وتتضمن هذه الدراسة أساليب للكشف عن الآثار المترتبة على مجموعة الأسماك نموذج التالية تغيير الجلد والأمعاء المجتمعات microbiome التكوين عن طريق المضادات الحيوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعني القاسم المشترك لاستخدام المضادات الحيوية في الطب أن فهم العواقب الناتجة على المضيف أمر حيوي. غالبا ما تقلل المضادات الحيوية من تنوع مجتمع الميكروبيوم المضيف وتغير تكوين المجتمع الميكروبي. تم ربط العديد من الأمراض مثل التهاب الأمعاء والقولون المرتبط بالمضادات الحيوية ومرض التهاب الأمعاء واضطرابات التمثيل الغذائي بالجراثيم المعطلة. يحتاج التفاعل المعقد بين المضيف والميكروبيوم والمضادات الحيوية إلى نموذج قابل للتتبع لدراسة تفاعلات المضيف والميكروبيوم. تعمل أسماك فقاريات المياه العذبة لدينا كنموذج مفيد للتحقيق في الجوانب العالمية لبنية الميكروبيوم المخاطي ووظيفته بالإضافة إلى تحليل تأثيرات المضيف اللاحقة من تغيير المجتمع الميكروبي. تشمل الطرق تحديات المضيف مثل الإصابة بمسببات الأمراض السمكية المعروفة ، والتعرض لميكروبات البراز أو التربة ، والإجهاد التناضحي ، وسمية النترات ، وتحليل النمو ، وقياس حركة الأمعاء. توضح هذه التقنيات نظاما نموذجيا مرنا ومفيدا للتحديد السريع للأنماط الظاهرية المضيفة.
المقدمة
وقد ثبت أن المضادات الحيوية يمكن أن يحدث خللا في microbiome الإنسان مما يؤدي إلى dysbiosis، وهذا يعني اختلال المجتمع الميكروبي. وقد تبين تغيير التركيبية والجراثيم بعد العلاج بالمضادات الحيوية لخفض التنوع في المجتمع، والحد من الأعضاء الرئيسيين، وتغيير التمثيل الغذائي للمجتمع، وخاصة في القناة الهضمية 1 و 2. اضطراب المضادات الحيوية من microbiome الأمعاء يمكن أن تقلل من مقاومة الاستعمار إلى المطثية العسيرة 3 و 4 و 5 السالمونيلا.
بالإضافة إلى ذلك، وقد تم ربط اختلال الجراثيم إلى تطوير العديد من المتلازمات والأمراض في البشر (على سبيل المثال، المرتبط المضادات الحيوية التهاب الأمعاء، وأمراض التهاب الأمعاء، واضطرابات التمثيل الغذائي، الخ.). كما نفذت على نطاق واسع المضادات الحيوية في الزراعة لتسريع عملية النمو فيالماشية والدواجن إنتاج 6. استخدام هذه الأدوات القوية لا يخلو من الآثار الجانبية، وهو ما يتضح في الارتفاع السريع للمقاومة المضادات الحيوية، فضلا عن الآثار المترتبة على microbiome تعطلت لديها مع مضيفه آهل بالسكان. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن واسعة الطيف استخدام المضادات الحيوية له عواقب طويلة الأمد على بنية ووظيفة الجراثيم، إلا أن الآثار الجانبية من microbiome تؤثر فسيولوجيا المضيف تعطل المضادات الحيوية هي الوحيدة التكهنات التي لم تكون معتمدة.
التفاعل بين المضيف، الجراثيم، والمضادات الحيوية لا يزال بعيدا عن أن يكون مفهوما بطريقة موجزة. لذلك، وهذا نموذج بسيط وأكثر لين العريكة هو مفيد لتسليط الضوء على نظام الثدييات معقدة للغاية. الأسطح المخاطية في البشر، بما في ذلك الأمعاء، تؤوي أعلى كثافة وتنوع الميكروبات، وأيضا الأكثر حميمية التفاعلات الميكروب المضيف. وmicrobiome المخاطية الجلد من العروض الأسماك الصورةمزايا everal كنظام نموذج. وعظميات (الأسماك العظمية) هي واحدة من أقدم سلالات تتباعد بالمعنى المقصود الفقاريات التي teleosts على حد سواء الفطرية والمكتسبة جهاز المناعة التي شاركت في تطور العلاقة مع المجتمعات البكتيرية المتعايشة 7. سهم جلد السمك العديد من الخصائص مع الأسطح نوع 1 المخاطية من الثدييات، مثل وظائف فسيولوجية، مكونات الحصانة، وترتيب الخلايا المنتجة للمخاط 8. الموقع الخارجي للسطح الأسماك الجلد المخاطي يقدم microbiome السهل التلاعب تجريبيا وعينة.
