مقالة منهجية

تحليل متشابك التحوير من ذبابة الفاكهة خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

DOI:

10.3791/55176

⸱

فبراير 10, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تظهر كيفية تحديد عدد والتوزيع المكاني للمناطق نشطة متشابك في المستقبلات الضوئية البطن ذبابة الفاكهة، سلط الضوء مع الواسمات الجزيئية المشفرة وراثيا، وتعديل على بعد التعرض لفترات طويلة للضوء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي لديه قدرة ملحوظة على التكيف والاستجابة للمؤثرات المختلفة. ويتحقق هذا التعديل العصبي إلى حد كبير من خلال اللدونة على مستوى متشابك. المنطقة النشطة (أ-ي) هي المنطقة في الغشاء قبل المشبكي التي تتوسط الافراج عن العصبي ويتكون من مجموعة كثيفة من البروتينات سقالة. AZS من ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) المستقبلات الضوئية تخضع لإعادة الجزيئي بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعي. وبالتالي فإن مستوى نشاط الخلايا العصبية يمكن إعادة ترتيب التركيب الجزيئي للمن الالف إلى الياء والمساهمة في تنظيم الانتاج وظيفية.

بدءا من التعرض للضوء إعداد انشاء لالمناعية، تفاصيل هذا البروتوكول كيفية تحديد عدد، والتوزيع المكاني، ومستوى تمركز جزيئات متشابك في AZS في المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة. عن طريق تحليل الصور البرمجtware، تم تحديد مجموعات من المكون AZ-تنصهر GFP Bruchpilot لكل R8 مبصرة (R8) محطة محور عصبي. تم تعيين الكشف عن البقع Bruchpilot تلقائيا إلى محاور R8 الفردية. لحساب توزيع تردد بقعة على طول المحور، نفذنا البرنامج المساعد البرمجيات المخصصة. وقد تم تحديد بداية نقطة لكل محور عصبي ونقطة النهاية يدويا، وكان من المتوقع على الخط الذي يربط بين بداية ونقطة النهاية موقف كل بقعة Bruchpilot. إلى جانب عدد من مجموعات Bruchpilot، ونحن أيضا كميا مستوى تمركز Bruchpilot-GFP ضمن مجموعات. وتعكس هذه القياسات بالتفصيل ديناميات متشابك حل مكانيا في الخلايا العصبية واحدة تحت ظروف بيئية مختلفة للمؤثرات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشكيل وظيفة متشابك يساهم في قدرة ملحوظة في الجهاز العصبي للرد على وجه التحديد أو التكيف مع تغير المحفزات البيئية. ضبط قبل المشبكي إطلاق سراح الحويصلة احتمال هي طريقة واحدة للسيطرة على قوة متشابك 1. متشابك الافراج عن حويصلة يحدث في المنطقة النشطة (AZ)، وهي منطقة متخصصة للغشاء قبل المشبكي 2. يتميز من الألف إلى الياء من قبل كاسيت بروتينات معينة 3، 4. معظم البروتينات التي تسهم في التجمع من الالف إلى الياء والحفظ جدا في الديدان الخيطية والحشرات والثدييات 5. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن مستوى نشاط الخلايا العصبية وينظم التركيب الجزيئي من الألف إلى الياء، وهذا بدوره يساهم في تنظيم الانتاج وظيفية على حد سواء في المختبر والمجراة 6، 7،> 8. لقد وجدنا سابقا أن AZS مبصرة تخضع إعادة الجزيئي في ذبابة الفاكهة بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعية 9. في هذه الحالة، لاحظنا أن عدد Bruchpilot (بدر) -positive AZS تم تخفيض في المحاور مبصرة.

البروتينات بدر / CAST / عائلة الايائل هي اللبنات الأساسية للAZS في الفقاريات واللافقاريات نقاط الاشتباك العصبي 10. في المسوخ BRP ذبابة الفاكهة، أثار إطلاق سراح الحويصلة يتم منعها 11 و 12. بقايا الأحماض الأمينية C-محطة 17 من بدر ضرورية لتجميع حويصلة متشابك في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) 13، 14. وأظهرت هذه الدراسات على الدور المحوري لهذا الجزيء في المؤسسة من الألف إلى الياء وظيفة. مع أداة الوراثية التي تم تطويرها مؤخرا، متشابك توصيف مع إعادة التركيب (STAR)، بدريمكن ملاحظتها في الجسم الحي في أنواع معينة من الخلايا، في مستويات التعبير الذاتية وعلى قرار المشبك واحد 15. هذه الأداة يجعل من الممكن لتقييم ديناميات الذاتية من نقاط الاشتباك العصبي كميا في الجهاز العصبي المركزي معقدة.

