مقالة منهجية

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

11.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55150

⸱

يناير 20, 2017

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

في هذه المقالة

ملخص

البروتينات المستجيب البكتيرية مهمة لتأسيس العدوى الناجحة. يصف هذا البروتوكول تحديد التجريبي للشركاء ملزم البروتينية من بروتين المستجيب البكتيرية في مضيف النباتات الطبيعية لها. أصبح تحديد هذه التفاعلات المستجيب عبر الخميرة الشاشتين الهجين أداة مهمة في كشف استراتيجيات المرضية الجزيئية.

الملخص

التكشف الآليات الجزيئية من مظاهر المرض من المهم أن نفهم الأمراض والتنمية أعراض في علم النبات. وقد تطورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب الأيض المضيفة لمصلحتهم الخاصة. وغالبا ما يقترن هذا التلاعب البكتيرية مع تطور أعراض شديدة أو وفاة النباتات المتضررة. أصبح تحديد جزيئات بكتيرية محددة مسؤولة عن التلاعب المضيف مجال هام في الأبحاث الميكروبيولوجية. بعد تحديد هذه الجزيئات البكتيرية، ودعا "المؤثرات"، فمن المهم توضيح وظيفتها. نهج واضحة لتحديد وظيفة من المستجيب في تحديد شريك ملزم البروتينية في المضيف الطبيعي عبر شاشة الخميرة اثنين الهجين (Y2H). عادة المضيف المرافئ عدد كبير من الشركاء المحتملين ملزم التي لا يمكن التنبؤ بما فيه الكفاية من قبل أي في خوارزمية SILICO. وبالتالي، فإن أفضل خيار لPERFORM شاشة مع المستجيب افتراضية ضد مكتبة كاملة من بروتينات المضيف التعبير عنها. ومن الصعب وخاصة إذا كان العامل المسبب هو زراعتها مثل phytoplasma. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لتنقية الحمض النووي من محطة المصابة phytoplasma المضيف الخشبية، والتضخيم من المستجيب المحتملين، وتحديد لاحق من شريك التفاعل الجزيئي المصنع مع شاشة Y2H. على الرغم من شاشات Y2H تستخدم عادة، هناك اتجاه الاستعانة بمصادر خارجية لهذه التقنية لشركات التقنية الحيوية التي تقدم خدمة Y2H في التكلفة. وينص هذا البروتوكول على تعليمات حول كيفية إجراء Y2H في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية مجهز لائق باستخدام تقنيات المختبر القياسية.

المقدمة

وقد وضعت الخميرة شاشات اثنين هجينة (Y2H) حوالي 27 سنوات قبل 1 ومنذ ذلك الحين استخدمت على نطاق واسع في مختلف المجالات لتحديد تفاعلات محددة البروتين البروتين 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11 . التفاعل المادي للالمستجيب البكتيرية مع بروتين هدف المضيف وغالبا ما يكون شرطا مسبقا للتلاعب وظيفي من هذا البروتين الهدف. تحليل هذه التفاعلات قد انتقل إلى محورا للعديد من قطاعات مختلفة من العدوى الأحياء 12، 13، 14، 15،"> 16، 17، 18. إن مبدأ الشاشة Y2H هو أن التفاعل بين اثنين من البروتينات يؤدي إلى إعادة تشكيل عامل النسخ الوظيفي الذي يدفع التعبير عن الجينات المراسل. والمستجيب المعروفة (و" وتنصهر الطعم ") translationally إلى المجال الحمض النووي ملزمة (DBD) من عامل النسخ، وشركاء التفاعل المحتمل (و"فريسة") وتنصهر إلى المجال تفعيل (م) من عامل النسخ منها. ومنذ شريك التفاعل غير معروف، ومكتبة من إمكانات يتم استنساخ interactors إلى ما يسمى "مكتبة فريسة." وعادة ما يتم إجراء هذه المكتبة من قبل استنساخ cDNAs إلى ناقلات فريسة التعبير البلازميد المناسب ترميز م والتي تتوافق مع الطعم متجه المشفرة DBD. وفي حالة التفاعل، و عوامل النسخ المعاد لحث على التعبير عن الجينات المراسل، التي تمكن عموما اختيار نمو الخميرة. إنويتحقق تحديد interactors بواسطة التسلسل البلازميد فريسة مع الاشعال-بلازميد معين.

وقد طورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب واستغلال الأيض المضيفة أو من الإفلات من آليات الدفاع وتفرز جزيئات المستجيب عبر مختلف أنظمة إفراز البكتيريا 19 و 20 و 21. تحديد الشركاء ملزم من هذه المؤثرات البكتيرية وبالتالي هو الخطوة الأولى في تحديد مسار التلاعب في البلد المضيف. وهذا يؤدي إلى تحسين فهم الآليات الإمراضية محددة.

يتم تنفيذ شاشات Y2H لتحديد التفاعلات المستجيب البكتيرية خلال phytoplasmoses، وكثير من الأحيان، Y2H هو التجربة الأولية الحاسمة لتوصيف مزيد من الآليات المرضية الجزيئية في مجال البحوث phytoplasma 22 و 23. ومع ذلك، فإن التقىوصف هود في معظم المنشورات نادرة إلى حد ما، وغالبا ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية هذه التقنيات لشركات التكنولوجيا الحيوية. للفت الانتباه إلى جدوى هذه الطريقة، يوفر هذا البروتوكول المعلومات خطوة بخطوة لتحديد الشركاء التفاعل جزيء المستجيب البكتيرية في المضيف الطبيعي.

وعلى الرغم من الاستخدام الواسع ونهج سريع إلى الأمام من شاشات Y2H، فإنه يجب ألا ننسى أن بعض التفاعلات قد لا تحدث في نظام الخميرة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم استخدام خلايا الخميرة كنوع من "في الجسم الحي عاء التفاعل" مع بعض القيود البيولوجية هذه. وقد تناولت العديد من الكتاب مزايا وعيوب Y2H ومشتقاته 11، 24، 25، 26، 27. الاعتبارات العامة هي، على سبيل المثال، أن خلية الخميرة قد لا توفر المناسبالتعبير الجيني، (مرحلة ما بعد) متعدية، أو الظروف translocational للبروتينات منها قيد الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة في الشاشة. تفاعلات إيجابية يمكن بدوره أن يكون القطع الأثرية وقد لا يحدث في الوضع الطبيعي (أي في حالة المؤثرات في المضيف المناسب). ومن ثم لا غنى عنه لتأكيد التفاعل من نظام الخميرة تعبير مغايرة مع اختبار تفاعل مستقلة في نظام بيولوجي أكثر ارتباطا.

في هذه الدراسة، تم تحديد الشركاء ملزم من ATP_00189 المستجيب من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة Candidatus Phytoplasma مالي (P. مالي). توفر نتائج نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور أعراض التفاح انتشار 28 عاما، وهو المرض الذي يسبب خسائر اقتصادية عالية في مناطق زراعة التفاح المتضررة في أوروبا 29.

البروتوكول

1. جمع عينات الجذر ورقة من الأشجار المصابة أبل

ملاحظة: الحمض النووي الممرض محددة يمكن تنقيته من الجذور أو الأوراق. ويقدم القسم التالي بروتوكول لأخذ العينات من على حد سواء.