وسمكة البعوض الغربي، affinis الجمبوزيا (G. affinis)، سمكة نموذج التي استخدمت في الماضي لدراسة التزاوج وعلم السموم 9 و 10 و 11. ونظرا لصغر حجمها، وفرة السكان في البرية باعتبارها الأنواع الغازية، م تكلفة الرعاية inimal، وطبيعة هاردي، قمنا بتطوير G. affinis كنموذج microbiome المخاطية. وعلاوة على ذلك، الجمبوزيا مشاركة فسيولوجيا الولادة للعيش الشباب مع الثدييات ولود، والذي هو شائع في أنواع الأسماك. أكملنا الدراسة الأكثر شمولا في وقت جلد السمك الجراثيم العادية باستخدام 16S التنميط مع الجمبوزيا 12. أظهر المزيد من العمل ثلاثة آثار سلبية على المضيف بعد تعطل الجلد والأمعاء الجراثيم باستخدام واسع الطيف المضادات الحيوية 13.
تم فحص خمسة تأثيرات مختلفة في الأسماك بعد التعرض للمضادات الحيوية. صالح المضيف الأكثر راسخة من microbiome هو استبعاد منافسه من مسببات الأمراض. ومن المعروف أن العوامل المسببة للأمراض الأسماك الإدواردسيلة ictaluri أن يسبب تفشي التسمم الدموي المعوي في مزارع سمك السلور التجارية 14. وقد تبين أيضا E. ictaluri لإصابة قاتلة الزردالطبقة = "XREF"> 15 و 16 و 17 الجمبوزيا. والتحدي مع هذا الممرض من عمود الماء يمكن أن تكون بمثابة مقياس لالإقصاء. وعلى سبيل المقارنة إلى التعرض لمسببات الأمراض الفردية، أجريت البقاء على قيد الحياة خلال التعرض لكثافة عالية من الكائنات مختلطة أيضا. واستخدمت البراز والتربة العضوية الغنية كمصادر شيوعا التي تواجهها من المجتمعات الميكروبية.
دور أنشأ آخر يقوم المجتمع الأمعاء الجرثومي هو معالجة المواد الغذائية والطاقة الحصاد، مما يؤثر على امتصاص التغذية العام للمضيف. كمقياس الإجمالي للتغذية، وتمت مقارنة وزن الجسم السمك قبل وبعد شهر واحد من تغذيتها على نظام غذائي موحد. الأسماك المضادات الحيوية تعامل على أنها فقدت في المتوسط الوزن بينما الأسماك السيطرة في المتوسط اكتسبت الوزن خلال الشهر. آلية لهذا النقص في زيادة الوزن غير واضحة. أحد العوامل المساهمة المحتملة هو وقت العبور من المواد الغذائية في الأمعاء. وموتى GIوقد تم تكييف طريقة عنه lity من الزرد (آدم ريتش، جامعة ولاية نيويورك بروكبورت، اتصال شخصي) لتحديد وقت العبور. لم يتم حتى الآن تحديد ما إذا كانت الأسماك المعالجة مضاد حيوي وقت عبور تغير.