كانت هناك العديد من الدراسات بما في ذلك التحديد الكمي المشبك استنادا إلى بيانات تم الحصول عليها من الفحص المجهري متحد البؤر. تم تقييم التعديلات متشابك من خلال قياس الطول، المنطقة، وحجم، وكثافة وتحصي عدد استنادا إلى تطبيقات البرمجيات المتطورة. على سبيل المثال، يوفر يماغيج مجانية طريقة القياس الكمي لمجموع مساحة متشابك والتدابير كثافة متشابك في ذبابة الفاكهة NMJ 16. وقد تم تقدير عدد المواقع colocalization من علامات قبل وبعد المشبكي باستخدام البرنامج المساعد "نقاط ومحلل" متاح على منصة برنامج ImageJ 17. بدلا من ذلك، متعدد قدم المساواةبرنامج يستند إلى adigm العددية بيئة الحوسبة، المشبك الكاشف (SYND)، ويمكن تتبع تلقائيا التشعبات من الخلايا العصبية المسماة مع علامة فلوري، ثم يقيس مستويات بروتين متشابك بوصفها وظيفة من المسافة من جسم الخلية 18. وقد تم تصميم البرنامج متشابك تحليل نقاط و(SynPAnal)، لتحليل السريع للصور 2D من الخلايا العصبية المكتسبة من متحد البؤر المجهري أو الفلورسنت. وتتمثل المهمة الرئيسية لهذا البرنامج هي الكمي التلقائي والسريع في كثافة وشدة من البروتين نقاط و19. مؤخرا، تم إنشاء القائم على التعلم خوارزمية الكشف المشبك التلقائي لتقدير عدد متشابك في 3D 20، والاستفادة من البرنامج المساعد التصور-3D تحليل (Vaa3D) 21.

صورة التجارية برامج التحليل أيضا أدوات قوية لالتحديد الكمي متشابك. على سبيل المثال، fluorescentlyتم كميا مستقبلات الناقل العصبي المسمى أو مكون من الالف إلى الياء قبل المشبكي في ثلاثة أبعاد مع الدقة المشبك واحد في C. ايليجانس 22 أو نظام ذبابة الفاكهة حاسة الشم 23، 24، مما سمح لمئات من نقاط الاشتباك العصبي إلى أن تتسم بسرعة في عينة واحدة.

هنا، فإننا نقدم وسيلة من برنامج تحليل صورة مخصصة المكونات في تنفيذها في عدة نموذج بيئة الحوسبة العددية التي تسمح لتحليل جوانب شبه تلقائيا متعددة من AZS، بما في ذلك عددهم والتوزيع ومستوى التخصيب من المكونات الجزيئية لل الألف إلى الياء. وهكذا، هذا التحليل المعقد سمح لنا لتقييم ديناميات مكونات متشابك في محطات محوار تحت ظروف بيئية مختلفة. نحن التحقيق في تأثير التعرض للضوء على نقاط الاشتباك العصبي الناتج من خلايا مستقبلة للضوء ذبابة الكبار. يتم تنفيذ الإجراء في ثلاث خطوات: 1)استعدادا لالتعرض للضوء، 2) تشريح، المناعية والتصوير متحد البؤر، و3) تحليل الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراءات التجريبية المبينة في هذا البروتوكول تنطوي على العمل بشكل حصري مع ذبابة الفاكهة ولا تخضع لقوانين الرفق بالحيوان في ألمانيا واليابان.