  1. لإعداد الحمض النووي
    1. جمع العينات وإعداد من الجذور
      1. تحديد الأشجار المصابة مع "تفاحة انتشار" أعراض -specific 30 و 31 و الأشجار السيطرة التي هي خالية من الأعراض. باستخدام مقص نظيفة، وقطع عينات الجذرية التي يكون قطرها 0،5-1 سم وطوله حوالي 5 سم. عينات قطع من ثلاثة مختلفة، ومواقع بعيدة من نظام الجذر، ووضعها في أكياس بلاستيكية وصفت على نحو كاف.
        1. الحفاظ على العينات في مربع البارد مع حزم الحرارية المبردة وتخزينها في الثلاجة على 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
          ملاحظة: العمارة الجذر وهيكل يمكن أن تختلف فيما يتعلق الحالة الفيزيولوجية سو الشجرة. من المهم أخذ عينات في ثلاثة مواقع مختلفة وعدم اتخاذ rootlets جدا رقيقة. العينات يمكن تخزينها لعدة أيام في 4 درجات مئوية، ولكن مرة التخزين لفترات أطول تزيد من خطر الصب. عينات متعفن لا يمكن أن تستخدم لإعداد الحمض النووي.
      2. شطف عينات الجذر بالماء لإزالة التربة. وضعها في طبق بتري معقمة واستخدام مشرط معقم لإزالة البشرة الجذور والقشرة.
        1. تنظيف مشرط بمنديل نظيف، خالية من الوبر مسح، وتراجع في 70٪ (ت / ت) المحلول المائي الإيثانول، وحرارة تعقيم على مدى اللهب المكشوف (على سبيل المثال، موقد بنزن). اخدش اللحاء مع مشرط، ختم عليها إلى قطع صغيرة، وقسامة 30-100 ملغ من اللحاء مقطعة إلى العقيمة 2.0 أنبوب رد فعل مل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
    2. جمع العينات وإعداد من أوراق
      1. التعرف على المصابين وشجرة تحكم بدون أعراض، و الصورة موضح في الخطوة 1.1.1.1، واختيار عشرة أوراق سالما لكل شجرة. شجرة واحدة في حالة غير كافية.
      2. شطف الأوراق مع الماء وتنظيف الأسطح عن طريق الرش 70٪ (ت / ت) حل الإيثانول. وضع الأوراق في طبق بتري معقمة وتشريح الضلع الأوسط (الوريد المركزي) من كل ورقة مع مشرط معقم. إزالة البشرة والقشرة من الضلع الأوسط، وقطع الضلع الأوسط إلى قطع صغيرة، وقسامة 100 ملغ من الأنسجة الضلع الأوسط في أنبوب رد فعل 2،0 مل العقيمة. استخدام عينات على الفور لإعداد الحمض النووي أو مخزن في -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
        ملاحظة: أنه لأمر مريح للقسامة المواد النباتية في أجزاء من 100 ملغ و تجميد في نهاية المطاف لهم للتخزين. كل قسامة يمكن استخدامها مباشرة لإعداد الحمض النووي. وزن المواد النباتية مجمدة غير مرهقة، لأن المواد النباتية المجمدة تميل إلى تشكيل قطع.

2. Cetyltrimethylammonium بروميد (CTAB) المستندة تحضير الحمض النووي

الصورة = "jove_content"> ملاحظة: الحمض النووي يمكن تنقيتها باستخدام أي طريقة تنقية الحمض النووي القائم على عمود المواد النباتية. في هذا القسم، وصفت طريقة تقوم CTAB لتنقية الحمض النووي. يتم تنفيذ تنقية الحمض النووي بناء على بروتوكول تعديل موضح في مكان آخر (32).

  1. إعداد المخازن المؤقتة التالية:
    1. عازلة CTAB: حل 1٪ ث / ت بروميد cetyltrimethylammonium (CTAB، M ص: 364.45 جم / مول)، و 100 ملي trishydroxymethylaminomethane (تريس، M ص: 121.14 جم / مل)، و 1.4 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، M ص: 58.44 ز / مول)، و 20 ملي ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم والملح (NaEDTA، M ص: 372.24 جم / مول) في الماء وتعديلها لدرجة الحموضة 8.0.
    2. عازلة N-Lauroylsarcosine: حل 10٪ ث / ت N-lauroylsarcosine ملح الصوديوم 33 (M ص: 293،38 ز / مول)، و 100 ملي تريس و 20 ملي NaEDTA في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
    3. تريس، EDTA (TE) المخزن المؤقت: حل 10 ملي تريس و 1 ملي NaEDTA في الماء وautoclافي الحل.
    4. الأمونيوم خلات الحل: قم بإعداد 5 M خلات الأمونيوم (م ص: 77،0825 غ / مول) حل في المياه وتعقيم أنه عند 120 درجة مئوية و 1.2 بار لمدة 20 دقيقة.
  2. مزيج 30-100 ملغ من المواد النباتية المفروم الطازجة أو المجمدة (الخطوة 1.1.2.2) مع 300 ميكرولتر من العازلة CTAB، 30 ميكرولتر من العازلة N-Lauroylsarcosine، 6 ميكرولتر من بروتين كاف (10 ميكروغرام / ميكرولتر)، و 12 ميكرولتر من 2-المركابتويثانول 34 (M ص: 78،13 غ / مول). يهز لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. دع المزيج يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
  3. إضافة 360 ميكرولتر من الأمونيوم حل خلات وتخلط بقوة. اسمحوا الحل الجلوس لمدة 5 دقائق، ثم الطرد المركزي أنه في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. طاف لنقل قارورة نظيفة وإضافة 720 ميكرولتر من الجليد الباردة الأيزوبروبانول 35. ترسيب الحمض النووي لمدة 30 دقيقة على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي المزيج في 15000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4° C وتجاهل طاف. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70٪ وتدور عليه في 15000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل طاف الإيثانول وتراجع فورا القارورة على منشفة ورقية نظيفة لإزالة قطرات المتبقية. تأكد من إزالة أكبر قدر من السائل ممكن. الهواء الجاف وبيليه لمدة 15-20 دقيقة أو لمدة 2-3 دقيقة في جهاز للطرد المركزي فراغ المكثف. لا تبالغ في تجفيف بيليه عن طريق التسخين الزائد أو أوقات تبخر الموسعة.
  6. Resuspend وبيليه في 700 ميكرولتر من العازلة TE وفي نهاية المطاف تدفئتها إلى 37 درجة مئوية لتسهيل ذوبان. إضافة 10 ميكرولتر من ريبونوكلياز (10 ميكروغرام / ميكرولتر)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، والهز في 300 دورة في الدقيقة.
  7. إضافة 700 ميكرولتر من كلوروفورم: كحول أيزو أميلي 36 24: 1 وتخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي المزيج في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة العليا من طاف ل، قارورة نظيفة جديدة.
  8. ترسيب الحمض النووي في طاف بإضافة700 ميكرولتر من 2-بروبانول 35 (الأيزوبروبانول، M ص: 60.1 جم / مول) واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي المزيج في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
  9. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجفيف بيليه كما هو موضح في الخطوة 2.5. حله في 50 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات.

3. كشف Candidatus Phytoplasma الحمض النووي مالي محدد بواسطة PCR

  1. تخفيف الحمض النووي تنقيته من المواد النباتية 01:10 في nuclease خالية من المياه وتشغيل PCR مع الاشعال الممرض محددة 37.
    1. تحقق من وجود الحمض النووي P. مالي محددة في المواد النباتية باستخدام بروتوكول PCR الكمي مع الاشعال وتحقيقات محددة لP. phytoplasma مالي 37. تحقق من عدم وجود أعضاء آخرين phytoplasma 16SrX عن طريق أداء نفس PCR مع تحقيقات منهما ل Caالثانية. P. prunorum وCAND. P. pyri DNA 37.
      ملاحظة: يجب أن يتم اختبار الحمض النووي من شجرة غير المصابة، وكذلك لتأكيد عدم وجود الممرض في هذه السيطرة. في هذه الخطوة، فمن المهم أن الحمض النووي من الأنواع phytoplasma أخرى ترتبط ارتباطا وثيقا غائب في العينة، لأن ذلك من شأنه أن يزيد من خطر تضخيم المستجيب من الأنواع phytoplasma أخرى من P. مالي. يحكم عدوى مختلطة مع آخر P. مالي phytoplasma مجموعة 16SrX ترتبط ارتباطا وثيقا من خلال تحليل عينة مع تحقيقات منهما. وحيث أن النتائج المتوقعة ينبغي أن تكون سلبية بالنسبة phytoplasma 16SrX آخرين، من المهم أن تشمل الضوابط الإيجابية المناسبة التي تشير PCR فعالية.

4. تضخيم إمكانيات المستجيب جين واستنساخ فرعي في المتجهات Y2H بيت

  1. تضخيم atp_00189 phytoplasmal الجين (لا تضم الجزء إشارة الببتيد) من P. مالي باستخدام بادئات 5TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (إلى الأمام) و 5 TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (عكس)، مع تقييد مواقع لEcoRI وسالي في 5 "و3 'الغايات، على التوالي. تنقية المنتج PCR مع طريقة تنقية الحمض النووي القائم على العمود.
  2. استنساخ amplicon في ناقلات Y2H الطعم pLexA-N عبر EcoRI وسالي ربط.
    ملاحظة: هنا، و 100 نانوغرام من EcoRI وسالي خطي pLexA-N ناقلات وجنبا إلى جنب مع 15 نانوغرام من هضمها بالمثل atp_00189 PCR amplicon و 1 يو T4-يغاز. تم إجراء عملية ربط في العازلة التي تحتوي على 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية)، 10 ملي MgCl 2 و 10 ملي dithiothreitol (DTT، M ص: 154.25 جم / مول)، و 0.5 ملي أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP، M ص: 507.18 جم / مول) في إجمالي حجم 10.0 ميكرولتر في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها (14-20 ساعة). تحليل الحمض النووي من شجرة غير المصابة بنفس الاشعال استبعاد التمهيدي غير محددة ملزمة لتفاح س DOMESTICA </ م> الحمض النووي.
  3. تحويل 1 ميكرولتر من مزيج ربط في E. خلايا القولونية electrocompetent واختر لاستنساخ مقاومة للكانامايسين على لوريا، Bertani (LB) لوحات تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين كبريتات 38.
  4. تنقية DNA البلازميد من الحيوانات المستنسخة البكتيرية المحددة مع البلازميد إعداد مجموعة صغيرة على أسس العمود باتباع إرشادات الشركة المصنعة، وتحقق التكامل الناجح والتوجيه من إدراج بواسطة التسلسل 39.

