عوامل جينية يمكن أن تتفاعل مع البرامج الوراثية لتعدل التعبير الجيني وتنظيم وظيفة الخلية ب. من خلال الجمع بين التحفيز في المختبر ب-الخلايا وقرة-بكر، والفائق microRNA-تسلسل ونهجا مرناً-تسلسل، يمكننا تحليل جينية تحوير التعبير ميرنا والجينات في الخلايا باء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
على نطاق الجينوم التحوير بوساطة "تحليل المانع هداك" ميكرورناس ومرناس في "ب الخلايا التي يسببها" للخضوع تبديل فئة جزئ الحمض النووي وتمايز خلية البلازما
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم إنجاز استجابات الأجسام المضادة من خلال العديد من العمليات الحرجة الخلية ب-الذاتية، بما في ذلك هايبرموتيشن جسدية (SHM)، وتبديل فئة جزئ الحمض النووي (CSR)، وتمايز خلية البلازما. تم في السنوات الأخيرة، أظهرت تعديلات جينية أو عوامل مثل هيستون ديسيتيليشن وميكرورناس (ميرناس)، للتفاعل مع البرامج ب-الخلايا الوراثية لتشكيل جسم الاستجابات، بينما تم العثور على اختلال وظيفي لعوامل جينية تؤدي إلى استجابات الأجسام. تحليل التعبير على نطاق الجينوم ميرنا ومرناً في الخلايا ب ردا على المغيرون جينية مهم لفهم تنظيم استجابة الدالة وجسم ب-خلية جينية. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لحفز الخلايا ب الخضوع للتمييز بين المسؤولية الاجتماعية للشركات، وخلايا البلازما، علاج هذه الخلايا ب مع مثبطات هيستون deacetylase (هداك) (دعم)، وتحليل التعبير مرناً وميكرورنا. في هذا البروتوكول، نحن نحلل مباشرة مكملة تسلسل الحمض النووي (كدنا) استخدام تكنولوجيات seq ميرنا، والجيل المقبل مرناً التسلسل (مرناً-seq) يقرأ تعيين تسلسل الجينوم، وكمية النسخ العكسي (قرة)-بكر. مع هذه النهج، حددنا في الخلايا ب الناجمين عن الخضوع للمسؤولية الاجتماعية للشركات، وتمايز خلايا البلازما، المبادرة، منظم جينية، بشكل انتقائي ينظم التعبير ميرنا ومرناً ويغير تمايز خلية البلازما والمسؤولية الاجتماعية للشركات.
المقدمة
علامات جينية أو عوامل، مثل التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال مثلايشن الحمض النووي والكشف غير الترميز (بما في ذلك ميكرورناس)، تعدل وظيفة الخلية بتغيير التعبير الجيني1. تعديلات جينية تنظيم وظيفة باللمفاويات، مثل جزئ الحمض النووي تبديل الطبقة الغلوبولين المناعي (CSR)، هايبرموتيشن جسدية (SHM) والتمايز إلى خلايا الذاكرة ب أو خلايا البلازما، وبالتالي تحوير بجسم والأجسام الردود2،3. المسؤولية الاجتماعية للشركات و SHM خطيرة تتطلب ديامينان سيتيديني التي يسببها التنشيط (المعونة، ترميز كأيكدا)، الذي هو الناجم عن درجة عالية في الخلايا ب استجابة لتعتمد على T والمستقلة T المستضدات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية "مؤسسات الرعاية الحيوانية" و "استخدام اللجان التابعة" لجامعة تكساس مركز علوم الصحة في سان أنطونيو.
1. "تحفيز الخلايا ب الماوس" للمسؤولية الاجتماعية للشركات، والتمايز خلية البلازما، ومعاملة المبادرة
- إعداد تعليق خلية الطحال
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الاندفاق الصفحي باستثناء الماوس القتل الرحيم والتشريح.- يوثانيزي محددة خالية من العوامل الممرضة C57BL/6J الماوس (8-12 أسبوعا عمر) باستنشاق أول أكسيد الكربون 2.
- تقع على عاتق الماوس على متنها تشريح البطن الأعلى. دبوس كل أربعة أقدام للماوس مع 18-قياس 1.5 في إبر الإبر.
- تع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام لدينا بروتوكول، تنقية الخلايا ب وضعها مع لبس (3 ميكروغرام/مل)، وايل-4 (5 نانوغرام/مل) ليمكن أن يستحث ح 96 30-40 ٪ من المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 و ~ 10% من تمايز خلية بلازما. بعد العلاج مع المبادرة (500µM جيش فيتنام الشعبي)، المسؤولية الاجتماعية للشركات إلى IgG1 انخفض إلى 10-20 في المائة، بينما انخفضت تمايز خلية البلازما ~ 2% (الرقم 1). وأكد انخفاض أرقام جزئ بعد Iμ-Cγ1 وناضج الخامسحدي جيحزيادة تثبيط المبادرة بوساطة للمسؤولية الاجتما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول نهج شاملة للحث على تبديل فئة بالخليه وتمايز خلية البلازما؛ لتحليل تأثيرها بجينيه المغيرون، إلا وهي مبادرة التنمية البشرية؛ والكشف عن أثر المبادرة على التعبير مرناً وميرنا في هذه الخلايا. معظم هذه النهج يمكن استخدامها أيضا لتحليل تأثير عوامل جينية في التعبير الدالة ومرناً/ميرنا ب-الخلايا البشرية. يمكن أيضا استخدام قرة-بكر ونهجا مرناً-seq/ميرنا-seq لتحليل الخلايا ب المعزولة من الفئران تعامل مع المغيرون جينية، مثل دعم.