1. شروط التعرض للضوء

  1. إعداد الذباب التي تحمل sensless-flippase (السيناتور-FLP) وbruchpilot-FRT-إيقاف-FRT-GFP (بدر-بينه وبين GFP) 15 لتصور بدر-GFP في مبصرة الخلايا العصبية R8 (R8s). تم تعديل بدر ترميز موضع الجينومية داخل الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) لتوليد هذا البناء بدر-بينه وبين GFP. في الذباب يحمل هذا BAC تعديل تعبير عن بدر-GFP تحت سيطرة تسلسل التنظيمية الذاتية، ولكن تقتصر على المستقبلات الضوئية R8 بعد sensless-flippase إزالة بوساطة من الكاسيت FRT-إيقاف-FRT 15. لاحظ أن السيناتور-FLP نادرا ما تعبر عن flippase في R7S.
  2. الحفاظ على الذباب في لى 12 ساعةGHT / 12 ح دورة الظلام (LD) عند 25 درجة مئوية من مرحلة اليرقة حتى eclosion (الشكل 1A).
  3. جمع الذباب 0-6 ساعة بعد eclosion ووضعها في قارورة جديدة تحتوي على المواد الغذائية الطاير.
  4. تعيين قارورة الى حامل شفافة مصنوعة من راتنج الأكريليك مع ثلاث خطوات (ارتفاع 41 سم، وقاعدة من 21 سم، بسمك 4 سم وارتفاعه 13 سم لكل خطوة) (الشكل 1B).
  5. ضبط المسافة بين الرف ولوحة الصمام لتوفير الإضاءة مع كثافة متوسطة من 1000 لوكس باستخدام ضوء متر الرقمية (الشكل 1C).
  6. الحفاظ على الذباب ل1-3 د تحت أحد الشروط التالية: ظلام مستمر (DD)، 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام (LD)، أو ضوء ثابت (LL) عند 25 درجة مئوية في حاضنة صغيرة (الشكلان 1A و1C).

2. تشريح، المناعية والتصوير

  1. تشريح أدمغة الطاير مع ملقط، اصلاحها مع 4٪ فوrmaldehyde وimmunostain مع الأجسام المضادة الأولية ضد Chaoptin (01:50)، والأجسام المضادة الثاني لرؤية خلايا مستقبلة للضوء على أساس الإجراءات التجريبية السابقة 25. موجز:
    1. تحضير 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (0.1٪ PBT). يستخدم هذا الحل لتحسين اختراق الأنسجة الأجسام المضادة.
    2. تخدير الذباب على وسادة CO 2، فرز الوراثي الصحيح ونقلها إلى طبق بتري مليئة 0.1٪ PBT.
    3. عصا ملقط تحت خرطوم وسحب قبالة اليمين واليسار عيون على التوالي مع ملقط الأخرى.
    4. إزالة خرطوم والقصبة الهوائية التي تعلق على الدماغ.
    5. نقل الدماغ مع ملقط في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 150 ميكرولتر من 0.1٪ PBT في RT.
    6. في غضون 10 دقيقة من تكرار 2.1.3 - 2.1.5 للحصول على أكبر عدد ممكن من العقول وقت ممكن.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من 16٪ الفورمالديهايد في أنبوب ومزيج من قبل pipetting.
    8. احتضان العقول في تثبيتي في الغرفةدرجة الحرارة لمدة 50 دقيقة.
    9. يغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette، مع إيلاء اهتمام لمغادرة العقول في الأنبوب.
    10. بعد غسل الماضي، وإزالة PBT 0.1٪ وإضافة محلول الأجسام المضادة الأولية، أعدت على النحو التالي: إضافة إلى 196 ميكرولتر من 0.3٪ PBT (0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) 4 ميكرولتر من مكافحة Chaoptin الأجسام المضادة (التخفيف النهائي 1 : 50) لرؤية خلايا مستقبلة للضوء.
    11. احتضان العقول في حل الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N.
    12. غسل 3X مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette.
    13. بعد غسل الماضي، وإزالة PBT 0.1٪ وإضافة 200 ميكرولتر من PBT 0.3٪ تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية.
    14. احتضان في الظلام في 4 درجات CO / N.
    15. يغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette.
  2. لتركيب، ووضع قطرتين الصغيرة (2 ميكرولتر لكل منهما) من وسط تصاعد مع micropipette في وسط شريحة المجهر في حوالي 2 سم distaالامتحانات التنافسية الوطنية عن بعضها البعض.
  3. وضع اثنين coverslips، واحدة على كل قطرة وترك فجوة ضيقة بين لل coverslips ما يقرب من 0.2 مم.
  4. ضع 15 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة على رأس ساترة وإضافة أدمغة مع micropipette في المتوسطة المتزايدة.
  5. تحت المجهر تشريح، ضع العقول مع الجانب بطني حتى في تضييق الفجوة بين لل coverslips اثنين (الشكل 2).
  6. وضع ساترة على رأس وختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة لإصلاح العينة (الشكل 2).
  7. الحصول على صور من أدمغة مع المجهر متحد البؤر. استخدام عدسة 63X الغمر النفط موضوعية (1.4 NA) وتقريب رقمي 2.6X. توليد أكثر من 20 المقاطع البصرية من ثاني النخاع العقدة البصرية مع حجم خطوة من 0.5 ميكرون.