5. اختبار لتفعيل الذاتي (التلقائي تفعيل) من البروتين المستجيب المحتملة

  1. إعداد المخازن المؤقتة التالية وسائط النمو:
    ملاحظة: التسميات لالخميرة انتقائية لوحات hyphenates الاختصارات من الأحماض الأمينية في عداد المفقودين في المتوسط ​​منها مع "-" قبل الاختصار. على سبيل المثال، SD-TRP-ليو-له لوحات تحتوي على جميع الأحماض الأمينية ولكن الحزب، ليو وله.
    1. 10X مزيج التسرب: زن200 ملغ من monohydrochloride L-أرجينين (M ص: 210.66 جم / مول)، 300 ملغ من L-آيسولوسين (M ص: 131.17 جم / مول)، 269 ملغ من الهيدرات-L يسين (M ص: 164.21 جم / مول)، 200 ملغ من L-ميثيونين (M ص: 149.21 جم / مول)، 500 ملغ من L-ألانين (M ص: 165.19 جم / مول)، 2 غرام من L-ثريونين (M ص: 119.12 جم / مول)، 300 ملغ من L-التيروزين (السيد: 181.19 جم / مول)، 200 ملغ من L-اليوراسيل (112.09 جم / مول)، و 1.5 غرام من L-حمض أميني أساسي (م ص: 117.15 جم / مول). حل لهم في 1 لتر من الماء المقطر المزدوج وتعقيم الحل. إبقاء الحل في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: مزيج التسرب منها يمكن أن يكون الممزوجة مسبقا أيضا بشراء.
    2. 10X-L الأدينين ملحق: يزن 100 ملغ من L-الأدينين hemisulfate الملح (ADE، M ص: 184.17 جم / مول) ويحل البرلمان في 50 مل من الماء المقطر المزدوج. فلتر تعقيم الحل مع فلتر المسام 0.22 ميكرون.
    3. 10X-L الحامض الاميني ملحق: وزن 100 ملغ من الهيدرات L-الحامض الاميني monohydrochloride (له، M ص : 209.63 جم / مول) في 50 مل من الماء المقطر المزدوج وتصفية تعقيم مع فلتر المسام 0.22 ميكرون.
    4. 10X-L يسين ملحق: يزن 500 ملغ من L-ليسين (ليو، M ص: 113.17 جم / مول) في 50 مل من الماء المقطر المزدوج وتصفية تعقيم مع فلتر المسام 0.22 ميكرون.
    5. 10X-تريبتوفان ملحق: يزن 100 ملغ من-تريبتوفان (TRP، M ص: 204.23 جم / مول) في 50 مل من الماء المقطر المزدوج وتصفية تعقيم مع فلتر المسام 0.22 ميكرون.
    6. SD-TRP-ليو-له-ADE المتوسطة ولوحات: ذوب 0.67٪ ث / ت قاعدة الخميرة النيتروجين (بدون الأحماض الأمينية)، و 2٪ ث / ت-D الجلوكوز الهيدرات (M ص: 198.17 جم / مول) في مزدوج الماء المقطر والأوتوكلاف. لوحات أجار، إضافة 2٪ ث / ت أجار (الصف الميكروبيولوجي) قبل التعقيم.
    7. لإعداد لوحات انتقائية، إضافة 1X من الأحماض الأمينية الحل الأسهم إلى المتوسطة SD-TRP-ليو-له-ADE تعقيمها. عند إعداد لوحات، وتأكد من أن أجار يتم تبريده إلى ~ 50 درجة مئوية قبل إضافةالأحماض الأمينية. حافظ على الحلول الأسهم عقيمة.
    8. YPAD المتوسطة: حل 1٪ ث / ت خلاصة الخميرة، 2٪ ث / ببتون الخامس (الصف الميكروبيولوجي)، 0.004٪ ث / ت الأدينين hemisulfate الملح (M ص: 184.17 جم / مول)، و 2٪ ث / ت الجلوكوز الهيدرات ل المياه والتعقيم ضعف المقطر. لوحات أجار YPAD، إضافة 2٪ ث / أجار الخامس قبل التعقيم. لإعداد 2X YPAD، استخدم مرتين تركيزات المكونات المذكورة أعلاه.
      ملاحظة: (اختياري) ونظرا لتركيز عال من السكر في المتوسط، 2X YPAD المتوسطة يصبح داكن اللون البني بعد التعقيم. وكبديل لذلك، 40٪ (ث / ت) حل سهم الجلوكوز يمكن إعداد وتعقيم بتمريرها من خلال مرشح 0.22 ميكرون. ثم يضاف محلول المخزون الجلوكوز تعقيم تصفية على 2X YPAD تعقيمها (التي تفتقر إلى الجلوكوز) تحت ظروف معقمة. لتجنب الأخطاء الحجم، و2X YPAD يجب أن يكون مستعدا، مع الأخذ في الاعتبار أن يتم إضافة محلول الجلوكوز 10X في وقت لاحق. وهذا يعني، على سبيل المثال، بدلا من 1 L سو المتوسطة، ويتم تحضير 900 مل (التي تحتوي على جميع المكونات ما عدا الجلوكوز) وتعقيمها، ثم يضاف 100 مل من محلول المخزون الجلوكوز.
  2. بوساطة خلات ليثيوم التحول الخميرة للاختبار الذاتي التنشيط
    1. خط السلالة خميرة الخباز مراسل NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3،112 ade2 LYS2: :( lexAop) 4-HIS3 ura3: :( lexAop) 8-lacZ ade2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) من الأسهم الجلسرين المجمدة على لوحة أجار YPAD واحتضان لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية. اختيار المستعمرات من هذه اللوحة، وتطعيم 50 مل من YPAD المتوسطة. السماح الخميرة تنمو وقياس 600 OD بانتظام لمراقبة النمو.
    2. السماح الخميرة تنمو إلى OD النهائي 600 من 0،5-0،8. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لهم في 700 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في 2.5 مل من الماء المقطر المزدوج، تعقيمها.
    3. إعداد ستة قسامات مع 100 ميكرولتر من تعليق الخميرة وإضافة 240 ميكرولتر من 50٪ ث / ت البولي ايثيلين جلايكول 4000 (PEG، M ص: 3،500-4،000 غ / مول)، 36 ميكرولتر من 1 M الليثيوم خلات ثنائي الهيدرات (LiOAc، M ص: 102.02 جم / مول)، و 25 ميكرولتر من 2٪ ث / ت الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (المنحلة). إعداد جميع الكواشف مع، الماء المعقم المقطر المزدوج.
    4. تسمية قارورة ستة تحتوي على تعليق الخميرة من "أ" إلى "و" وإضافة ما يلي الحمض النووي ناقلات البلازميد: ضوابط السلبية: (أ) 1.5 ميكروغرام البلازميد الطعم مع المستجيب (pLexA-N-atp00189 28)، (ب) 1.5 ميكروغرام البلازميد فريسة فارغة pGAD-HA 41، (ج) 1.5 ميكروغرام من ناقلات الطعم فارغة pLexA-N 41، و (د) 1.5 ميكروغرام من فارغة ناقلات الطعم pLexA-N و 1.5 ميكروغرام من فارغة فريسة البلازميد pGAD-HA. الضوابط الإيجابية: (ه) 1.5 ميكروغرام من السيطرة الإيجابية الطعم DNA البلازميد pLexA-البروتين p53 41 و 1.5 ميكروغرام من إيجابية والفرائس البلازميد اتفاقا لlargeT 41؛ والاختبار الذاتي التنشيط: (و) 1.5 ميكروغرام من مكتبة الإسكندريةذلك البلازميد مع المستجيب (pLexA-N-atp00189) و 1.5 ميكروغرام من فارغة فريسة البلازميد pGAD-HA.
    5. مزيج من ردود الفعل بقوة واحتضان لهم لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية في حمام مائي. بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 700 x ج وتجاهل طاف. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من 0.9٪ (ث / ت) محلول كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، M ص: 48.44 جم / مول) ونشر 50 ميكرولتر على لوحات مختارة التالية: SD-الحزب، SD-ليو، SD-trp- ليو، SD-TRP-ليو-له، وSD-TRP-ليو-له-ADE.
    6. احتضان لوحات لمدة 3-4 أيام عند 30 درجة مئوية. بعد اليوم الأول من الحضانة، وختم لوحات مع فيلم البارافين البلاستيك لمنع لوحات من الجفاف.
    7. تحقق من نمو الخميرة على لوحات.

