقة، شفافة العضلات المسؤولة عن حركة الوخز الجلد.
- استخدام معقم أدوات تقنية، قطع ترقيع 15 ملم × 15 ملم من الجلد مرة أخرى ل10 ملم × 10 ملم إلى 15 ملم × 15 ملم السرير الكسب غير المشروع.
- تخزين الطعوم على الشاش غارقة العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في طبق بتري على الجليد.
ملاحظة: 8-10 الطعوم يمكن الحصول عليها من الماوس مانح واحد.
2. مستلم الجلد زرع
- تخدير الماوس المتلقي مع isoflurane (المرذاذ الحث على 4٪ والصيانة في 1-2٪ من خلال مخروط الماوس). استخدام إصبع القدم انسحاب قرصة العاكسة لرصد عمق التخدير.
- إدارة 0.02 ملغم / كجم من وزن الجسم من البوبرينورفين لتخفيف الألم بعد الجراحة.
- حلق الجانب من الجزء الخلفي من الحيوان حيث واي الكسب غير المشروعليرة لبنانية تكون إدراج وتعقيم مع 10٪ البوفيدون اليود.
- باستخدام مقص، وقطع 10 ملم × 10 ملم إلى 15 ملم × 15 ملم مربع من الجلد. يجب أن يكون حجم الخلل أكبر قليلا (10٪) من الكسب غير المشروع. قطع كما ظاهريا ممكن. الحرص على الحفاظ على عضلية السبلة والسفن. وعضلية السبلة يمكن تمييزها من اللفافة الكامنة التي كتبها التنقل والأوعية الدموية التي تعمل سطحية لذلك.
- ضع الكسب غير المشروع على السرير الكسب غير المشروع، وتجنب طيات على طول الحواف.
- وضع 8 الغرز على الزوايا وعلى منتصف كل طرف. لكل خياطة، وتمرير الإبرة من خلال الكسب غير المشروع ومن ثم عن طريق عضلية السبلة من الكسب غير المشروع سرير تحت الجلد المتلقي المحيطة بها.
- إزالة القناع مخدر والسماح للحيوان يتعافى جزئيا من التخدير قبل تطبيق ضمادة لاصقة.
- التفاف الماوس المتلقي في ضمادة لاصقة مع الشاش مطوية على الكسب غير المشروع. جعل ضمادة من خلال الجمع بين اثنين من الضمادات، وقطعالجزء اللاصق من واحد ووضع منصات ماصة اثنين معا.
- مراقبة الماوس عن كثب خلال الانتعاش للتأكد من أن ضمادة لا تقيد الصدر سياحة والتنفس. إزالة الضمادة إذا يقلل من معدل التنفس أو يبدأ الحيوان في اللحظات أو التنفس بسطحية.
3. بعد العملية الجراحية العناية
- إدارة إينروفلوكساسين 5 ملغ / كغ بعد عملية جراحية للوقاية من العدوى.
- ضع الماوس المزروعة في قفص نظيفة على وسادة التدفئة ميكرووافابل حتى يتعافى تماما من التخدير.
- مراقبة الماوس لمدة 1 ساعة بعد العمل الجراحي قبل إعادته إلى منشأة سكنية.
- بعد سبعة أيام من الجراحة، تخدير الماوس كما في الخطوة 2.1. إزالة الضمادة عن طريق قطع فقط من خلال الجانب البطني من ضمادة.
- مراقبة وجس الكسب غير المشروع في اليوم التالي لعلامات scabbing، الانكماش، أو صلابة. إذا كان موجودا، والكسب غير المشروع قد لا يتحقق vasculariza السليموينبغي النظر في نشوئها وعطل فني.
- مراقبة يوميا بحثا عن علامات على الرفض. النظر في ترقيع رفض عندما ≥90٪ من الأنسجة الكسب غير المشروع يصبح الميتة.
- الموت ببطء الحيوانات رفضت وحصادها لتحليلها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وضع ضمادة على الماوس المتلقي هو خطوة هامة من هذا الإجراء. يتم وضع الكسب غير المشروع الجلد على الجذع المتلقي، بين الكتف والورك والعمود الفقري (الشكل 1). ويتكون ضمادة الشاش مع مطوية والجمع بين اثنين من ضمادات لاصقة البلاستيكية. يتم وضع الماوس المتلقي مع الكسب غير المشروع إلى أسفل على الشاش في وسط ضمادة. باستخدام اثنين من ملقط الصغيرة المنحنية، يتم سحبها الطرف الأدنى من ضمادة أولا، ومن ثم يتم لف الجزء العلوي من ضمادة على الماوس في الب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
منذ مقدمته التي كتبها مدور، الأول في الدراسات الإنسانية وثم في الأرانب والفئران، وقد تم زرع الجلد نموذج لا تقدر بثمن لدراسة الاستجابات المناعية خيفي 6،7. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم نموذجا على نطاق واسع، غير أوعية دموية، وزرع الجلد كامل سماكة باستخدام الجلد الخلفي العلوي والسفلي. ، وقد تم الإبلاغ عن وسائل بديلة مختلفة، بما في ذلك استخدام الجلد الذيل أو الجلد الأذن من الفأرة كمصدر الأنسجة الكسب غير المشروع حتى الآن 8،9. هذه النماذج تقدم ميزة واضحة من البساطة ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AI077610.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط دقيق مستقيم | Sigma | F4017 | |
| ملقط صغير منحني | Aesculap | BD333R | |
| مقص بضع وتر منحني ستيفنز | Aesculap | BC905R | |
| مقص تشريح المايونيز | Sigma | S3146 | |
| حامل إبرة صغيرة | Aesculap | BM563R | |
| شاش معقم | Covidien | 441218 | |
| 6-0 خياطة النايلون | MWI | 31849 | |
| شريط شرائط بلاستيكية & # 45; إيد | جونسون & أمبير جونسون | تم الحصول عليها من الصيدلية | |
| 10 سم طبق بتري | فيشربراند | FB0875712 | |
| PBS | جودة بيولوجية | 119069131 | |
| بوبرينورفين | رقم DEA المطلوب ؛ تم الحصول عليها من صيدلية | ||
| مستشفى Enrofloxacin | Bayer Health | Care 186599 |
المراجع
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