3. الجيل من البقع، كائنات السطحية، بدء نقاط ونهاية نقاط

  1. لتحديد عدد وتنقيبibution ومستوى تمركز بدر-GFP نقاط و، فتح كومة التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر في صورة برامج التحليل وإعادة تكوين صور 3D (الشكل 3A). لاحظ أن الخطوة في هذه الدراسة أجريت مع Imaris.
  2. التعرف على نقاط وبدر-GFP من قبل وحدة كشف النقاط لكل محطة محور عصبي R8.
    1. حدد "إضافة البقع الجديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. حدد محطة محور عصبي R8 في النخاع يدويا.
    3. حدد القناة مصدر الإشارة بدر-GFP.
      ملاحظة: تم immunolabeled وR7 وR8 محاور مبصرة مع مكافحة Chaoptin (الشكل 3A). فقط R8، على الرغم من يحتوي بدر-GFP نقاط ووبالتالي يمكن تمييزها بسهولة (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد نقطة نهاية R8 من ترقق المحاور المعادية Chaoptin إيجابية عند نقطة دخول طبقة النخاع M3.
    4. تعيين يقدر تي قطر XYس 0.35 ميكرون والتحقق من "الطرح الخلفية" في كشف النقاط.
    5. حدد "الجودة" في نوع فلتر وفلتر تلقائيا. ثم انقر فوق إنهاء.
    6. كرر من 3.2.1 تي 3.2.5 لمحاور R الأخرى (الشكل 3B).
  3. لقياس مستوى تمركز بدر-GFP في محاور R8، إنشاء كائنات السطح مع وظيفة "السطحية" لكل محور عصبي (الشكل 3C).
    1. حدد "إضافة السطوح جديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. ثم حدد محطات محوار R8 في النخاع يدويا.
    3. حدد القناة مصدر من المستقبلات الضوئية.
    4. التحقق من خارج "السلس".
    5. حدد "الكثافة المطلقة" في العتبة.
    6. تحقق "تمكين". "بذور نقاط القطر" هو 0.5 ميكرون.
    7. حدد تصفية نوع "الجودة" و "عدد voxels"، ومن ثم تصفية ومحأتوماتيكيا.
    8. انتقل إلى "تحرير" وحذف أجزاء من الأسطح التي تم إنشاؤها على محاور أخرى غير مثيرة للاهتمام.
    9. كرر من 3.3.1 - 3.3.8 لمحاور R الأخرى (الشكل 3C). توقفت ملاحظة بعض الكائنات السطح بسبب ركاكة وإشارة ضعيفة في المستقبلات الضوئية في طبقة M2، لكنها ما زالت تعتبر كائن واحد من البداية إلى نقطة النهاية.
  4. لتحديد توزيع نقاط وبدر-GFP طول كل الخلايا العصبية في النخاع neuropil، وتحديد بداية نقطة ونقطة النهاية مع وظيفة نقطة قياس (الشكل 3D).
    1. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" وحدد "سطح القطعة" لتتقاطع مع الجزء العلوي من الكائنات السطح.
    2. وضع النقاط القياس على رأس الأشياء السطحية من المحاور R في طبقة M1 في النظام. وتعرف هذه الآن عن البدء في نقطة (الشكل 3D).
    3. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة".ثم حدد "تحرير" وحدد "سطح القطعة" لتتقاطع مع الجزء السفلي من الكائنات السطح.
    4. وضع النقاط القياس على الجزء السفلي من الأشياء السطحية من المحاور R في طبقة M3 في النظام. وتعرف هذه الآن كما في نهاية نقاط (الشكل 3D).
  5. لطرح إشارة الخلفية من القناة GFP، إنشاء كائنات السطح، والبقع، بدء نقاط والنقاط النهائية لمدة محاور R في M6 طبقة (الشكل 3E).
    1. حدد "إضافة السطوح جديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. ثم حدد محطة محور عصبي R7 بين طبقة M5 و M6 يدويا.
    3. حدد القناة مصدر مبصرة.
    4. التحقق من خارج "السلس".
    5. حدد "الكثافة المطلقة" في العتبة.
    6. حدد تصفية نوع "الجودة" و "عدد voxels"، ثم تصفية تلقائيا.
    7. حدد "إضافة البقع الجديدة"،.
    8. حدد "تخطي إنشاء التلقائي، تعديل يدويا".
    9. حدد "مركز القطعة"، وتضيف بقعة في المنطقة الداخلية من وجوه سطح المتولدة من 3.5.1 - 3.5.6.
    10. كرر من 3.5.1 - 3.5.9 لآخر محطة محور عصبي R7.
    11. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" ووضع النقاط القياس على أعلى من الأشياء السطحية اثنين من غيض من محطة محور عصبي R7 في طبقة M6. وتعرف هذه الآن عن البدء في نقاط.
    12. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" ووضع النقاط القياس على الجزء السفلي من الكائنات سطح اثنين من غيض من محطة محور عصبي R7 في طبقة M6. وتعرف هذه الآن كما في نهاية نقاط (الشكل 3E).

