أجريت جميع التجارب في الجسم الحي (7221.3-1-006 / 15) وفقا للتشريع الألماني على حماية الحيوانات ودليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية مختبر، المجلس الوطني للبحوث).
1. مسك العام للحيوانات
- إجراء التجارب مع الفئران الذكور ساعة SKH1-HR تتراوح أعمارهم بين 4 إلى 6 أسابيع. استخدام الحيوانات وزنها ما بين 20 و 25 غراما.
- الحفاظ على الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض وتحت ظروف قياسية من 24 إلى 26 درجة مئوية، والرطوبة النسبية حوالي 60٪، مع وصول مستمر إلى الماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
- إبقاء ما يصل إلى خمسة ذكور الحيوانات في قفص واحد. توفير الفراش والمواد الإثرائية خلال السكن في الحيوانات لرفاههم.
2. بترتيب مسبق من الحيوانات
- وزن الماوس وتحميل المخدرات منها (على سبيل المثال، والقنب، 5 مز / كغ من وزن الجسم (وزن الجسم)) في حقنة الأنسولين. إدارة دقيقة المخدرات 30 قبل الاستقراء الجلطة.
- من خلال عقد رقبة الفأر بين الإبهام والسبابة وذيل الفأر مع الاصبع الصغير، وتمتد الحيوان وحقن المخدرات داخل الصفاق (IP) في الربع الأيسر السفلي من البطن. وضع الحيوان مرة أخرى في قفص لمدة 15 دقيقة.
- إعداد التخدير مع الكيتامين (90 ملغ / كغ من وزن الجسم) وزيلازين (25 ملغ / كغ من وزن الجسم). 15 دقيقة قبل تحريض الجلطة، تخدير الماوس. ضع الماوس في القفص، وسحب الذيل قليلا، وحقن التخدير الملكية الفكرية مع حقنة الأنسولين.
- وضع الماوس مرة أخرى في قفص حتى بداية التخدير. للتحقق من التخدير الكافي، قرصة الذيل مع ملقط.
- تحميل 0.05 مل من ديفروستيد فلوريسئين ديكستران المسمى ثيوسيانات (FITC-ديكستران، 5٪، و 150 كيلو دالتون) في حقنة الأنسولين. في حين ملء الحقنة، وضمان أن تبقى أي فقاعات الهواء، لأن intravenousl حتى الصغيرةص (د) فقاعات الهواء -administered يمكن أن تكون قاتلة للحيوان.
- ضع الماوس تخدير على طبق من التدفئة في موقف لأسفل. ضبط لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- وضع مرهم العين على القرنية من الفأرة. تطهير الجلد واستخدام أدوات معقمة.
- غرزة اثنين من خيوط البولي بروبيلين 7/0 إلى حافة الجمجمة والذيلية من الأذن اليمنى. وضع غرز أقرب إلى الحافة، وكما الأقرب إلى قاعدة ممكن (الشكل 1B).
- تحويل الماوس لموقف الظهرية. إصلاح جميع الساقين إلى منصة acrylglass باستخدام شرائط لاصقة. ربط الخيط تحت أسنان الأمامية ووضع الرأس في عطف ظهري عن طريق الالتزام خياطة لacrylglass مع شرائط لاصقة.
- نقل من الحيوان على منصة تحت مجهر تشريحي العملية. استخدام 16X التكبير.
3. إعداد اليسار الوداجي الوريد وحقن FITC-ديكستران
ملاحظة: لهيئة التصنيع العسكريroscopy من الأذن اليمنى، وإعداد حبل الوريد الأيسر.
- باستخدام مشرط، إنشاء شق 5 ملم في الجلد في الجانب الأيسر من الرقبة في اتجاه القحف الذيلية. تشريح الأنسجة تحت الجلد مع microforceps وmicroscissors. أما السفن العابرة ligate مع البوليستر 8/0 الغرز أو مع الكهربي.
- تحرير الوريد من البرانية وذلك باستخدام microforceps وmicroscissors دون لمس السفينة.
- استخدام حقنة الأنسولين التي أعدت للحقن صبغة الفلورسنت. بعناية والاستيلاء على جدار الوعاء الدموي مع microforceps، دون ثقب الوريد. اختراق جدار الوعاء الدموي منفوخ مع حقنة وحقن الرابع FITC-ديكستران.
- وقف النزيف بعد سحب الحقنة باستخدام قطعة قطن. تجنب الدم وصبغ تلوث الأذن.
4. تحديد المواقع من الأذن اليمنى لحيوي داخلي الإسفار المجهر
- نقل الحيوانات على لوحة التدفئة إلى acrylglass جonstruction مع فتحة لوحة التدفئة وطائرة 0.5 سم عالية لتحديد المواقع الأذن.
- إصلاح وجه الحيوان لأسفل على لوحة التدفئة باستخدام شرائط لاصقة. وضع الغضروف قوي نسبيا ومحدب في قاعدة الأذن بجانب الطائرة 0.5 سم عالية للأذن (الشكل 1B) بحيث الجزء القمي من الأذن يمكن وضعه شقة على متن الطائرة.
- إضافة قطرة واحدة من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى الطائرة acrylglass من أجل وضع الأذن. وضع الأذن اليمنى، مع الغرز ترتيبها مسبقا على الجانب البطني مقعر بها إلى أسفل، على انخفاض بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم. باستخدام قطعة قطن، واستيعاب قطرة من كلوريد الصوديوم والسماح القوات الشعرية نعلق الطائرة الأذن إلى acrylglass.