6. اختبار التعبير عن المستجيب

  1. اختبار تعبير عن المستجيب لطخة غربية 42 مع الأجسام المضادة ضد ليكس-A العلامة التي يقترن في N-محطة من المستجيب عندماوأعرب عن pLexA-N.
    ملاحظة: جرب أن تنصهر translationally ليكس-علامة يضيف حوالي 24 كيلو دالتون للوزن الفعلي من البروتين من الفائدة. وهذا هو المهم عند تحديد حجم البروتين في وصمة عار الغربية.

7. شاشة Y2H

  1. خط لpLexA-atp00189 (المستجيب) -transformed NMY51 على طبق من ذهب SD-الحزب الطازجة وتركها تنمو ل2-3 أيام في 30 درجة مئوية، حتى تظهر المستعمرات الحمراء.
  2. تطعيم 3 مل من المتوسط ​​SD-الحزب في قارورة اهتزاز صغيرة مع مستعمرة الحمراء من لوحة أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 120-150 دورة في الدقيقة.
  3. تطعيم 20 مل من SD-الحزب في قارورة تهز مع 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها، وتركها تنمو لمدة 8 ساعات.
  4. ضبط الثقافة إلى OD 600 = 0.2 بإضافة المتوسطة SD-الحزب وتطعيم 2X 100 مل في هز قوارير مع 10 مل من ثقافة بداية كل. تنمو بين عشية وضحاها مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: تأكد من أن الخميرة لا تنمو إلى OD 600> 0.5 وتمييع مع الطازجة SD-الحزب.
  5. قياس OD 600 و بيليه 120 OD 600 "وحدة". على سبيل المثال، إذا تم قياسها على OD 600 من 1.2، وتدور أسفل 100 مل، تجاهل طاف، و resuspend بيليه في 800 مل من قبل تحسنت 2X YPAD في قارورة شاكر مع شريط مغناطيسي.
    1. تدور باستمرار قسامة 2 مل، وإزالة طاف، و resuspend بيليه في الماء. تأكد من أن OD 600 من تعليق الخميرة ما بين 0.15 و 0.2. إن لم يكن، وضبط مع 2X YPAD أو إضافة المزيد من الخميرة من الثقافة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: 2X YPAD هو البني الداكن ويمكن أن تؤثر على نتائج قياس OD. وبالتالي، فمن الضروري resuspend الخلايا الخميرة في الماء قبل تحديد OD. وكبديل لذلك، 2X YPAD يمكن أعدها تعقيم الجلوكوز بشكل منفصل، كما هو موضح في المذكرة خطوة 5.1.8، والذي يحول دون تلوين المظلم من المتوسط.
  6. احتضان الثقافة الخميرة المتبقية في التطبيقالحجم ropriately قارورة شاكر (800 مل في 2 L شاكر قارورة أو تقسيم 2 × 400 مل إلى قسمين قوارير 1 L شاكر)، واحتضان عند 30 درجة مئوية، 120-150 دورة في الدقيقة. قياس OD 600 عن كل ساعة 1.5 حتى على OD يتم التوصل إلى 600 من 0.6 (يستغرق 4-6 ح). في غضون ذلك، وإعداد الحلول هو موضح في الخطوة التالية.
  7. الليثيوم التحول بوساطة خلات
    1. حل 2٪ ث / ت السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية في الماء وتغلى 500 ميكرولتر لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 100 درجة مئوية. وضع أنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة وكرر الخطوة التدفئة. إبقاء الحمض النووي على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
    2. إعداد الخلطات التالية:
      1. TE / LiOAC مزيج: تخلط 3.08 مل من 1 M LiOAC، 3.08 مل من 100 ملي تريس / 10 ملي EDTA (درجة الحموضة: 7.5)، و21.84 مل من الماء المقطر المزدوج العقيمة.
      2. PEG / LiOAc مزيج: الجمع بين 4.2 مل من 1 M LiOAc، 4.2 مل من ملي تريس / 10 ملي EDTA (درجة الحموضة: 7.5)، و 33.6 مل من 50٪ (ث / ت) PEG 4000.
    3. الطرد المركزي الخميرة ثقافة 800 مل (OD 600 = 0.6)في 700 x ج لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 مل من الماء المقطر المزدوج العقيمة. بيليه الخلايا مرة أخرى في 700 x ج لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. ملاحظة: في حالة الانقسام الضروري تعليق في عدة قوارير الطرد المركزي. أحجام السيولة في 7.7.3. و7.7.4. الرجوع إلى بيليه كله مستمد من 800 تعليق مل.
    4. Resuspend وبيليه في 16 مل من مزيج TE / LiOAc (راجع الخطوة 7.7.1.1)؛ تدور باستمرار في 700 x ج لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. Resuspend وبيليه في 9.6 مل من مزيج TE / LiOAC.
    5. إعداد رد فعل التالية يمزج في أوعية التفاعل البولي بروبلين بحجم مناسب: 12 قارورة مع 7 ميكروغرام من pGAD-HA-كدنا] ناقلات مكتبة، و 100 ميكرولتر من 2٪ الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (راجع الخطوة 7.7)، و 2.5 مل من مزيج PEG / LiOAc. إضافة 600 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة من الخطوة 7.10 لكل من 12 قارورة وتخلط بقوة لمدة 1 دقيقة.
    6. احتضان مزيج رد فعل لمدة 45 دقيقة عند 30 درجة مئوية في حمام ماءد مزيج بقوة كل 15 دقيقة. إضافة 160 ميكرولتر من DMSO إلى كل قنينة وتخلط بقوة. احتضان هذا المزيج لمدة 20 دقيقة أخرى في 42 درجة مئوية.
    7. بيليه الخلايا في 700 x ج لمدة 5 دقائق، ونبذ طاف، و resuspend كل بيليه في 3 مل من 2X YPAD. تجمع كل الخلايا (مع ما مجموعه 36 مل من 12 قارورة) في شاكر قارورة 100 مل واحتضان خميرة لمدة 90 دقيقة عند 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة.
    8. بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 700 x ج وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 4.5 مل من معقم 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم وتخلط جيدا من قبل pipetting بعناية صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية 10 مل. سحب 50 ميكرولتر وإعداد التخفيفات عشرة أضعاف في كلوريد الصوديوم 0.9٪ من 1:10 حتى 1: 1000. لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أطباق بتري 90 ملم تحتوي على SD-TRP-ليو أجار.
    9. نشر بقية الخميرة إعادة تعليق غير مخفف على 16- س 150 ملم أطباق بتري قطرها مع أجار SD-TRP-ليو-له-ADE. إضافة 3-AT إلى وسيلة للحد من تفعيل الذات. احتضان SD-TRP-ليولوحات لمدة ثلاثة أيام ولوحات وSD-TRP-ليو-له-ADE لمدة أربعة أيام في 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: النسخ التي تظهر على لوحات الانتقائية (محتملة) أزواج التفاعل وتحمل الترميز البلازميد pGAD-HA للشريك الطعم التفاعل.
    10. تحديد كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق عد المستعمرات من التخفيفات التسلسلية مختلفة على لوحات مختارة SD-TRP-ليو. نقل كل استنساخ عن طريق التقاط وتسليط الضوء على المستعمرة مع طرف ماصة معقمة على لوحات SD-TRP-ليو-له-ADE انتقائية جديدة. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة في كل يوم حتى يتم التوصل إلى ما مجموعه خمسة مقاطع.