4. حساب من عدد من البقع، توزيع التردد بقعة ومستوى التخصيب من بدر-GFP مع صورة مخصصة تحليل البيانات البرمجيات

  1. نسخ ملف"XtquantifySynapseSNR.m" و "وظائف" مجلد إلى مجلد ماتلاب Imaris XT. لاحظ أن الحساب في هذه الدراسة أجريت مع البرنامج المساعد مخصصة تنفذ في Matlab. تحميل البرنامج المساعد من موقع ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. فتح مجموعة بيانات مع ن البقع، ن الأسطح والأشياء 2 نقطة القياس، تحتوي على كل نقاط القياس ن (المعد 3،1-3،4). يحدد أول كائن نقطة قياس المواقف بداية لجميع المحاور. يحدد الكائن نقطة القياس الثاني ونهاية الموقف من جميع المحاور. تحتاج كل الكائنات نقطة القياس لدينا نفس العدد من النقاط القياس (وهذا هو عدد من المحاور).
  3. تنفيذ معالجة الصور >> حسب الطلب> atsushis كشف المشبك مقابل 6.
  4. تحقق الفوقية وتغيير أحجام بكسل في صورة برامج التحليل في حال كان غير صحيح.
  5. اختر قناة لالأداء الإقتصادي الأداءormance تحليل كثافة مناطق البقع والمناطق هيولي (القناة مع بدر-GFP).
  6. تحديد اسم الملف لتصدير النتائج.
  7. تحديد عدد من صناديق وطول محور عصبي في المئة. أدخل عدد من صناديق ب "10" ومجموعة من صناديق باسم "100٪" (الأرقام 4A و 4B).
  8. تحديد مناطق البقع والمناطق هيولية أخرى لتحليل تمركز بدر-GFP. دائرة نصف قطرها أدخل البقع ب "0.35 ميكرون" وعرض المنطقة ب "50 ميكرون" المحيطة بها. يحدد دائرة نصف قطرها البقع المنطقة للإشارة نقاط وGFP (0.35 ميكرون قطر، تركز على punctum واحد). عرض المنطقة المحيطة بها يحدد المنطقة للإشارة GFP في منطقة هيولي (50 ميكرون قطر، تركز على punctum، ولكن فقط بما في ذلك R8 وباستثناء جميع المجالات بقعة في السيتوبلازم) (الأرقام 4A و 4C).
  9. الانتظار حتى تتم معالجة كافة أقنعة الخلايا العصبيةوتصديرها كملفات PDF (أرقام 4B و 4C) والجدول CSV لمزيد من التحليل في جدول بيانات. ويشمل الجدول CSV عدد من النقاط، ومتوسط ​​كثافة إشارة في "منطقة هيولي" والحد الأقصى لكثافة إشارة في "بقعة" في كل حاوية لجميع محاور R8.
  10. فتح مجموعة بيانات أعد 3.5 لالطرح للإشارة الخلفية.
  11. أداء معالجة الصور كما هو موضح 4،3-4،9.
  12. حساب متوسط عدد وتوزيع نقاط وبدر-GFP في جدول بيانات (أرقام 4D و4E).
  13. حساب متوسط تمركز إشارة بدر-GFP في جدول بيانات من قبل نسبة من متوسط كثافة في "منطقة هيولي" مقسوما على أقصى قدر من الشدة في "بقعة" تطرح في متوسط الشدة في إشارة الخلفية (الشكل 4F) .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العين مجمع ذبابة الفاكهة تضم ~ 780 ommatidia، تحتوي كل منها على ثمانية أنواع من المستقبلات الضوئية (R1-8). R7 وR8 مشروع محاور لالعقدة البصرية الثانية، النخاع، حيث أنها تشكل نقاط الاشتباك العصبي في طبقات M6 و M3، على التوالي 26. لدراسة تأثير التعرض لفترات طويلة لضوء على التركيب الجزيئي للمبصرة مناطق R8 النشطة، اتخذنا الاستفادة من طريقة نجمة 15. مستويات التعبير الذاتية للبدر وfluorescently المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وأظهرت لنا كيفية إعداد ظروف الإضاءة لفضح الذباب لشدة الضوء متساوية. نحن كميا ليس فقط على عدد من نقاط وعلامة متشابك ولكن يمكن أيضا حل مكانيا كثافة نقاط الاشتباك العصبي على طول المحاور وقياس مستوى تمركز البروتين علامة في المناطق هيولية. هذه التقييمات ثلاثة تسمح لنا لتقييم تفاصيل ديناميات متشابك على مستوى الخلايا العصبية واحد في ظروف بيئية مختلفة. يمكن تكييفها لدينا بروتوكول للبروتينات متشابك مختلفة ولكن أيضا على أي البيانات التي تحتوي على إشارات منقط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لT. Stürner للتصحيحات مفيدة، المناقشات والتعليقات على المخطوطة. SL Zipursky لتوفير مخزون ذبابة. M Schölling لأداء معالجة الصور. تم تنفيذ جزء من تحليل الصور في مختبر A. Kakita ل. وأيد هذا العمل من قبل الكسندر فون همبولت مؤسسة وJSPS المنح الدراسية للبحوث في الخارج (AS)، JSPS الزملاء (SH-S)، المنح التحتية المعونة من أجل البدء (24800024)، على مناطق المبتكرة (25110713)، موتشيدا، تاكيدا، اينامورى، دايتشي سانكيو-، أسس توراي (TS)، DZNE التمويل الأساسي (GT) ومرفق DZNE ضوء المجهر (CM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قارورةHightech ، اليابانMKC-20