- الشريط الغرز إلى acrylglass لتحديد موقف من الأذن.
- إضافة قطرة واحدة من 0.9٪ درجة حرارة الغرفة كلوريد الصوديوم إلى الجانب الظهري محدب من الأذن. وضع بعناية ساترة واحدة (0.5 سم القطر) على الأذن دون ضغط الأوعية القاعدية دخول عشرالبريد الأذن. باستخدام قطعة قطن، وإزالة كلوريد الصوديوم قدر الإمكان من تحت ساترة من أجل تقليل المسافة بين ساترة والأوعية الهدف الأذن.
5. حيوي داخلي الإسفار المجهري والجلطة تحريض الأذن اليمنى
- ضبط المجهر مضان حيوي داخلي التصور FITC-ديكستران (450-490 نانومتر، FT: 510، LP: 520). استخدام مصباح الزئبق 100-W متغير كمصدر ضوء. توصيل عالية الدقة، بالأسود والأبيض كاميرا CCD لمسجل DVD.
- نقل الحيوانات على acrylglass تحتوي على لوحة التدفئة مع الأذن خطف الثابتة إلى مكتب المجهر مضان حيوي داخلي.
- باستخدام 20X التكبير (20X / 0.95 الفتحة العددية) و 20٪ شدة الضوء، والبحث عن وعاء الوريدية 50 - 60 ميكرون في القطر ومع تدفق الدم تقدمي من 400-600 ميكرون / ثانية.
- إضافة قطرة واحدة من الماء درجة حرارة الغرفة إلى ساترة لغمر المياه للmagnificatio 63Xالهدف ن (63X / 0.95 الفتحة العددية). استخدام المحاقن مع قطر قنية 1 ملم ووضع قطرة على هدف المجهر. يضاف الماء ما يكفي للاتصال ساترة والهدف مع قطرة الماء.
- مباشرة بعد تطبيق قطرة الماء، بدء تسجيل السفينة في 20 ثانية مع شدة الضوء 20٪ لقياس حاليا من تدفق قطر والدم.
- بدء خثرة تحريض 5 دقائق بعد حقن FITC-ديكستران. لهذا الغرض، ورفع شدة الضوء إلى 100٪.
- خلال تحريض الجلطة، أغلق فتحة المجهر ل2 ثانية خلال مدة 30 ق للتحقق من تدفق الدم. في حالة استمرار تدفق الدم، وفتح فتحة مرة أخرى. في حالة توقف تدفق الدم، ومراقبة السفينة لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: يصنف السفينة كما المغطي إذا كان التدفق لا يزال قائما لمدة 30 ثانية أو أكثر أو إذا تدفق الدم retrogradely. إذا بدأ تدفق الدم منتصب المشية مرة أخرى، فتح تماما الفتحة وcontin رق تحريض خثرة حتى يحدث انسداد الأوعية كما هو موضح أعلاه. خلال تحريض خثرة في وقت مبكر، تأكد من أن الأوقات التي تم إغلاق الفتحة للتحقق من تدفق الدم قصيرة قدر الإمكان من أجل الحفاظ على استمرار تقريبا برنامج التحصين الموسع في الإضاءة. وفي وقت لاحق، خلال نمو الجلطة، وperfused لالسفينة مع أقل صبغة الفلورسنت، لذلك يمكن ملاحظتها بشكل مستمر. - اختيار وحبس 5 سفن في الأذن. يحدد الوقت الحث خثرة تحت المجهر لحوالي 1 ساعة بعد الحقن من FITC-ديكستران.
6. أنشطة المتابعة
- إجراء إغلاق الجرح في الرقبة باستخدام البولي بروبلين عبر الجلد 6/0 الغرز.
- خلال التعافي من التخدير، ووضع الماوس مرة أخرى في قفص وتدفئة الحيوان باستخدام الأشعة تحت الحمراء.
- نقل البيانات المسجلة من مسجل دي في دي لبرنامج يسمح للقياس قطر السفن وسرعة تدفق الدم.
_title "> 7. فحص الأذن اليسرى
- السماح للحيوان على التعافي والقضاء على كل حقن FITC-ديكستران لمدة 48 ساعة.
- أعد الخطوات المذكورة أعلاه، وهذه المرة إعداد حبل الوريد الأيمن والأذن اليسرى.
8. الأنسجة Asservation
- بعد الفحص المجهري مضان حيوي داخلي من الأذن اليسرى، عينة 0.5 مل من الدم من الوريد الضفيرة خلف المقلة للعين باستخدام الزجاج الشعرية. بعناية اختراق زاوية الجفن الداخلية مع حركات الشد، حتى يتدفق الدم الوريدي من خلال الشعيرات الدموية. جمع التحقيق في أنبوب الدم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
- بعد اخذ عينات من الدم، التضحية الحيوانية عن طريق حقن 500 ملغ / كغ من وزن الجسم الكيتامين في الوريد الذيل.
- عدد خلايا الدم باستخدام محلل أمراض الدم لإجراء تقييم كمي لكريات الدم البيضاء، خلايا الدم الحمراء، thrombocytes، الهيموجلوبين، والهيماتوكريت.
- أجهزة الطرد المركزي الدم EDTA المتبقية في 2500 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 مفي. ماصة وتجميد بلازما الدم لإجراء مزيد من التحقيقات.
- باستخدام مقص، وقطع الأذين واصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد للفحص النسيجي.