وهناك تحد مشترك من ذوي الخبرة في البيئة الطبيعية من قبل جميع الكائنات الحية، وخاصة الأسماك، هو الضغط الاسموزي. وقد ثبت الجمبوزيا على التكيف بسرعة عندما أكد حاد في تركيزات عالية من الملوحة 18. والمثير للدهشة، السمك مع microbiome المعدلة والمضادات الحيوية عرضت خفضت البقاء على قيد الحياة لضغوط كبيرة من الملح. آلية لهذا النمط الظاهري رواية قيد التحقيق. الإجهاد مشترك آخر على الحيوانات المائية، وخاصة في الأحواض المائية، وأشكال السامة من النيتروجين (الأمونيا والنترات والنتريت و). كان البقاء على قيد الحياة ضد نترات لا تختلف كثيرا بين الأسماك المعالجة المضادات الحيوية والسيطرة. الأساليب المقدمة في هذه المخطوطة يمكن استخدامها مع الجمبوزيا أو نموذج مماثل الأسماك الحية، مثل حمار وحشيالأسماك والميداكا، لقياس الظواهر في الأسماك بعد التلاعب التجريبية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت التجارب على الحيوانات فقط تحت الموافقة على بروتوكولات IACUC، مرقمة 14-05-05-1018-3-01، 13-04-29-1018-3-01، و14-04-17-1018-3-01.
1. مجموعة الحيوان، يعالج، والعناية الأخلاقية
- جمع الجمبوزيا affinis من موقع الميدان (دليل تحديد الهوية في http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) باستخدام تراجع صافي صغير ومكان إلى 19 دلاء L. استخدام الفحص البصري لتحديد الأنواع.
- الأسماك راحة ل1-2 د في دلو مع مياه البركة. بعد ذلك، نقل الأسماك إلى 76 أو 189 دبابة L الحوض مليئة نصف بركة المياه / مياه الصنبور نصف عند 25 درجة مئوية، الخلوية مع airstone محتدما. استخدام تراجع صافي صغير عند التعامل مع الأسماك كما أن تخل الحد الأدنى microbiome بشرتهم.
يجب أن تكون كثافة الأسماك لا تزيد عن 20 سمكة / 38 لتر ماء الحوض: ملاحظة. وتأقلم الأسماك إلى حوض السمك لا يقل عن 5 د قبل التجريب. - تغذية الأسماك على نظام يومي مع 5 ملغ من تقشر الغذائية في الأسماك. هوالأسماك دينار مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام.
2. التعرض للمضادات الحيوية الأولي للجميع التجارب
- رسم جميع الأسماك من كل تجربة من نفس الحوض، وضع في مجموعتين منفصلتين (المعالجة: تتعرض لالمضادات الحيوية والتحكم: غير معلن) في 19 دلاء L. البيانات السابقة التي تم جمعها تبين أن الأسماك في الحوض نفسه والمتجانس microbiomes الجلد التي لديها اختلاف بسيط في تركيبة المجتمع. 12
- وخلال التجارب، والحفاظ على الأسماك في 2 لتر من مياه البركة الاصطناعية (APW، 0.33 جم / لتر CaCl 2، 0.33 جم / لتر MgSO 4، 0.19 جم / لتر NaHCO 3) أن يتم تعقيمها التعقيم قبل الاستخدام.
- إعداد محلول المخزون ريفامبيسين المضادات الحيوية عن طريق إضافة 50 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). ريفامبيسين هو مضاد حيوي وتمثيلية واسعة الطيف التي هي غير سامة للأسماك. في البشر والفئران، وتوزع بشكل جيد في الأنسجة.
- من المخزون ريفامبيسين إدارة نهائيتركيز 25 ميكروغرام / مل في 2 لتر من APW التعرض للمضادات الحيوية من مجموعة الأسماك المعالجة لمدة 3 أيام. لاحظ أنه بعد 3 د، أرقام زروع الجلد البكتيرية تعود مماثلة لتلك التي من جلد السمك سابقة التجهيز.
- في موازاة ذلك، والحفاظ على مجموعة من الأسماك غير المعالجة في APW وإعطاء مبلغ مساو من DMSO (0.5 مل لكل لتر من APW) في عمود الماء ليكون بمثابة المجموعة الضابطة.
- كما تهدف التجارب لقياس الآثار المترتبة على microbiome المعدلة والمضادات الحيوية على الظواهر الأسماك، وذلك لتجنب الآثار مباشرة من المضادات الحيوية نفسها، بعد التعرض لمدة ثلاثة أيام للمضادات الحيوية (أو السيطرة) فترة والأسماك نقل في دلو مع 2 لتر من APW جديدة.