PlugThermo Fisher Sciehtific ، الولايات المتحدة الأمريكيةAS-275
رف شفاف مخصص مصنوع من راتنج الأكريليك   ؛شركة شين شين ، اليابانارتفاع 41 سم ، قاعدة 21 سم ، سمك 4 سم وارتفاع 13 سم لكل خطوة
حاضنة باردةميتسوبيشي إلكتريك ، اليابانCN-40A
لوحة LEDMISUMI ، اليابانLEDXC170-W
مقياس الإضاءة الرقميCEMDT-1301
Fly padTokken ، اليابانTK-HA03-S
طبق بتري (35 × 10 مم)Greiner Bio-One International ، ألمانيا627102
PBS tabletTakara ، اليابانT900
Triton X-100واكو ، اليابان160-24751
Dumont # 5 FulpsFine ScienceTools 11251-20
1.5 مل أنبوبSarstedt ، ألمانياA. 152X
الفورمالديهايد 16٪NEM ، اليابان3152
Pipetman P-200GilsonF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
الأجسام المضادة للشاوبتينDSHB24B10
Alexa568 مترافقة الأجسام المضادة للفأرLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Mounting MediumVector Laboratories، Inc.H-1000
(76 × 26 مم)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel BV & Co. KG ، ألمانيا
غطاء (18 × 18 مم ، 0.17 مم)زايس ، ألمانيا474030-9000-000
المجاهر الصناعيةأوليمبوس ، اليابانSZ61-C-SET
إضاءة مجهر ستيريوأوليمبوس ، اليابانKL 1600 LED
الفحص المجهري متحد البؤرZeiss ، ألمانياLSM780
ImarisBitplane ، سويسراالإصدار 7.6.4 أو أعلى
MatlabThe MathWorks، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية
Excel for Mac & nbsp ؛مايكروسوفت
شريحة مجهر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
  2. Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
  3. Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
  4. Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
  5. Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
  6. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
  7. Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
  8. Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
  9. Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
  10. Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
  11. Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
  12. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  13. Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
  14. Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
  15. Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
  16. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
  17. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  18. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  19. Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298(2014).
  20. Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).
  21. Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
  22. Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
  23. Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
  24. Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726(2014).
  25. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  26. Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
  27. Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732(2013).
  28. Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
  29. Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  30. Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Bruchpilot

مقالات ذات صلة