8. تحليل المستنسخين من لوحات انتقائية

  1. إعداد أنبوب واحد عقيم رد فعل 2 مل مع 1 مل من SD-TRP-ليو-له-ADE لكل استنساخ تحت غطاء العقيمة. لكمة ثقب في كل أنبوب بإبرة الساخنة وتغطي فتحة مع قطعة من سداده المنفذة للغازات. تطعيم كل قارورة مع زميله مستعمرة جديدة الريال من استنساخ واحدة (الخطوة 7.17، واستخدام الحيوانات المستنسخة بعد مرور 5 عشر)، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية، والهز في 150 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: من المهم أن تأخذ الحيوانات المستنسخة من لوحة جديدة، لأن الخميرة التي أخذت من لوحات تخزينها لعدة أيام في 4 درجات مئوية لا تنمو بشكل كاف خلال 24 ساعة في وسط سائل.
  2. بيليه الخميرة لمدة 5 دقائق في 4000 x ج وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في المخزن المؤقت إعادة تعليق المناسب (من البلازميد الحمض النووي منها عدة miniprep) وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 2،0 مل الطازجة. إضافة 100 ميكرولتر من الخرز الزجاجي حمض غسلها (425- إلى 600 ميكرون قطر) وتخلط بقوة لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة العازلة تحلل منها، والمضي قدما في تنقية البلازميد باستخدام إعداد البلازميد مجموعة صغيرة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أزل DNA البلازميد مع 50 ميكرولتر من الماء.
  4. استخدام الحمض النووي من الخطوة 8.3 لرد فعل التسلسل مع التمهيدي البلازميد محدد فريسة، GAL4ADseqالمرجع "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3".
  5. التحقق من التفاعل من قبل دي نوفو 43 تحويل المشارك، 44 الطعم وناقلات فريسة. حدد الخميرة تحولت على لوحات مختارة SD-TRP-ليو-له-ADE.

النتائج

قبل لا يمكن أن يؤديها على الشاشة Y2H الفعلية يجب أن يتم اختبار الطعم لتفعيل الذات. ويتحقق ذلك عن طريق تحويل ناقلات التعبير الطعم جنبا إلى جنب مع ناقلات مكتبة فريسة فارغة ووقف النمو على لوحات مختارة.

لتحليل ما إذا كان ATP_00189 البروتين phytoplasmal هو تفعيل الذاتي، تم إجراء الاختبار الذاتي التنشيط كما هو موضح في القسم 5. البلازميد الطعم مكملة لجنة المراجعة الفنية وفريسة البلازميد وauxotrophy ليو س الخباز NMY51 40. وهكذا يتميز ناجح شارك في التحول من النمو على لوحات انتقائية تفتقر الحزب وليو. التفاعل بين الطعم والبروتينات فريسة يؤدي إلى تكامل من auxotrophy له وADE من NMY51. إذا ظهر تفعيل الذات من خلال الطعم في حالة عدم وجود تفاعل، الخميرة تنمو على لوحات انتقائية تفتقر له وADE. الذاتي القوي والضعيفيمكن أن يحدث التنشيط. يتميز قوي تفعيل الذات من الطعم من نمو الخميرة تتحول شارك في TRP-ليو-له-ADE المنضب لوحات مختارة. ضعف تفعيل الذات يؤدي إلى نمو في TRP-ليو-ولكن لا على TRP-ليو-له-ADE المنضب لوحات مختارة. الضوابط الإيجابية السليمة لا غنى عنها لتفسير نتائج تفعيل الذات الفحص. ويرد موجز النتائج المتوقعة من تفعيل الذات فحص وتفسيرها في الجدول 1 وتصور في الشكل 1.

figure-results-1
الشكل 1: مثال لبيت التنشيط الذاتي الاختبارات من البيت قبل تنفيذ شاشة Y2H. البيرة س NMY51 وقد شارك في تحويلها مع التفاعل الطعم (بلكس-البروتين p53) وفريسة (حلف-largeT) كعنصر تحكم إيجابية (اللوحة اليسرى: ميلان)، وهو ضعيف تشغل آليا بالإضافة إلى فريسة فارغة برةناقلات راي (وسط لوحة: مدافع) والطعم لا تشغل آليا بالإضافة إلى ناقلات مكتبة فريسة فارغة (الصحيحة لوحة: غي). الخميرة متحولة التعاون ومثقف على لوحات SD تفتقر الحزب وليو (اللوحة العليا: أ، د، ز)، الحزب، ليو وله (لوحة المتوسطة: ب، ه، ح) والحزب، ليو، له وآدي (أقل لوحة: ج، و، ط). الاختيار على المتوسطة التي تفتقر إلى الحزب وليو هو السيطرة الإيجابية لنجاح المشارك التحول، كما متجه الطعم يكمل auxotrophy الحزب وناقلات فريسة للauxotrophy ليو من NMY51 (النمو على SD-TRP-ليو). في حالة وجود تفاعل بين الطعم والفريسة أو تفعيل الذات من الطعم، يتم تشغيل التعبير مراسل NMY51 على ويكمل له وauxotrophy ADE (النمو على SD-TRP-ليو-له-ADE). ويتسم ضعف تفعيل الذات من خلال النمو في SD-TRP-ليو-له لوحات (لوحة المتوسطة، مدافع). يجب أن تقلص ضعف تفعيل الذات من الطعم قبل لتحليل الطعمفي شاشة Y2H، على سبيل المثال عن طريق إضافة 3-AT إلى وسائل الإعلام الانتقائي. يشار إلى استنفاد الأحماض الأمينية مع "-" في اسم وسائل الإعلام المعنية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

pLexA-N-atp00189 لا شيء المستعمرات أي نمو أي نمو أي نمو أي نمو
لا شيء pGAD-HA أي نمو المستعمرات أي نمو أي نمو أي نمو
pLexA-N لا شيء المستعمرات أي نمو أي نمو أي نمو أي نمو
pLexA-N pGAD-HA المستعمرات المستعمرات المستعمرات أي نمو أي نمو
pLexA-البروتين p53 اتفاق-largeT المستعمرات المستعمرات المستعمرات المستعمرات المستعمرات
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA المستعمرات المستعمرات المستعمرات أي نمو أي نمو

الجدول 1: النتائج المتوقعة في بيت التنشيط الذاتي الفحص. التحول من البيرة س NMY51 ينتج في النمو التفاضلي على وسائل الإعلام الانتقائية على أساس خصائص الطعم تتحول التعاون وفريسة. تم تقييم النمو على لوحات انتقائية على التحول من مجموعات ناقلات مختلفة (AF) بعد 72 ساعة حضانة في 30 درجة مئوية. يتميز ضعف تفعيل الذات من خلال نمو الخميرة على SD-TRP-ليو-له وقوي تفعيل الذات من خلال النمو في SD-TRP-ليو-له-ADE اختيار بلاتوفاق في ظل عدم وجود شريك التفاعل. وpLexA-N phytoplasmal المشفرة المستجيب ATP_00189 لا يحمل تفعيل الذات، والتي تتميز عدم قدرة ناقلات الطعم تتحول NMY51 أن تنمو في غياب له وADE.

اعتمادا على الطعم، يمكن لشاشة Y2H كسب العديد من الحيوانات المستنسخة الخميرة تنمو على لوحات مختارة. يجب تحليل جميع الحيوانات المستنسخة والتحقق من التكرار الممكنة. حتى لو تم استخدام مكتبة [كدنا طبيعية، فمن المحتمل جدا أن interactor لتتمثل في العديد من الحيوانات المستنسخة مختلفة. اعتمادا على تقنية الاستنساخ المكتبة، فمن الممكن أيضا أن يتم إدراج سوى الفتات من الجين الكامل في بعض نواقل فريسة. بالتالي فمن المستحسن أن دي نوفو تضخيم (من كدنا]) وsubclone الجين كامل طول interactor لولاختبار التفاعل في تحليل Y2H واحد الى واحد (الشكل 2).

figure-results-2
الشكل 2: مثال على التفاعل بين الطعم والفريسة في تجربة Y2H. وأجريت الخميرة اثنين الهجين (Y2H) الشاشة ووتنقية البلازميدات من الحيوانات المستنسخة interactor لإيجابية. كان التسلسل متجه الفريسة وتم تحديد تفاح س DOMESTICA شركاء التفاعل المضيف MdTCP24 وMdTCP25. ونتيجة لMdTCP34 سيطرة سلبية (التي تم تحديدها لا interactor لفي الشاشة مكتبة Y2H) وsubcloned بشكل متواز. وتضخمت جينات طول كامل من كدنا] التفاح، subcloned في ناقلات فريسة (التعبير المشارك cistronically تفعيل المجال AD) ودي نوفو المشارك تحولت مع ناقلات الطعم معربا عن ATP_00189 المستجيب بكتيريا بالإضافة إلى المجال الحمض النووي ملزمة (BD). يؤخذ هذا الرقم من 28. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