- استخدام فترة راحة 10 ساعة حتى يتم إزالة المضادات الحيوية من قبل الهيئات من الأسماك. قاعدة هذه المرة القضاء على التجارب التي تتعرض فيها الأسماك إلى 25 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية لمدة ثلاثة أيام. الموت ببطء الأسماك عن طريق القص الحبل الشوكي تليها تعطيل الدماغ، ثم تجانس كامل الجسم باستخدام طاحونة الأنسجة.
- تحديد وجود المضادات الحيوية عن طريق وضع 50 ميكرولتر من هذا التعليق بعد 0.2 ميكرون تصفية في وسط طبق بتري أجار. جعل ثقب لهذا التعليق من الضغط رأسا على عقب معقم 200 ميكرولتر ماصة في آغار، الذي يزيل المكونات الصغيرة.
- استخدام لوحات أجار مع 20 مل حجم يقاس من الآجار المغذي، وموزعة بالتساوي باستخدام قطعة من القطن مع كائن حي المؤشر، العصوية الرقيقة، وهي حساسة للريفامبيسين. الحصول على B. الرقيقة من الآجار المغذي المحتضنة في 25 ° CO / N واستخدام ممسحة قطنية للحصول على مستعمرة. مراقبة منطقة تثبيط بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية يدل على وجود المضادات الحيوية في أنسجة الأسماك.
3. Microbiome استخراج
- استخراج عينة microbiome البشرة من البشرة المخاطية الخارجية عن طريق وضع الأسماك في أنبوب مخروطي 15 مل العقيمة مليئة 2 مل PBST معقم (137 ملي ناالكلورين، 10 ملي فوسفات و 0.1٪ توين-20، ودرجة الحموضة 7.4) حل وvortexing لفي وضع 10 لمدة 1 دقيقة مع 10 ثانية بزيادات التوقف. المنظفات والملح في المخزن المؤقت يشجع حتى تشتت البكتيريا في الحل. تم العثور على نتائج مماثلة مع 0.85٪ المالحة ولكن خفض أعداد البكتيريا مع الماء النقي.
- نقل الأسماك من أنبوب مخروطي إلى دلو الانتعاش. فتك استخراج الجلد هي عادة ما تكون أقل من 10٪. إما، وتحليل تعليق البكتيرية في أنبوب فور استخراج أو بيليه البكتيريا عن طريق زيادة ونقصان 2 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 15000 x ج ومخزن في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
ملاحظة: كل ثقافة والتحليلات الكيميائية الحيوية هي على الفور. الحمض النووي أو استخراج البروتين يمكن أن يكون من العينات المجمدة. - للحصول على عينة الأمعاء microbiome، أولا ضع السمك في طبق بتري معقمة. الموت ببطء الأسماك عن طريق قطع الحبل الشوكي العنقي مباشرة خلف الرأس مع مقص جراحي، تليها بخعثم تطهير خارجيا الجسم مع 70٪ مناديل الايثانول.
- بعد التشريح، وإزالة الأمعاء بأكملها عن طريق خفض بعد المريء وقبل فتحة الشرج.
- قطع القناة الهضمية إلى أقسام صغيرة 1-2 ملم في الطول وإخضاع جميع أقسام إلى قسمين مل حل PBST في أنبوب مخروطي الشكل. بعد vortexing لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف في أنبوب نظيف آخر (أخذ الحيطة والحذر لعدم وضع المقاطع الأمعاء).
ملاحظة: طاف يحتوي على بكتيريا الأمعاء المستخرج التي يمكن أن تستخدم إما لتحليل المباشرة أو مكعبات من الطريقة السابقة الذكر للعينات الجلد.
إعداد نموذج 4. العدوى وحمام من اى مرض
- الحصول على سلالة المعدية الإدواردسيلة ictaluri (E. ictaluri) والحفاظ على الثقافة المخزنة في -80 درجة مئوية. سلالة 93-146 المستخدمة في هذه الدراسة، معزولة من سمك السلور مصاب، تم الحصول عليها من الأقسام لورانس، كلية الطب البيطري، جامعة ولاية ميسيسيبي.