مودولاتي جينية قد تؤثر على العديد من وظائف الخلية المختلفة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
بتأييد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة منح 105813 منظمة العفو الدولية ومنظمة العفو الدولية 079705 (على الكمبيوتر)، التحالف من أجل "تحديد الهدف البحث الذئبة" في الذئبة 295955 ALR المنح (للكمبيوتر)، والبحوث "مؤسسة أبحاث التهاب المفاصل الوطنية" منح (هرتز). وأيد المركز الطبي لطب الأطفال، مستشفى إكسيانجيا الثانية، وجامعة جنوب وسط مدينة تشانغشا، الصين، في سياق برنامج الزيارة طالب طب إكسيانجيا-يوتا "مدرسة طب سان أنطونيو" TS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| C57BL / 6 فئران | جاكسون لابز | 664 | |
| كورنينج cellgro RPMI 1640 متوسط (Mod.) 1X مع L-Glutamine (الحجم: 6 × 500 مل ؛ مع L-Glutamine) | فيشر Scientific | MT 10-040-CV ؛ | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone المضاد الحيوي محلول مضاد للفطريات 100 مل | فيشر ساينتفيك - Hyclone | SV3007901 | |
| & بيتا ؛ ميركابتو إيثانول | فيشر Scientific | 44-420-3250ML | |
| مصافي خلايا الصقر | فيشر Scientific | 21008-952 ؛ | |
| Trypan Blue Stain 0.04٪ | GIBCO / Life Technologies / Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer ؛ | فيشر العلمي | BW10-548E & nbsp ؛ | |
| غرفة عد الخطوط الساطعة من Hausser Scientific | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| الخلايا الجذعية | المغناطيسية EasySep | 18000 | |
| أنابيب البوليسترين المستديرة القاع من Falcon مع غطاء | فيشر العلمي | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B خلية | تقنية الخلايا الجذعية | 19854 | |
| إبرة BD فقط 18 مقياس 1.5 بوصة شطبة قصيرة 100 / صندوق ؛ | BD Biosciences | 305199 | |
| PE / Cy7 المضاد للفأر CD138 (Syndecan-1) الأجسام المضادة | BioLegend ؛ | 142513 (25 ميكروغرام) | |
| PE-Cy7 B220 الأجسام المضادة | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 مجم) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC المضادة للفأر / البشرية CD45R / B220 الجسم المضاد | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 & micro ؛ ز | Biolegend | 406610 | |
| FITC المضاد للفأر IgM الأجسام المضادة | Biolegend | 406506 | |
| FITC المضاد للفأر / الإنسان CD45R / B220 الأجسام المضادة | Biolegend | 103206 | |
| PE المضاد للإنسان / الفأر CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| مصل الأبقار الألبومين ، الكسر الخامس ، علاج الصدمات الحرارية | فيشر ساينتفيك | BP1600-100 | |
| LPS 25 مجم (عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية 055: B5) | سيجما ألدريتش | L2880-25MG | |
| ماوس مؤتلف IL-4 (خال من الناقلات) | BioLegend | 574302 (الحجم: 10 ميكروغرام) ملح | |
| الصوديوم بحمض الفالبرويك | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 خزانة السلامة الحيوية | شركة بيكر | SG404 | |
| حاضنة CO2 ذات السعة الكبيرة | الرقمي Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp: نموذج 205 | فيشر Scientific | 15-462-5Q | |
| 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين ذو القاع | المستدير فيشر العلمي | & nbsp ؛ 14-959-5 | |
| أنابيب الطرد المركزي Corning CentriStar 15ml | فيشر العلمية | 05-538-59A | |
| 1.7 مل Microtube ، واضح | Genesee | 22-282 | |
| الطرد المركزي البلاستيكية سهلة القراءة عالية السرعة 50 مل | فيشر ساينتفيك | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| الدوار 6M | ELMI | 6M | |
| الدوار 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond المحمولة Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 مل أطراف ماصة مصلية | فيشر ساينتفيك | 89130-900 | |
| 10 مل أطراف ماصة مصلية | فيشر ساينتفيك | 89130-898 | |
| 5 مل أطراف ماصة مصلية | فيشر ساينتفيك | 898130-896 | |
| ألواح 48 بئر | فيشر ساينتفيك | 07-200-86 | |
| جهاز طرد مركزي Allegra 6 Benchtop ، دوار بيكمان كولتر غير المبرد | 366802 | ||
| GH-3.8A ، أفقي ، ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop ، | مبرد من Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 ، | ثابتة Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | فيشر Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | فيشر ساينتفيك | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (حوالي 0.75٪ إيثانول كمادة حافظة / بيولوجيا جزيئية) مجموعة | فيشر Scientific | BP1145-1 | |
| خالية من الرناس (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 مقاييس الطيف | الضوئي الحرارية العلمية | ND-2000 | |
| Superscript III أول حبلا نظام التوليف RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates ، علبة 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' لاصقة الأختام | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II محلل قياس التدفق | BD Biosciences | ||
| FACSبرنامج BD | Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-Ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks نظام مكتبة شظايا I ل Illumina | بيكمان كولتر | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small طقم تسلسل الحمض النووي الريبي v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
المراجع
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