المناقشة

في الشاشة Y2H، وشارك في أعربت عن بروتين المستجيب محتمل مع مختلف البروتينات التفاعل افتراضية (الخطوة 7). يحتوي كل المتنامية استنساخ الخميرة الطعم ولكن (يحتمل) interactor لآخر. يتم ترميز البروتينات التفاعل في مكتبة [كدنا أن يتم استنساخ في البلازميدات فريسة. الطعم والفريسة البلازميدات كل رمز المشترك cistronically لجزء من عامل الخميرة النسخ. في حالة وجود التفاعل الجسدي بين الطعم (المستجيب) وفريسة interactor لترميز البلازميد، متحدون شطري عامل النسخ (المجال ملزم الحمض النووي ومجال التنشيط)، ويتسبب في التعبير الجيني مراسل. الخميرة هي قادرة على النمو على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. هذا النوع من مكتبة [كدنا فريسة يتوقف على المستجيب فرزهم ويجب أن يتم اختيار وفقا لذلك. يجب أن يكون الموجه الفريسة والطعم، وكذلك سلالة الخميرة، متوافق. في هذه الشاشة، وLexA الحمض النووي المجال وتفعيل domai GAL4 ملزمن كانت تستخدم كوحدات عامل الخميرة النسخ المتوافقة. مكتبة [كدنا يمكن بناؤها بشكل فردي، العرف، أو الحصول عليها تجاريا. إعداد مكتبة فريسة كدنا] ليست جزءا من هذا البروتوكول. في هذا البروتوكول، واستخدمت لذلك، مكتبة [كدنا تطبيع بتشييدها من الحمض النووي الريبي من تفاح أوراق DOMESTICA x و المستنسخة في pGAD-HA 41. تحولت المستجيب (الطعم) -expressing الخميرة سلالة مع مكتبة فريسة، واختيرت الحيوانات المستنسخة على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. لاستخراج DNA البلازميد من المستعمرات الخميرة، ينصح DNA البلازميد عدة القائم على عمود مصغرة للبكتيريا في تركيبة مع خطوة تعطل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي لتحسين الخميرة تحلل (الخطوة 8). في هذه تنقية البلازميد، سيتم تنقية الطعم وناقلات فريسة في وقت واحد في تركيزات منخفضة نسبيا. ومع ذلك، فإن كمية DNA البلازميد يكفي للتعرف على شريك التفاعل من خلال التسلسل خفة دمالحوت نشر البلازميد مسبق (الخطوة 8.4). وكبديل لذلك، الحمض النووي تنقيته في الخطوة 8.4 يمكن أن تتحول إلى المختصة كولاي واختار مع فريسة بوساطة ناقلات المقاومة للمضادات الحيوية (مثل الأمبيسلين وفي حالة pGAD-HA). هاء اختيار القولونية المستعمرات تحمل سوى مكتبة البلازميد pGAD-HA، وتنقية البلازميد ذات العائد المرتفع يمكن القيام بها مع هذه الحيوانات المستنسخة.

التحول الناجح لpLexA-N وpGAD-HA يبني يكمل التربتوفان ويسين auxotrophy من NMY51. التفاعل بين المستجيب وبروتين (المشفرة على pGAD-HA) يؤدي إلى تفعيل نظام مراسل في NMY51 السلالات. في حالة تفعيل الذاتي، NMY51 تحولت مع المستجيب معربا عن pLexA-N في تركيبة مع ناقلات مكتبة فارغة pGAD-HA تنمو على لوحات انتقائية تفتقر TRP-ليو-له-ADE، ويرجع ذلك إلى تفعيل غير المرغوب فيها من النظام مراسل NMY51 40. تفعيل الذات يمكن أن أكون wEAK ويمكن أن يحدث في غياب TRP-ليو-له، أو تفعيل يمكن أن تكون قوية وتميز بالنمو على لوحات TRP-ليو-له-ADE 41. تفعيل الذات يمكن أن يسبب خلفية ضخمة من الحيوانات المستنسخة إيجابية كاذبة في الشاشة Y2H الفعلية. لتجنب هذا، يجب إجراء اختبار الذاتي التنشيط مع الطعم، الذي ناقلات، معربا عن المستجيب هو-شارك تحولت مع ناقلات مكتبة فارغة. في هذا الإطار التجريبي، لا يجب أن يتسبب التعبير الجيني مراسل. إذا تفعيل الذات (أي نمو على لوحات مختارة) مرئيا في الاختبار، وسيلة يمكن أن تستكمل مع تركيزات مختلفة من 3 أمينو-1،2،4-التريازول 45 (3-AT). 3-AT هو المانع من نازعة الماء imidazoleglycerol فوسفات (HIS3)، وهو إنزيم مهم خلال الحامض الاميني الحيوي 46. مكملات مع 3-AT يمكن أن تقلل من تأثيرات ضعف تفعيل الذاتي خلال شاشات Y2H 47،48. يجب اختبار تركيزات مختلفة من 3-AT. في هذا البروتوكول، 1 - استخدمت 40 ملم 3-AT. يجب بعد ذلك يتم استخدام أقل تركيز الذي يؤدي إلى قمع تفعيل الذاتي في الشاشة Y2H. لا يمكن إلا أن لوحات مختارة من تفعيل الذات فحص يتم تقييم إذا لوحات SD-TRP-ليو من شارك في التحول تحتوي على عدد كاف من الحيوانات المستنسخة. باعتبارها ≥ إشارة 500 المستعمرات في 90 ملم (قطر) طبق بتري كافية. لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن بالضبط، فمن المستحسن لإعداد التخفيفات المسلسل من الخميرة تتحول التعاون ونشرها على لوحات SD-TRP-ليو.

للحد من تفعيل الذات، والمستجيب يمكن المستنسخة في pLexA-C، ناقل التعبير الطعم الذي يجمع العلامة LexA لمحطة سي من البروتين. توجه ليكس-A علامة لا يمكن تخفف تفعيل مصيره (24). ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن في كل حالة إلى خفض أو إلغاء تفعيل الذات. تشكيلالمستعمرات الحمراء أو المحمر يشير إلى التفاعل الضعيف أو كاذبة إيجابية. يتم تنشيط الجينات مراسل ade2 من NMY51 فقط عندما يتعلق الأمر تفاعل البروتين البروتين، والتي في كتل بدوره تراكم صبغة حمراء في هذه الخميرة سلالة 40. في حالة عدم وجود تفاعل، NMY51 هي المحمر، في حين المستعمرات تحمل interactors قوية بيضاء. مراقبة لون مستعمرة على لوحات مختارة وبالتالي يوفر تلميحا هاما آخر للحكم على ما إذا المستعمرات منها هي interactors true- أو إيجابية كاذبة.

ومن الضروري في نهاية المطاف على التكيف أو تغيير إعدادات الفحص معينة فيما يتعلق بطبيعة الطعم وخصائص التفاعل. الآن، وقد وضعت عددا من التحسينات والتقنيات مشتقة من Y2H مشتركة تتيح لتحليل التفاعلات البروتينية صعبة إلى حد ما في أنظمة المضيف مختلفة. مراجعة من قبل Stynen وآخرون. 49 عناوين ليصف الثانية جوانب مختلفة من Y2H، وإدخال تحسينات لها، والتكيف، وبالتالي يوفر معلومات مفيدة حول كيفية اختيار فحص التفاعل المناسب.

أصبحت شاشات Y2H والتقنيات المستمدة تستخدم على نطاق واسع في المجالات البحثية المختلفة، حيثما هو مطلوب تحديد تفاعلات البروتين الثنائية. حتى لو يتم تنفيذ الضوابط الحرجة، مثل اختبارات تفعيل الذات من الطعم واحد الى واحد إعادة التحولات من البروتينات المتفاعلة التي تم تحديدها، وY2H معرضة لإنتاج نتائج خاطئة 26، 50، 51. الخميرة كنموذج ليست مناسبة لجميع الدراسات التفاعل. الخميرة لا تشكل بالضرورة بيئة الخلوية التي تدعم التعديل المناسب بعد متعدية وقابلة للطي لكل بروتين 24. وعلاوة على ذلك، في الإعداد Y2H، البروتينات والإفراط في اعرب، والتعبير عنها ليس السيطرةبقيادة المروج الطبيعي. تجبر Y2H الشركاء التفاعل البروتينية إلى النواة، وهي ليست بالضرورة وجهة التحت خلوية الطبيعية. وبالتالي قد لا تعكس الظروف الخلوية الأم من التفاعل من قبل الخميرة ويمكن أن يؤدي إلى نتائج خاطئة سلبية أو إيجابية كاذبة. وتستند معظم Y2H على تكامل الخميرة auxotrophy كمبدأ انتقائية. يتميز هذا الاختيار الغذائية من قبل حساسية عالية، ولكن على حساب من الانتقائية انخفض بالمقارنة مع غيرها (على سبيل المثال، مراسل مولد اللون) فحوصات 49. إذا unreducible تفعيل الذاتي (انظر أعلاه) أو تحدث قيود أخرى لالمستجيب معين، وY2H ليست فحص المناسب 25. في الجدول 1 والشكل 1، وبالنظر إلى النتائج المتوقعة للاختبار الذاتي التنشيط. يمكن أن يكون سبب غياب التفاعلات الحقيقية (أي السلبيات الكاذبة) التي كتبها سمية بروتين، غير صحيح البروتين متعدية تجهيز والفراغية عائق للتفاعل والشركاء التفاعل ممثلة تمثيلا ناقصا في المكتبة تفترس غشاء توطين الطعم، أو في عداد المفقودين المكونات الضرورية للتفاعل 24.