- تعزيز بنية الشعالأسهم حزب العدالة والتنمية E. ictaluri على تسمى هاء ictaluri وسائل الإعلام (EIM) وسائل الاعلام انتقائية والتفاضلية أجار 19 إلى ثقافة البكتيريا واحتضان لمدة 2 د حتى 27 درجة مئوية.
- نقل مستعمرة معزولة نقية من الثقافة وتطعيم قارورة 150 مل تحتوي على 40 مل من المرق المغذي (ملحوظة؛ 5 جم / لتر ببتون، 4 جم / لتر لحوم البقر استخراج). مكان قارورة في شاكر وضعت في 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 د حتى 27 درجة مئوية.
- بعد مرور فترة الحضانة، وتمييع عينة من ثقافة في PBST لقراءة مطياف 0.2 OD في 650 نانومتر لمعايرة E. ثقافة ictaluri لكميات الجرعة المعدية المطلوب.
- نقل المقبل على حد سواء المعالجة (بعد 3 د من التعرض للمضادات الحيوية) ومجموعات الأسماك غير المعالجة في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على 130 مل من الماء بركة اصطناعية جديدة، أو APW لنحو 10 ساعة لإزالة عقار من أنسجة الأسماك.
- ثم من كلا الفريقين، ونقل مرة أخرى في كل السمك في 8 اوقية (الاونصة) أكواب بلاستيكية تحتوي على 130 مل من APW نظيفة.
- إعطاء كل الأسماك جرعة قاتلة تحتوي على 2.8 × 10 6 خلية / مل من E. ثقافة ictaluri في APW (حمام نموذج العدوى) وتحتفظ بها في 27 درجة مئوية الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- بعد الحمام ictaluri E.، نقل الأسماك بشكل فردي في الكؤوس الجديدة مع 130 مل من APW.
- بعد استبدال المياه، وفيات الأسماك قياسية خلال مدة أسبوع. لا يتم تغذية الأسماك خلال هذه الفترة. وعلى النقيض من سمك السلور، الجمبوزيا لا تظهر أي علامات خارجية للعدوى، وبالتالي فإنه من الضروري استخدام الفتك بمثابة نقطة النهاية التجريبية.
5. التحدي متعدد المكروبات مع البراز والتربة
- البراز العلاج
- الحصول على براز الإنسان جديدة من المتطوعين الأصحاء الذين الموضوع لم تتلق المضادات الحيوية في الأسبوعين الماضيين، وذلك باستخدام قفازات معقمة وعقيمة أنبوب 50 مل المخروطية.
- على جمع، وجمع البراز في كيس بلاستيكية معقمة، ثم نقل إلى العقيمة 15 مل جأنبوب onical. إنشاء تركيز الأسهم من خلال تعليق البراز في PBST لإعطاء محلول المخزون من 500-800 ملغ / مل. هذا الخليط سميك هو أفضل لنقل باستخدام 1 مل أو أكبر البلاستيك ماصة التي تم قطع في أسفل مع مقص العقيمة بحيث افتتاح أكبر.
- بعد التعرض للمضادات الحيوية الأولي من مجموعة الأسماك غير المعالجة المعالجة والسيطرة، وفصل في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على تعليق البراز في تركيزات النهائي إما 15 ملغ / مل أو 10 ملغ / مل في APW مع إجمالي حجم 130 مل. عقد أكواب في حاضنة عند 25 درجة مئوية.
- وفيات الأسماك قياسية خلال التعرض البراز عن طريق الملاحظة وثيقة أكثر من 2 د.
- معالجة التربة
- جمع 1-2 كغ من التربة السطحية العضوية الغنية (يجب أن يحتوي على أعلى كثافة وتنوع الميكروبات) حوالي 7-15 سم أسفل في عمق ووضع في وعاء من البلاستيك نظيفة. لاحظ أن التربة يجب أن تستخدم خلال يومين بعد جمع.
- رهيبctly بعد فترة التعرض الأولية، فصل المجموعتين من المضادات الحيوية المعالجة وغير المعالجة الأسماك في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على 18.2 غرام من التربة في 130 مل من APW. خلط التربة في بئر الماء باليد قبل إضافة الأسماك. معظم الجسيمات لا تعليق والبقاء في قاع الكأس.
- كشف السمك لمدة 3 د عند 25 درجة مئوية وتسجل أي وفيات.
6. التناضحي التحدي الإجهاد
- بعد العلاج تليها 10 ساعة فترة راحة كما هو موضح أعلاه، تفريد السمك في أكواب منفصلة تحتوي على كلوريد الصوديوم في 17.5 ملغ / مل (300 ملم) في 150 مل من APW. هذا هو نصف الملوحة نموذجية من مياه البحر، وهي ليست قاتلة بالكامل (<50٪) للسيطرة على الأسماك ولكن غير مرهقة بشدة، الأمر الذي يتطلب التنظيم الاسموزي فعال.
- مراقبة وفيات الأسماك خلال مدة 36 ساعة.
7. نترات سمية التحدي
- الأسماك راحة لمدة 10 ساعة بعد المعارض للمضادات الحيويةلدى عودتهم، والأسماك ثم منفصلة في أكواب فردية تحتوي على تركيز نترات الصوديوم إما 10 ملغ / مل (118 ملم) أو 17.5 ملغ / مل (206 ملم) في 130 مل من APW.
- سجل لوفيات أكثر من 4 د لجرعة منخفضة و1 د لجرعة عالية.
8. تحليل نمو السمك الفردي أو المجمعة
- كاملة 3 د التعرض المضادات الحيوية أو السيطرة الفترة كمجموعات في الدلاء.
- للفرد، وملء 8 أوقية كوب الستايروفوم مع 150 مل APW لكل منهما، نقل سمكة الفردية في الكأس وتسجيل وزن الجسم الكلي للتقييم الأولي.
- أكرر للجميع الأسماك في كل من المجموعات المعالجة وغير المعالجة. استخدام أكواب الفلين الأبيض بدلا من الأكواب البلاستيكية واضحة لأن الأسماك لا تأكل عندما تكون في أكواب واضحة.
- تغذية الأسماك يوميا مع اتباع نظام غذائي القياسية اثنين من الكريات في الأسماك. واستخدمت الكريات بدلا من رقائق لأن الكريات لها التباين المنخفض في كتلة الفردية (3.53 ± 0.42 ملغ لكل منهما، أو٪ الاختلاف 8)، resultinز في الأسماك تلقي كميات مماثلة من المواد الغذائية. مراقبة استهلاك عن طريق تسجيل مرئي الكريات غير مأكول. وكانت معدلات الاستهلاك عادة فوق 80٪.
- في نهاية كل أسبوع على مدى 4 أسابيع، وتحديد الوزن الأسماك. إعداد كوب جديد مع APW جديدة، وضع على التوازن، ومن ثم تسجيل الوزن. ثم، صب الأسماك إلى تراجع صافي من الكأس الأصلي ونقل في الكأس الجديد، الذي ثم وزنه مرة أخرى. لا يتم التعامل مع الأسماك لتجنب الإجهاد.
- لالمجموعات، ضع 2 لتر من APW في دلو 19 L والفارغة نطاق واسع. حفاظ على الأسماك معا في كلا المجموعتين عند نقل في دلاء جديدة APW ثم تسجيل الوزن الإجمالي المجموعة. رقم قياسي الوزن مجموعة الأسماك كل أسبوع على مدى فترة زمنية الشهر نقل إلى دلو جديد.
9. الوتر عبور الزمن
- استخدام المسمى فلوريسئين 70 كيلو دالتون ديكستران انيوني. لا يتم هضم ديكستران بشكل كبير، وكبير جدا بحيث لا يمكن امتصاصها عبر طبقة الأمعاء، وبالتالي مرور وقياس وقت العبور من خلال القناة الهضمية.تأسست ديكستران المسمى في الأسماك.
- في العقيمة 1.7 مل أنبوب، إضافة 360 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات معقمة و 52 ملغ من الجيلاتين (13٪ محلول)، ووضع أنبوب على كتلة الحرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين ويذوب تماما.
- طحن رقائق ذهبية الغذاء إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة، وإضافة 40 ملغ من هذا المسحوق إلى أنبوب، جنبا إلى جنب مع 20 ميكرولتر من زيت السمك. بعد الاختلاط، إضافة 1.6 ملغ من FITC-ديكستران.
- الاستغناء عن الخليط السائل الساخن إلى 20 قطرات ميكرولتر على بارافيلم على مقاعد البدلاء المختبر، والسماح لهم بسرعة باردة وتصلبها. قطرات يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 4 د قبل أن يصبح من الصعب جدا بالنسبة للأسماك لتناول الطعام. متجر قطرات في الثلاجة عن طريق وضع بارافيلم على نصف طبق بتري، التي يتم بعد ذلك طرح على الماء المعقم داخل وعاء من البلاستيك مختوم، والتي تحافظ على قطرات ترطيب.
- قبل الرضاعة، قطرات الربع إلى أقسام باستخدام شفرة حلاقة. تأقلم الأسماك إلى Styroأكواب رغوة بشكل فردي لمدة 2 أيام بدون تغذية (ملاحظة: استخدمت فقط الأسماك السيطرة غير معلن). وضع أربعة أرباع من المواد الغذائية في الكأس مع السمك، ومراقبة الأسماك لمدة 30 دقيقة لكيفية العديد من القطع من الغذاء الذي كل أكل.
- لبدء فترة الرصد، ونقل الأسماك بشكل فردي في الكؤوس مع 80 مل من APW باستخدام تراجع صافي. كل ح 2، عباب بلطف APW من جهة، ومن ثم اتخاذ مل عينة 1 وتخزينها في المسمى 1.7 مل أنبوب في 4 درجات مئوية. أخذ عينات لمدة 36 ساعة.
- مضان قياسية، مع معمل مضان، من جميع العينات في نفس الوقت بعد الانتهاء من الفحص. وضع كامل 1 مل العينة إلى كوفيت، وتسجيل مضان تقاس باستخدام الإثارة في 495 نانومتر، والانبعاثات في 520 نانومتر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويمثل الرسم التخطيطي الشامل للنظام التجريبي تستخدم لدراسة آثار المضيف الأسماك من التعرض للمضادات الحيوية 13 في الشكل 1A ويتضمن تقنية لاستخراج الجلد (الشكل 1B) والقناة الهضمية (الشكل 1C) microbiomes من الأسماك. وقد تم اختيار ثلاثة أيام كفترة للمضادات الحيوية من التعرض لبيانات السابق يكشف أنه على الرغم من انخفاض إجمالي عدد الجلد زروع في العلاج في وقت مبكر، وإعادتها إلى ما قبل ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتطلب بعض التحديات فترة راحة في APW نظيفة بعد العلاج بالمضادات الحيوية للدواء إلى أن تستنفد في أنسجة الأسماك. إذا تم تخطي فترة راحة ثم وجود المضادات الحيوية يمكن أن يربك النتائج، وخصوصا عندما ينطوي على فحص التعرض للبكتيريا. من أجل دراسة الآثار من تكوين microbiome تغير دون تغييرات كبيرة في عدد من الميكروبات على المضيف، والتجارب الأولية مراقبة تكوين microbiome (16S التنميط أو كله تسلسل الجينوم)، والكثافة السكانية (16S الكميات عبر QPCR) أثناء التعرض للمضادات الحيوية سيكون مطلوب. بينم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
< p class = 'jove_content'>تم تمويل هذا المشروع جزئيا من قبل FAST (فريق أعضاء هيئة التدريس والطلاب) جائزة TPP و JMC من EURECA (مركز تعزيز الخبرات البحثية الجامعية والأنشطة الإبداعية) في جامعة ولاية سام هيوستن.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ريفامبيسين | كالبيوكيم | 557303-1GM | |
| نترات الصوديوم | سيجما ألدريتش | S5506 | |
| مسمى الفلورسين 70 كيلو دالتون ديكستران أنيوني | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Calbiochem | 6500-OP | تذوب في الماء لصنع PBS |
المراجع
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476(2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22(2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086(2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