فمن المستحسن أن دي نوفو تضخيم الجين كامل طول البروتين التفاعل تحديدها من كدنا]، subclone ذلك إلى pGAD-HA، وإجراء التفاعل فحص واحد الى واحد من خلال تحويل ولدت pGAD-HA بناء في، معربا عن الطعم NMY51 سلالة. وهذا أمر ضروري لأن interactor لاحظ موجودة في مكتبة فريسة قد تكون سوى جزء من بروتين أكبر. ومع ذلك، فإن المعلومات عن منهما الجين كامل طول يمكن الوصول إليها إلا إذا كبير الجيني وtranscriptomic تسلسل البيانات المتاحة. بروتوكول التحول للفحص الذاتي التنشيط الموصوفة هنا يمكن تطبيقها لمثل هذا الاختبار واحد الى واحد، والتفاعل بين الطعم وinteractor لويجب أن تكون قابلة للتكرار.

الحمار = "jove_content"> التفاعلات التي تم تحديدها في شاشة Y2H يجب دائما أن أكده تقنية مستقلة أخرى. يجب أن يكون هذا الأسلوب مستقلة أقرب إلى بيئة طبيعية للالفعلي للتفاعل البروتين البروتين. في حالة ATP_00189 phytoplasmal المستجيب، تم التحقق من التفاعل مع عوامل النسخ TCP من تفاح س DOMESTICA في أخمص مع تكامل الفلورسنت ثنائي الجزيء (BiFC) في نيكوتيانا benthamiana جبلة مجردة 28 (ليست جزءا من هذا البروتوكول). وقد اشتق ATP_00189 البروتين المستجيب من محطة الممرض P. مالي. في بلانتا BiFC وهكذا اختارت أن تحقق التفاعل ATP_00189 مع تفاح س DOMESTICA عوامل النسخ التي سبق تحديدها في Y2H 28. BiFC هو البروتين البروتين التفاعل الفحص التي لا تتطلب النبات التحت خلوية من البروتينات التفاعل إلى النواة من أجل تفعيل نظام مراسل <سوب الطبقة = "XREF"> 52. علاوة على ذلك، في أخمص التعبير والآلات تعديل يحاكي بيئة من التفاعل الطبيعي بين المستجيب البكتيرية مصنع في مضيف مصنعها. ومع ذلك، فإن الشاشة العالمية باستخدام BiFC ليست مجدية.

هناك العديد من الخطوات في البروتوكول التي يجب معالجتها بعناية. عندما تضخيم الجين (الخطوة 4)، من المهم أن يستبعد أن الاشعال ربط الحمض النووي المصنع. وبالتالي، من الحمض النووي من النباتات غير المصابة يجب أن تدرج كعنصر تحكم السلبية. يجب أن لا يحتوي على تسلسل الجين من مصلحة تقييد مواقع EcoRI وسالي التي تستخدم لاستنساخ اتجاهي للإدراج. إذا كان تسلسل لا تحتوي على هذه المواقع، يجب اختيار الانزيمات تقييد مختلفة لاستنساخ. التحول الخميرة هي طريقة المركزي خلال هذا البروتوكول. كفاءة ترنسفكأيشن يعتمد على كفاءة خلايا الخميرة، حيويتها، ولاية النمو، ونوعية reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة 53، 54. لالبروتوكول المقترح، فإنه ينصح بشدة لاستخدام الخميرة من لوحات جديدة لا يزيد عمرها عن أسبوعين (الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية) عند تنفيذ التحولات. في كثير من الأحيان، تأخر نمو الخميرة تتحول عندما يتم تلقيح الثقافات السائلة انتقائية مع المستعمرات من لوحات أجار القديمة. ومن المفيد أيضا استخدام الثقافة بداية السائل بمثابة اللقاح للتجارب الفعلية وعدم استخدام الخميرة مباشرة من لوحة. انخفاض كفاءة عندما transfecting فريسة في الخميرة، معربا عن الطعم يمكن أن يؤدي إلى نقص تمثيل بعض البروتينات فريسة (interactors المحتملة)، وبالتالي يمكن أن تحرف الشاشة بأكملها. في هذا البروتوكول، وكفاءة ترنسفكأيشن خميرة ~ 150،000 وت م / ميكروغرام الحمض النووي transfected في Y2H عملت بشكل جيد.

معرفة عيوب وعيوب تقنية Y2H وتفسير النتائج بطريقة حاسمة ومناسبة أمر لا غنى عنه لرسم نيوسإلخ الاستنتاجات. وقد استخدمت المقايسات Y2H والمشتقات لسنوات عديدة، وخضعت العديد من التحسينات والتعديلات فيما يتعلق خصائص الطعم المختلفة، وتوطين التحت خلوية من التفاعل والشركاء ملزم المتوقع، وغيرها من العوامل التي قد تكون مطلوبة للتفاعل (انظر Y3H 55، 56، 57). في الآونة الأخيرة، وقد وضعت شاشات Y2H مجموعة مقرها التي تسمح للتحليل الآلي، والإنتاجية العالية من العديد من الطعوم ضد الملايين من يفترس 58. المستقبل على الأرجح يكمن في الأتمتة والإنتاجية العالية النهج لهذا الاختبار للسماح لاستجلاء مسارات الإشارات المعقدة وinteractomes في المجالات البحثية المختلفة.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر كريستين Kerschbamer، توماس Letschka، سابين Oettl، مارغو Raffeiner، وفلوريان Senoner من مركز البحوث Laimburg وMirelle بورخيس دياس Schnetzer من Dualsystems في مجال التكنولوجيا الحيوية AG للدعم التقني وجوليا ستروبل لتنقيح الكتابة المخطوطة. تم تنفيذ هذا العمل كجزء من مشروع APPL2.0 ويتم تمويلها جزئيا من قبل مقاطعة ذاتية الحكم لبوزن / بولزانو، إيطاليا وأبل اتحاد جنوب تيرول.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بروميد سيتيل تري ميثيل أمونيوم (CTAB)ApplichemA6284لتحضير الحمض النووي
Trishydroxymethylaminomethane (Tris)ApplichemA2264للوسائط والمخزن
المؤقت كلوريد الصوديوم (NaCl)ApplichemA2942للوسائط والمخزن المؤقت
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ملح ثنائي الصوديوم (NaEDTA)ApplichemA2937للوسائط والمخزن المؤقت
N-Lauroylsarcosin ملح الصوديومApplichemA7402لإعداد الحمض النووي
أسيتات الأمونيوم   ؛سيجما ألدريتش (فلوكا)9688لتحضير الحمض النووي
2-ميركابتو إيثانولApplichemA1108لتحضير الحمض
النووي الأيزوبروبانول (2-بروبانول)ApplichemA3928لتحضير الحمض النووي
الإيثانولسيجما ألدريتش (فلوكا)51976لتحضير الحمض
النووي RNAseApplichemA2760لتحضير
الحمض النوويالكلوروفورم: Isoamyl 24: 1ApplichemA1935لإعداد الحمض النووي
التدقيق اللغوي البوليميراز (على سبيل المثال < / em> iProof)Bio-Rad203433ل PCR
EcoRIThermo ScientificER0271لاستنساخ
SaliThermo ScientificER0641لاستنساخ
مجموعة تنقية الحمض النووي القائمة على العمود ( على سبيل المثال < / em> QIAquick)Qiagen28104لاستنساخ
كبريتات الكاناميسينApplichemA1493للاختيار الميكروبيولوجي
3-أمينو-1،2،4-تريازول (3-AT)سيجما-ألدريتشA8056لمقايسة التنشيط الذاتي
L-Arginine Monohydrochloride   ؛ApplichemA3680لثقافة الخميرة
L-Isoleucine   ؛ApplichemA3642لثقافة الخميرة
L-lysine Monohydrate ApplichemA3448لثقافة الخميرة
L-Methionine ApplichemA3897لثقافة الخميرة
L-Phenylalanine  ApplichemA3464لزراعة الخميرة
L-Threonine ApplichemA3946لثقافة الخميرة
L-Tyrosine   ؛ApplichemA3401لاستزراع الخميرة
L-UracileApplichemA0667لاستزراع الخميرة
L-Valine   ؛ApplichemA3406لزراعة الخميرة
L-Adenine Hemisulfate Salt ApplichemA1596لزراعة الخميرة
0.22 & micro ؛ م مرشح المسامSartorius16541للترشيح المعقم
L-Histidine MonohydrochlorideApplichemA3719لثقافة الخميرة
L-Leucine   ؛ApplichemA3496لثقافة الخميرة
L-Tryptophane ApplichemA3410لثقافة الخميرة
قاعدة النيتروجين الخميرة   ؛Sigma-Aldrich51483لزراعة الخميرة
D-Glucose Monohydrate ApplichemA1349لزراعة الخميرة
AgarFisher ScientificBP2641-1لزراعة الخميرة والبكتيريا
PeptoneApplichemA2208لزراعة الخميرة
البولي إيثيلين جلايكول 4000 (PEG)ApplichemA1249لتحويل الخميرة
ثنائي هيدرات خلات الليثيوم (LiOAc)ApplichemA3478لتحويل الخميرة
الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون  ApplichemA2159لتحويل الخميرة
الأجسام المضادة ضد علامة Lex-A ( على سبيل المثال < / em> منطقة ربط الحمض النووي المضادة للغة LexA)Millipore06-719لمجموعة اللطخة
الغربية البلازميد Miniprep (على سبيل المثال < / em> GenElute Plasmid Miniprep Kit)Sigma-AldrichPLN350لتنقية البلازميد من الخميرة والبكتيريا
الخرز الزجاجي المغسول بالحمضسيجما ألدريتشG8772لتنقية البلازميد من الخميرة
الأمبيسلين ملح الصوديومApplichemA0839للاختيار الميكروبيولوجي
مستخلص الخميرةApplichemA1552لثقافة الخميرة
جهاز طرد مركزي مكثف فراغ (على سبيل المثال < / em> مكثف 5301)EppendorfZ368245 (سيجما)لتحضير الحمض النووي
ناقلات الطعم ( على سبيل المثال < / em> pLexA-N)الأنظمة المزدوجةP01004
لناقلات فريسة Y2H ( على سبيل المثال < / م > pGAD-HA)الأنظمة المزدوجةP01004
لناقلات فريسة التحكم Y2H ( على سبيل المثال < / em> pLexA-p53)الأنظمة المزدوجةP01004
لناقلات طعم التحكم Y2H ( على سبيل المثال < / م > pACT-largeT)الأنظمة المزدوجةP01004ل Y2H
الكفاءة الكهربائية الإشريكية القولونية < / em> ( على سبيل المثال < / em> MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)InvitrogenC640003لاستنساخ
سلالة مراسل الخميرة (NMY51: MATahis3 & Delta ؛ 200 trp1-901 leu2-3،112 ade2 LYS2: :(lexAop) 4-HIS3 ura3: :(lexAop) 8-lacZ ade2: :(lexAop) 8-ADE2 GAL4 ، على سبيل المثال < / em> NMY51)DualsystemsP01004لفيلم
البارافين البلاستيكي Y2H ( على سبيل المثال < / em> Parafilm M)Sigma-AldrichP7793-1EAلزراعة الخميرة والبكتيريا
مانع تسرب الغاز المنفذ للغاز (على سبيل المثال < / em> BREATHseal)Greiner676 051لثقافة الخميرة
PCR Cycler (على سبيل المثال < / em> T100 Thermal Cycler)Bio-Rad1861096ل PCR
Cycler الكمي PCR ( على سبيل المثال < / em> CFX96 Touch نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي)Bio-Rad1855195لأجهزة
الطرد المركزي الدقيقة PCR الكمية (على سبيل المثال < / em> جهاز الطرد المركزي 5417 R) معداتالمختبر
العام Eppendorf 5417 Rأجهزة الطرد المركزي (على سبيل المثال< / em> أجهزة الطرد المركزي 5804 R)Eppendorf5804 Rمعدات المختبرات العامة
مياه خالية من النوكلياز (خالية من الحمض النووي ، خالية من الحمض النووي الريبي ، خالية من البروتياز)5Prime2500010لتفاعل البوليميراز المتسلسل وأعمال الحمض النووي
ScalpellSwann-Morton0301لتحضير الحمض
النووي مرشح معقم (0.22 & micro; m; Polyethersulfone)VWR-International514-0073 (رقم الكتالوج الأوروبي)لزراعة الخميرة والبكتيريا
أطباق بتري Ø ؛ 90 مم   ؛Greiner Bio-One633180لزراعة الخميرة والبكتيريا
أطباق بتري Ø 150 mm Greiner Bio-One639161لثقافة الخميرة
مقياس الضوء (على سبيل المثال < / em> مقياس الضوء الحيوي)550507804 Eppendorfلثقافة الخميرة
الضوء Cuvettesالعلامة التجارية759015لثقافة الخميرة
حمام مائي (على سبيل المثال < / em> حمام مائي Memmert WB7)MemmertWB7لتحويل الخميرة
معدات اللطخة الغربيةBio-Radمتنوعةللكشف عن البروتين
dNTPs5Prime2201210لاستنساخ
قوارير شاكر (Erlenmeyer) (100 مل ؛ 1,000 مل ؛ 2,000 مل) وسدادات قطنية قابلة للتنفس ( على سبيل المثال < / em> قوارير Duran Erlenmeyer ضيقة العنق)Sigma AldrichZ232793 ، Z232858 ، Z232866لثقافة الخميرة والبكتيريا
حاضنة اهتزاز ( على سبيل المثال < / em> GFL 3031)GFL3031لزراعة الخميرة والبكتيريا
حاضنةBinderKB 53 (E3.1)لزراعة الخميرة والبكتيريا
صانع الثلج (على سبيل المثال< / em> صانع الثلج IF 825) OmniwashIF 825معدات المختبرات العامة
0.2 مل و 1.5 مل و 2.0 مل قوارير تفاعل (بولي بروبيلين)Eppendorf0030.124.332 (0.2 مل) ؛ 0030.123.328 (1.5 مل) ؛ 0030.123.344 (2.0 مل) معداتالمختبرات العامة
الماصات وأطراف الماصات التي تستخدم لمرة واحدة (فولومينا مختلفة: 10 - 1,000 & micro; L)معدات المختبرات العامةالمتنوعة من Eppendorf
موزعSigma-AldrichSPR-L-S01لزراعة الخميرة والبكتيريا
شاكر دوامة (على سبيل المثال < / em> MS 3 Minishaker) IKA3617000معدات المختبر العامة
T4-LigaseThermo FisherEL0011لاستنساخ
الثلاجة (4 درجة ؛ ج) (على سبيل المثال < / em> Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4معدات المختبرات
العامة الفريزر (-20 درجة ؛ ج) (<م > على سبيل المثال < / م > Liebherr Comfort Professional G5216) معداتالمختبرات العامةLiebherrG5216
أسطوانة متدرجة (<م > على سبيل المثال < / م > العلامة التجارية)سيجما ألدريتشZ327352 ؛ Z327417. Z327441   معدات المختبرات العامة
الماصات المصلية (على سبيل المثال < / em> Fisherbrand)Thermo FisherS55701لزراعة الخميرة والبكتيريا
الماصات الميكانيكية ( على سبيل المثال < / em> Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000معدات المختبر العامة
Cuvettes للتثقيب الكهربائي (1 مم)المنتجات الحيوية الجزيئية5510-11لتحويل
البكتيرياالمثقور الكهربائي (على سبيل المثال< / em> Eporator)Eppendorf4309000019 لتحويل البكتيريا
نظام تصوير الجل واللطخة (على سبيل المثال < / em> نظام ChemiDoc MP)Bio-Rad1708280معدات المختبرات العامة
الطرد المركزي المخروطية (البولي بروبلين) (50 مل) VWR-International  ؛525-0403 (رقم الفهرس الأوروبي) معداتالمختبرات العامة
أنابيب الطرد المركزي المخروطية (البولي بروبيلين) (13 مل) BDFalcon352096معدات المختبرات العامة
Dithiothreitol (DTT ؛ 1 M) ThermoScientificP2325لربط
الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP ، < > على سبيل المثال < / em > محلول ATP (10 مل)) Ambion  ؛AM8110G (توزع بواسطة Thermo Scientific)للربط
مزيج التسرب بدون الهيستيدين والليوسين والتربتوفان والأدينين (DO, e.g.< / em> الخميرة الاصطناعية المتسربة من المكملات المتوسطة)Sigma-AldrichY2021 Sigma & nbsp;لثقافة الخميرة (مزيج جاهز)
مقياس أنابيب

المراجع

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22(2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835(2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423(2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة