مقالة منهجية

كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في

18.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55185

⸱

يونيو 22, 2017

 ,  , 
1State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, 2Pathobiological Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University

في هذه المقالة

ملخص

وترد تفاصيل عن كيفية رسم الخرائط كتل مع تسلسل الجينوم تسلسل الجينوم بأكمله يمكن استخدامها لتحديد الجينات المقاومة للأدوية في توكسوبلاسما غونديي وكيف يمكن التحقق من ذلك مع نظام كريسبر / Cas9 التي تعدل بكفاءة الهدف الجيني، في هذه الحالة الجينات المقاومة للمخدرات.

الملخص

ترتبط المعرفة العلمية ارتباطا جوهريا بالتكنولوجيات والأساليب المتاحة. ستقدم هذه المقالة طريقتين تسمحان بالتحديد والتحقق من جينات مقاومة للأدوية في طفيلي أبيكومبلكسان توكسوبلاسما غونديي ، طريقة رسم خريطة الكميات الكمية (كتل) باستخدام الخريطة الوراثية المستندة إلى الجينوم (وس)، والطريقة من متفاوتة منتظمة منتظمة متداخلة قصيرة متناظرة (كريسبر) / Cas9 القائم على تحرير الجينات. النهج من كتل رسم الخرائط يسمح واحد لاختبار ما إذا كان هناك علاقة بين المنطقة الجينية (ق) والنمط الظاهري. هناك حاجة إلى مجموعتين من البيانات لتشغيل مسح كتل، وهي خريطة وراثية تستند إلى سلالة الصليب المؤتلف ونمط ظاهري قابل للقياس يتم تقييمه في كل من سلالة هذا الصليب. ثم يتم تنسيق مجموعات البيانات هذه لتكون متوافقة مع برنامج R / كتل الذي يولد مسح كتل لتحديد ارتباط كبير مع النمط الظاهري. على الرغم من أن هذا يمكن أن يضييق كثيرا البحث ثمن بين المرشحين المحتملين، كتلس تمتد المناطق التي تحتوي على عدد من الجينات التي الجينات السببية تحتاج إلى تحديد. وكان وجود وس من سلالة حاسمة لتحديد الطفرة المقاومة للمخدرات السببية على مستوى الجينات. وبمجرد تحديدها، يمكن التحقق من طفرة مرشح عن طريق التلاعب الجيني من الطفيليات الحساسة المخدرات. الأسلوب الأكثر سهولة وكفاءة لتعديل وراثيا T. غونديي هو نظام كريسبر / Cas9. يتكون هذا النظام من مكونين فقط مشفرين على بلازميد واحد، و رنا دليل واحد (غرنا) يحتوي على تسلسل 20 بب مكمل للهدف الجيني و إندوسلياز Cas9 الذي يولد كسر الحمض النووي المزدوج حبلا (دسب) في الهدف، إصلاح الذي يسمح لإدراج أو حذف تسلسل حول موقع الكسر. توفر هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لاستخدام كريسبر / Cas9 استنادا إلى أدوات التحرير الجينوم للتحقق من الجين المسؤول عن المقاومة سينفونجين وبناء الطفيليات المعدلة وراثيا.

المقدمة

نطاق المضيف يحدد مدى انتشار الطفيليات. بعض الطفيليات لديها متطلبات محددة جدا المضيف الذي يحد من المنطقة التي تم العثور عليها، والبعض الآخر من العموميين. واحد من هذا القائد هو توكسوبلاسما غونديي ( T. غونديي) . تم العثور على هذا الطفيلي في جميع أنحاء العالم لأنها يمكن أن تصيب جميع الثدييات والعديد من الطيور. البشر هم أيضا عرضة، ويقدر أن ما يقرب من 1/3 من سكان العالم قد أصيبوا. لحسن الحظ، استجابة مناعية قوية تسيطر عادة على نمو الطفيلي، ولكن في الحالات التي يتعرض فيها الجهاز المناعي للخطر الطفيلي يمكن أن تنمو دون رادع وتسبب الأمراض، وغالبا ما الدماغية. كما أن هذا الطفيلي يمكن أن يسبب أمراض خلقية إذا أصيبت النساء اللاتي لم يصبن بهن أثناء الحمل حيث يفتقرن إلى الذاكرة المناعية للحد من انتشار الطفيلي بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، هناك عبء داء المقوسات العين التي يمكن أن تؤدي إلى فقدان البصر 1 . لهذه رياسوأصبح نس T. غونديي محور الدراسة، وبسبب العديد من الأساليب الجزيئية المتقدمة لدراستها، نموذجا للطفيليات أبيكومبلكسان. هناك طريقتان ستتم مناقشتهما هنا هي رسم الخرائط الكمية لوكاتوس (كتل) وتجمعاتها المتداخلة المتداخلة بشكل منتظم (كريسر) / تحرير الجين Cas9. كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 التحرير هي، على التوالي، والنهج الجينية إلى الأمام والعكس التي استخدمت في الدراسات السابقة لتحديد و / أو توصيف الجينات الفوعة T. غونديي . هنا، يتم الجمع بين هذه الطرق لتحديد وتأكيد وظيفة سينفونجين المقاومة (الجينات شنف) الجين، TgME49_290860، و أورثولوغس (المشروح كما SNR1 ) 2 .

على الرغم من أن T. غونديي يمكن أن تصيب مجموعة واسعة من المضيفين وسيطة، يجب أن تمر من خلال إصابة الخلايا الظهارية في الأمعاء من الجنين لإكمال دورة الحياة. القطط هي المضيفين النهائي للطفيلي حيث sيتم إنتاج المراحل الخارجية وإعادة التركيب الجيني عن طريق الانقسام الاختزالي يحدث. لإجراء دراسة كتل يجب على المرء أن ينشئ تعبيرا وراثيا، وفي حالة التوكسوبلازما يعني ذلك تمرير سلالتين مختلفتين من الطفيليات تختلف في سمة ظاهرية، البقع الوالدية، من خلال القط لإنتاج النسل المؤتلف 3 . قبل أن يتغذى على القطط، يتم إجراء سلالات الأبوية مقاومة للأدوية منفصلة للسماح لتحديد أكثر كفاءة من ريكومبينانتس عن طريق اختيار المخدرات مزدوجة من سلالة 4 . وقد استخدمت ثلاثة أدوية في T. غونديي لهذا الغرض؛ فلوروديوكسيريبوس (فودر) الذي هو أوراسيل فوسفهريبوسيل ترانسفيراز ( أوبرت ) هو الجينات المقاومة 5 ، أدينوسين أرابينوسيد (أرا) الذي أدينوسين كيناز ( أك ) هو الجينات المقاومة 6 ، و سينفونجين (شنف) الذي كان الجين المقاومة غير معروف 7 . وكانت العديد من الصلبان الوراثيةتم إنشاؤها ل T. غونديي ، ولكن فقط سلالة 24 من ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب تم تنميط الجيني باستخدام تسلسل الجينوم كله (وس) 8 . وهذا فتح إمكانية رسم الخرائط وتحديد الجينات المقاومة شنف باستخدام هذا الصليب كما تم جعل الوالد فاند مقاومة سينفونجين عن طريق الطفرات الكيميائية من سلالة فاند-فند-شنف المخدرات الحساسة، وجينوم مرجع فاند تم تسلسل باستخدام VAND- وبالتالي فإن سلالة ال شنف تسمح بتحدید جمیع التشکیلات المتعددة بین وس وسلف و الجینوم المرجعي ل فاند-سنف، بما في ذلك الطفرات الموروثة فاند-سنف الوالدیة التي جعلت بعض من سلالة سینفونجین مقاومة.

من أجل التعرف على تعدد الأشكال النيوكليوتيدات السببية (سنب) في نسل ص نسل، ويمكن استخدام العديد من المصادر المفتوحة المصدر حسابية لتحليل البيانات. لإنشاء الخريطة الوراثية ل ME49-فودر ص X فاند-شنف ص عبر ريدهورس تم تطوير البرنامج 9 المجموعة التي تستخدم التحالفات وس من الآباء والأمهات والنسل للكشف بدقة المواقف الجينومية من عمليات الانتقال الجيني. ويمكن بعد ذلك الجمع بين هذه المعلومات الخرائط مع البيانات المظهرية (شنف ص في النسل) لتنسيق مجموعة بيانات متوافقة مع حزمة 'كتل' 10 في برنامج البرمجة الإحصائية R حيث يمكن إجراء مسح كتل للكشف عن مكان كبير مرتبط مع النمط الظاهري. لتحديد سنب السببية تقع داخل موضع كتل، وقراءة وس من سلالة يمكن أن تكون محاذاة بشكل فردي إلى جينومونجين الجينوم فاند الحساسة باستخدام برنامج المحاذاة بووتي 2 11 التي يمكن أن يسمى سنبس باستخدام برنامج المتصل البديل mpileup2snp فارسكان 12 . باستخدام هذه الأشكال، يمكن بعد ذلك فحص مكان كتل من أجل تعدد الأشكال الموجودة في شنف r ولكن ليسفي ذرية ال [سنف]. مع سنب السببية التي تم تحديدها في منطقة الترميز من الجينات، والتعديل الوراثي للجين مرشح شنف R يمكن أن يؤديها في سلالة شنف للتحقق من وظيفة مقاومة المخدرات.

وقد تم مؤخرا إنشاء نظام تحرير الجينوم كريسبر / Cas9 في توكسوبلاسما 13 ، التي أضافت أدوات هامة لاستكشاف بيولوجيا معقدة من هذا الطفيلي، وخاصة للدراسات الجينية في سلالات غير المختبر تكييفها. بسبب نشاط غير متناظرة للغاية الانضمام (نهيج) النشاط في خلايا توكسوبلازما وت، تعديل الجينوم المستهدفة من الصعب تحقيق منذ دنا تم إدخالها بشكل خارجي يتم دمجها بشكل عشوائي إلى الجينوم في وتيرة عالية للغاية 14 . لزيادة معدل نجاح تعديل محدد الموضع، وقد استخدمت نهج مختلفة لزيادة كفاءة إعادة التركيب مثلي و / أو خفض ثنشاط نهيج 15 ، 16 . واحد من هذه النهج هو نظام كريسبر / Cas9. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن نظام كريسبر / Cas9 فعال في إدخال تعديلات خاصة بالموقع ويسهل تصميمها 13 و 17 و 18 . وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن استخدامها في أي سلالة التوكسوبلازما دون تعديل إضافي للطفيلي 13 ، 19 .

نظام كريسبر / Cas9 نشأ من نظام المناعة التكيفية من العقدية بيوجينيس ، والذي يستخدم للدفاع عن غزو العناصر الوراثية المتنقلة مثل فاجيس 20 ، 21 ، 22 . يستخدم هذا النظام الحمض النووي الريبي الحمض النووي الموجهة إنزيم انزيم Cas9 لإدخال مزدوج حبلا كسر الحمض النووي (دسب) في الهدف، والذي هو في وقت لاحق ريباإريد إما من قبل نيج عرضة للخطر لتعطيل الجينات المستهدفة من خلال طفرات إندل قصيرة، أو عن طريق التناظر توجيه إعادة التركيب لتغيير موضع الهدف بالضبط كما صممت 23 ، 24 . يتم تحديد خصوصية الهدف من قبل جزيء الحمض النووي الريبي صغير يدعى رنا دليل واحد (غرنا)، والذي يحتوي على تصميم 20 نت التسلسل بشكل فردي يحتوي على 100٪ التماثل إلى الحمض النووي الهدف 22 . يحتوي جزيء الحمض الريبي النووي النقال أيضا على التواقيع المعترف بها من قبل Cas9 التي توجه نوكلياز إلى الموقع المستهدف، والذي يتضمن بروتوسباسر المتاخمة العزر خاص (بام، تسلسل هو 'نغ') 25 ، 26 . ولذلك، فإن جزيء الحمض النووي الريبي وتسلسل بام تعمل معا لتحديد موقع الانقسام Cas9 في الجينوم. يمكن للمرء بسهولة تغيير تسلسل الحمض النووي الريبي لاستهداف مواقع مختلفة للانقسام.

عندما تم تطوير نظام كريسر / Cas9 لأول مرة في توكسوبلاسما، واحد البلازميد معربا عن نوكلياز Cas9 وجزيء الحمض الريبي النووي النقال استخدمت لإدخال دسب في موقع الاستهداف 13 ، 17 . وقد تبين أن نظام كريسبر / Cas9 يزيد بشكل كبير من كفاءة تعديل الجينوم موقع معين، وليس فقط عن طريق إعادة التركيب مثلي، ولكن أيضا التكامل غير متماثل من الحمض النووي خارجي 13 . يفعل ذلك في سلالات ويلديب التي تحتوي على نشاط نهيج. ولذلك، يمكن استخدام هذا النظام في الأساس أي سلالة التوكسوبلازما لتحرير الجينوم كفاءة. في تجربة نموذجية، والبلازميد كريسبر محددة الهدف وشظية الحمض النووي المستخدمة لتعديل الهدف هي ترانزفكتد المشارك في الطفيليات. إذا كان جزء من الحمض النووي المستخدمة لتعديل الهدف يحتوي على متواليات متجانسة إلى مكان الهدف، إعادة التركيب مثلي يمكن استخدامها لإصلاح دسب التي قدمها كريسبر / Cas9 للسماح بتعديل دقيق للهدف. من ناحية أخرى، إذا كانت إنتلا يحتوي جزء الحمض النووي المستنسخة على تسلسل مثلي، فإنه لا يزال من الممكن دمجها في موقع الاستهداف كريسبر / Cas9. وغالبا ما يستخدم هذا الأخير لتعطيل الجينات عن طريق إدراج علامات اختيار أو تكملة المسوخ في لوكسي التي تسمح الاختيار السلبي 13 . هنا هو المكان SNR1 بمثابة مثال لإظهار كيف كريسبر / Cas9 يمكن استخدامها لتعطيل الجينات وتوليد الطفيليات المعدلة وراثيا.

البروتوكول

1. تقييم شنف r في ذرية ME49-فودر r × فاند-شنف ص الصليب

ملاحظة: T. غونديي هو الطفيليات داخل الخلايا ملزم ومرحلة تاتشيزويت ينمو بسهولة في زراعة الأنسجة.

  1. لزراعة الطفيلي T. غونديي ، والحفاظ عليها في متموجة الإنسان القلفة الخلايا الليفية (هف) ثقافة أحادية الطبقة المصنفة إلى قوارير T25 مع وسائل الإعلام المتوسطة النسر دولميكو (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (فبس) (D10 وسائل الإعلام) في 37 درجة C و 5٪ كو 2 .
    ملاحظة: انظر بروتوكول 1.1 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .
  2. لاختبار استنساخ النسل الفردية لمقاومة سينفونجين، وتنمو كل استنساخ لارتفاع كثافة الطفيليات في قارورة ثقافة T25 هف لمدة 2-3 د، حتى أن غالبية الطفيليات تبدأ في ليز الخلايا المضيفة.
  3. كشط أحادي الطبقة مع مكشطة الخلية وتمرير حل الطفيليات من خلال حقنة 10 مل / 22 G إبرة حادة 2-3X رo ليز الخلايا المضيفة الافراج عن الطفيليات. الحل يمكن سحبها مرة أخرى إلى حقنة لممرات إبرة متعددة.
  4. تصفية حل الطفيليات في أنبوب مخروطي جديد من خلال غشاء مع حجم المسام من 3 ميكرون لإزالة خلايا هف والحطام الخلوية.
  5. عد الطفيليات على عدادة الكريات وحدد عدد الطفيليات لكل مليلتر.
  6. باستخدام بيبيتور، تمرير 2.5 × 10 5 الطفيليات إلى T25 هف ثقافة جديدة قارورة تحتوي على وسائل الإعلام D10 مع تركيز 0.3 ميكرومتر العمل من المخدرات سينفونجين.
  7. تنمو الطفيليات عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 7-10 د.
  8. يسجل ذرية للنمط الظاهري للنمو في المخدرات سينفونجين. مراقبة أحادي الطبقة تحت مقلوب المرحلة النقيض من المجهر ويسجل 0 لأي نمو (سينفونجين الحساسة)، يسجل 1 للنمو وتحلل أحادي الطبقة (مقاومة سينفونجين).
    ملاحظة: انظر بروتوكول 1.8 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .

2. Rأون كتل المسح الضوئي من شنف r النمط الظاهري في R / كتل

ملاحظة: انظر البروتوكول 2 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .

  1. قم بتثبيت برنامج لغة البرمجة R على كمبيوتر محلي. انظر 27 .
  2. تشغيل R وتثبيت الحزمة 'كتل'. إما القيام بذلك من خيار واجهة واجهة المستخدم الرسومية R 'حزم-> تثبيت حزمة (ق)'، أو تشغيل الأمر التالي من سطر الأوامر R (أول ">" رمز في كل مثال يدل على بداية الأمر، لا أن يكون نسخ):
    > install.packages ( "QTL")
    ملاحظة: مرة واحدة R و "كتل" تم تثبيت حزمة، هناك طريقتان لتشغيل R / كتل، من سطر الأوامر R أو باستخدام برنامج واجهة المستخدم الرسومية (غوي) يسمى J / كتل 28 : انظر 29 لتحميل J / QTL. سيوفر هذا البروتوكول بناء جملة سطر الأوامر R / كتل مع الإشارة العرضية إلى الدالة المكافئة في J / كتل.
  3. تحميل حزمة "كتل":
    > مكتبة (كتل)
    ملاحظة: راجع بروتوكول 2.3 ملاحظة في ملف تكميلي 1 لتنسيق البيانات والتنزيلات.
  4. تحميل ملف مجموعة البيانات إلى R / كتل.
    1. لتنسيق "كسف" (انظر: ملف البيانات 1):
      > سنفر <- read.cross (فورمات = "كسف"، فيل = "$ باث / رتل-SNFR.csv"، جينوتيبس = c ("0"، "1")، na.strings = c ("-") ، كونفيرتكسداتا = فالس)
    2. أو لتنسيق "غاري" (انظر: ملف البيانات 2):
      > سنفر <- read.cross (فورمات = "غاري"، دير = "$ باث"، كريدفيل = "chrid.txt"، منامسفيل = "mname.txt"، مابفيل = "markerpos.txt"، جينفيل = "جينوتيب. تكست "، فيفيل =" vinos.txt "، ينامسفيل =" vinonames.txt "، كونفيرتكسداتا = فالس)
      حيث باث $ هو مسار الدليل إلى الملفات (ق) التي تحتوي على مجموعة البيانات كتل. على سبيل المثال: / وسرس / هوتديجيتيدوغ / كتلفيلز
      ملاحظة: يمكن أيضا تحميل الملفاتإد إلى J / كتل مع الأوامر السابقة باستخدام الخيار 'إدراج تعليق أو أمر'، أو تحميل البيانات مع واجهة المستخدم الرسومية 'ملف-> تحميل بيانات الصليب' الخيار.
  5. احسب الاحتمالات للخريطة:
    > سنفر <- calc.genoprob (سنفر، ستيب = 2.0، off.end = 0.0، error.prob = 1.0E-4، map.function = "هالدين"، ستيبويدث = "فيكسيد")
  6. تشغيل مسح واحد باستخدام توزيع ثنائي من النمط الظاهري المقاومة سينفونجين عبر جميع الكروموسومات:
    > SNFR.scan <- سكانون (كروس = سنفر، شر = c ("يا" و "يب" و "إي" و "إي" و "إيف" و "V" و "في" و "فيا" و "فيب "،" في "،" إكس "،" X "،" إكسي "،" زي ")، vino.col = c (1)، موديل =" بيناري "، ميثود =" إم ")
    ملاحظة: إذا كان تشغيل النمط الظاهري فير استخدام "نموذج =" عادي "خيار التوزيع.
  7. تشغيل 1000 التباديل لحساب عتبات أهمية ثم أتريبوت التبديلات إلى متغير SNFR.scan:
    > SNFR.scan.permutations <- سكانون (كروس = سنفر، شر = c ("يا" و "يب" و "إي" و "إي" و "إيف" و "V" و "في" و "فيا" "فيب"، "في"، "إكس"، "X"، "إكسي"، "زي")، vino.col = c (1)، موديل = "بيناري"، ميثود = "إم"، n.perm = 1000، perm.Xsp = فالس، فيربوس = فالس)
    > أتر (SNFR.scan، "vino.col") <- c (1)
    ملاحظة: الخطوات من 2.5 إلى 2.7 يمكن تشغيلها في J / كتل مع 'تحليل-> الرئيسية المسح الضوئي-> تشغيل واحد كتل الجينوم المسح الضوئي' الخيار.
  8. رسم نتائج المسح:
    > مؤامرة (SNFR.scan، غاب = 0، بانكول = "غراي")
    ملاحظة: المؤامرة المنتجة في J / كتل تفاعلية.
    1. رسم نتائج المسح ل كروموسوم فقط التاسع، الكروموسوم مع أعلى قمة:
      > مؤامرة (SNFR.scan و شر = c ("إكس") و غاب = 0 و بانكول = "غراي" و show.marker.names = ترو)
  9. عرض جميع المواقع علامة ودرجات لود من المسح الضوئي واحد:
    > SNFR.scan
  10. عرض نتائج عتبة اختبار التقليب:
    > موجز (SNFR.scan.permutations)
  11. عرض فقط تلك العلامات أكبر من قيمة الحد الأقصى ألفا = .05 (مأخوذة من الإخراج السابق):
    > SNFR.scan [SNFR.scan $ لود> 2.68،]
  12. عرض علامات مع أعلى درجة لود على كل كروموسوم:
    > موجز (SNFR.scan)
  13. إظهار تلك العلامات التي لديها قيمة لد أقصى درجة (مأخوذة من الإخراج السابق):
    > SNFR.scan [SNFR.scan $ لود> = 6.57،]
    ملاحظة: راجع بروتوكول 2.13 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .

3. تحديد السببية شنف ص تحوير باستخدام وس يقرأ من سلالة

ملاحظة: انظر البروتوكول 3 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .

  1. محاذاة وس يقرأ من نسل الفردية إلى فاند الحساسة سينفونجين(فاند-سنف s ) الجينوم الأبوي.
    ملاحظة: تحميل الجينوم مرجع فاند (شنف s ) من الجمعية نسبي AEYJ00000000.2 وقراءة وس (ملفات .sra) للنسيلة 24 من نسبي سرا PRJNA258152. أيضا، تحميل البرامج التالية: Bowtie2 11 ، نسبي سرا أدوات، سامتولس 30 ، فارسكان 12 ، و مومر 31 .
    1. إنشاء مؤشر بووتي 2 متوافق من ملف فاند الجينوم مرجع فاستا باستخدام برنامج القوس sbie2، هنا تسمية مؤشر "فاند":
      > bowtie2-بيلد GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna فاند
    2. تحويل سرا المنسقة وس قراءة الملفات إلى ملفات فاستق باستخدام فاستق تفريغ مع الخيار --split الملفات للقراءات المقترنة (سيتم استخدام ملف SRR1555372.sra للنسل P1_14VB كمثال):
      > فاستك-دومب --split-فيليز SRR1555372.sra
      ملاحظة: تشغيل هذا وجميع الأوامر التالية في بروتوكول 3.1 لجميع 24ذرية.
    3. محاذاة يقرأ وس إلى الجينوم المرجعي باستخدام bowtie2 مع الإخراج إلى سام (.sam) ملف و - من طرف إلى نهاية الخيار:
      > bowtie2 -x فاند -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam --end-تو-إند
    4. تحويل ملف .sam إلى ملف بام (بام.):
      > سامتولس فيو -bS SRR155372.sam> SRR155372.bam
    5. فرز ملف بام:
      > سامتولس سورت SRR155372.bam SRR155372.sort
    6. فهرس الملف .bam الذي تم فرزه:
      > سامتولس إندكس SRR155372.sort.bam
  2. استدعاء تعدد الأشكال للنسل باستخدام فارسكان
    ملاحظة: انظر بروتوكول 3.2 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .
    1. تحويل كافة ملفات بام المفهرسة (.sort.bam) في ملف واحد بيليوب تنسيق باستخدام سامتولس مبيليوب مع ملف مرجعي الجينوم فاند، جميع النسل .sort.bam الملفات والإخراج إلى ملف اسمه ألبروجيني-mpileup.txt:
      > سامتولس مبيليوب -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599.فرز .bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200. فرز .bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399. sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> ألبروجيني-mpileup.txt
    2. استدعاء كل سنبس باستخدام برنامج mpileup2snp فارسكان باستخدام ملف ألبروجيني-mpileup.txt، الحد الأدنى من قراءة قراءة 5، الحد الأدنى تردد تردد عبر يقرأ .8، قيمة p .01، والإخراج لأسماء الملفات ألبروجيني-سنبس. رسالة قصيرة:
      > جافا -jar VarScan.jar mpileup2snp ألبروجيني-mpileup.txt --min-كوفيراج 5 --min-فار-فرق .8 --p-فالو .01> ألبروجيني-SNPs.txt
      ملاحظة: الملف ألبروجيني-SNPs.txt هو ملف نصي محدد الجدولة التي سيتم استخدامها في بروتوكول 3.4 لتحديد موقعالسببية سنب.
  3. البحث عن الإحداثيات الجينوم فاند التي تتوافق مع إحداثيات ME49 مقرها كتل القائمة
    ملاحظة: انظر البروتوكول 3.3 ملاحظة في الملف التكميلي 1 .
    1. استخدام برنامج نومر نوسمر لمحاذاة الجينوم ME49 (متاحة للتحميل من ToxoDB.org 32 ) وملف الجينوم مرجع فاند (إخراج يذهب إلى ملف out.delta):
      > نوسمر توكسودب-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna
    2. استخدام برنامج مومر شو-كوردز للحصول على إحداثيات محاذاة الجينوم، الإخراج إلى ملف اسمه ME49vsVAND-coords.txt:
      > شو-كوردز out.delta> ME49vsVAND-coords.txt
      ملاحظة: يمكن استخدام ملف ME49vsVAND-coords.txt للعثور على كونتيغس فاند والمواقف التي تتوافق مع موضع كتل؛ علامات MV359 إلى MV366 تقع على ME49 كروموسوم التاسع بين 3،187،537 إلى 4،202،258 نقطة أساس. هناك نوعان من فاند كونتيغس التي تمتد كوريسبأوندينغ كتل لوكوس؛ KN044604.1: 657،441-1 بب و KN042501.1: 430،910-41،870 بي بي (على حد سواء كونتيغس محاذاة عكس إلى كروموسوم ME49).
  4. تقييم السلالات تعدد الأشكال الموجودة داخل موقع كتل ل سنبس الموروثة فقط في نسل ص نسل
    ملاحظة: انظر البروتوكول 3.4 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .
    1. مراجعة ملف البيانات 3 لتحديد الطفرة السببية الموجودة داخل موضع كتل. تفحص البيانات لنمط حيث يكون للنوع r سنف لديها سنب و سنف s لا (ممكن لأن السلالات تم الحصول عليها من خلال المقارنة مع الجينوم المرجعي فاند-سنف s ). وهذا ينبغي أن يؤدي فقط إلى موقف واحد مع هذا النمط، والموقف 348130 على فاند كونتيغ KN042501.1.
    2. انظر الصف 6604 في ملف البيانات 3 ( الشكل 3 ).
      ملاحظة: انظر البروتوكول 3.4.2 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .

4. التحقق من الزيارات المحددة من قبل كريسبر / Cas9-بوساطة جين التعطيل.

ملاحظة: لتأكيد سنب السببية التي حددتها كتل رسم الخرائط وتحليل سنب وس، يجب إجراء التغييرات الجينية المقابلة في خلفية وت الجبهة الوطنية الصومالية والنمط الظاهري الناتجة فحصها. في حالة المقاومة سينفونجين، تؤدي الطفرة مسؤولة في تعطيل الجين SNR1 قبل الإنهاء المبكر 2 . لذلك، يمكن استخدام انقطاع SNR1 للتأكيد. هنا يتم توفير بروتوكول مفصل لاستخدام كريسبر / Cas9 الطفرات إندل التي يسببها لتعطيل SNR1 ، للتدليل على مشاركتها في المقاومة سينفونجين ( الشكل 4 ).

  1. SNR1 محددة البناء البلازميد كريسبر
    ملاحظة: انظر بروتوكول 4.1 ملاحظة في ملف تكميلي 1 للحصول على البلازميدات والخرائط.
    1. الحصول على تسلسل الجينومية للجين الهدف ( SNR1 ، TGME49_290860) من توكسودب 32 .
    2. استخدام أدوات الإنترنت مثل E-كريسب 33 لتصميم غرناس المستهدفة. لا تشمل تسلسل بام (نغ) في غرنا.
      ملاحظة: انظر البروتوكول 4.1.2 ملاحظة في الملف التكميلي 1 .
    3. توليف الاشعال لبناء الهدف البلازميد كريسبر محددة.
      1. وفقا لتصميم من الخطوة 4.1.2، توليف اثنين من الاشعال لتغيير أوبرت استهداف غرنا في البلازميد كريسبر الأصلي لتسلسل غرنا المحدد من قبل الطفرات الموجهة للموقع.
        ملاحظة: تسلسل هذين الاشعال هي على النحو التالي: غرنا-فو: نن ننغتاغتاغاتاغك (N20 هو الهدف تسلسل غرنا محددة) و غرنا-رف: آكتغاكاتكاتاتاك 2 .
    4. أداء ردود الفعل الطفرات الموجهة للموقع.
      1. باستخدام أوبرت استهداف البلازميد كريسبر (pSAG1 :: CAS9-U6 :: سغوبرت) كقالب والاشعال اثنين المذكورة أعلاه، أداء الموقع التفاعلات الطفرات الموجهةوفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
        ملاحظة: استخدام ظروف الدراجات التالية ل ير: 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 25 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها التمديد النهائي لمدة 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    5. تحويل المنتجات الطفرات التي تحتوي على البلازميدات كريسبر محددة الحكومة الإسرائيلية إلى E. كولاي الخلايا المختصة عن طريق التحول الكيميائي وفقا لبروتوكول المورد (انظر جداول المواد ). تنمو المحولات على مرق ليسوجيني (لب) لوحات تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق، واختيار 2-4 الحيوانات المستنسخة وتنمو بشكل فردي لهم في 5 مل لب المتوسطة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين لمدة 12-16 ح.
      1. استخراج البلازميدات من الثقافات باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي وتحليلها عن طريق الحمض النووي هلام الكهربائي للتحقق من حجم البلازميدات (حجم البلازميد المتوقع هو 9674 نقطة أساس، واستخدام البلازميد كريسبر الأصلي كما جontrol). استخدام التمهيدي M13-ريف (5'-كاغاكاكاكتاتغاسك) لتسلسل البلازميدات لتأكيد تسلسل الحمض النووي الريبي محددة الهدف.
        1. مرة واحدة يتم تحديد الحيوانات المستنسخة إيجابية، وتخزين كل من الحمض النووي البلازميد في -20 درجة مئوية وثقافة البكتيرية المقابلة في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
          ملاحظة: يجب حل البلازميد كريسبر لاستخدامها لترنسفكأيشن في الماء منزوع الأيونات والتركيز الذي يحدده الطيفي أو طريقة بديلة.
  2. ترنسفكأيشن الطفيلي.
    ملاحظة: تم وصف الطرق العامة لزراعة T. غونديي في الخلايا هف في المتوسطة D10 سابقا 34 .
    1. قبل 2-3 أيام قبل ترنسفكأيشن، إضافة ما يكفي من الطفيليات إلى قارورة T25 تحتوي على متموجة هف أحادي الطبقة الخلية (0.5-1 × 10 6 لسلالات نوع 1، 1-2 × 10 6 لسلالات أخرى) لتحقيق 70-80٪ خلية هف تحلل في غضون 2-3 د.
    2. Examiن الثقافة تحت مقلوب المرحلة مقلوب المقابل، عندما أحادي الطبقة هف هو 70-80٪ ليسد من قبل الطفيليات. إزالة بلطف وسط مع ماصة وغسل الخلايا قبالة سطح قارورة مع 5 مل عازلة سيتوميكس (120 ملي بوكل، 0.15 ملي كاكل 2 ، 10 ملم K 2 هبو 4 / خ 2 بو 4 درجة الحموضة = 7.6، 25 ملي هيبيس، 2 مم إدتا، 5 ملي مغكل 2 ، ف = 7.6). في وقت لاحق، ونقل الحل الطفيلي إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظة: انظر البروتوكول 4.2.2 ملاحظة في ملف تكميلي 1 .
    3. تمرير حل الطفيلي من خلال حقنة 10 مل / 22 G إبرة حادة 2-3X.
    4. تصفية حل الطفيليات في أنبوب مخروطي جديد من خلال غشاء مع حجم المسام من 3 ميكرون لإزالة خلايا هف والحطام الخلوية.
    5. بيليه الطفيليات التي تمت تصفيتها بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
    6. صب قبالة طاف و ريسوسبيند الطفيليات مكعبات مع 10 مل عازلة سيتوميكس، واتخاذ قسامة 10 ميكرولتر للكشف عنإرمين تركيز الطفيليات مع عدادة الكريات وبيليه بقية بواسطة الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة.
    7. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت سيتوميكس للحصول على كثافة 4 × 10 7 الطفيليات / مل.
    8. في كفيت الفجوة 4 ملم، مزيج 250-300 ميكرولتر حل الطفيليات (1-1.3 × 10 7 الطفيليات) مع 7.5 ميكروجرام البلازميد كريسبر، 6 ميكرولتر أتب (100mM)، و 6 ميكرولتر الجلوتاثيون (غش) (250 ملم).
    9. إليكتروبورات الطفيليات 35 . تضمين إليكتروبوراتيون منفصلة كسيطرة سلبية التي تستهدف البلازميد كريسبر في مكان آخر، مثل أوبرت استهداف البلازميد كريبسر.
      ملاحظة: إعدادات إليكتروبوراتيون تعتمد على الجهاز. بالنسبة إليكتروبوراتور المدرجة في المواد استخدام كوفيتس الفجوة 4 ملم. ويوصى بالبروتوكول التالي: 1،700 V، 176 μs من طول النبضة، 2 نبضات مع الفاصل الزمني مس 100.
  3. تحديد تردد سينفونجين ريسيستابعد استهداف كريسبر.
    1. خلايا هف البذور إلى كوفرسليبس وضعت في لوحات 24 جيدا 3-4 د قبل إليكتروبوراتيون بحيث تكون متموجة بحلول الوقت لأداء ترنسفكأيشن في 4.2.
      1. تريبسينيز الخلايا هف من واحدة قارورة T25 متموجة وبعد ذلك إضافة 12 مل D10 المتوسطة وتخلط جيدا.
      2. إضافة ساترة إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا وقسامة 500 ميكرولتر حل الخلية هف إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 4 د للسماح للخلايا تنمو حتى متموجة.
        ملاحظة: الخلايا من قارورة T25 واحدة كافية للبذور لوحة واحدة 24 جيدا.
      3. إضافة 50 ميكرولتر من حل الطفيليات إليكتروبوراتد من الخطوة 4.2.9 في بئر واحد من 24 لوحة جيدا تحتوي على ساترة المصنف مع الخلايا هف متموجة. نقل بقية إليكتروبوراتد حل الطفيليات في قارورة T25 المصنف مع خلايا هف متموجة.
    2. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن.
      1. تنمو الخلايا في لوحة 24 جيدا لمدة 24 ساعةوبعد ذلك إصلاح الخلايا (الخلايا المضيفة والطفيليات) مع 500 ميكرولتر 4٪ الفورمالديهايد للتحقق من التعبير عن Cas9-غفب بواسطة مقايسة إمونوفلورزنت (إيفا).
      2. دقق الخلايا مع الأجسام المضادة لمكافحة غفب و الأجسام المضادة محددة التوكسوبلازما (مثل مكافحة تغالد) لتسمية الطفيليات الكلي. انظر ورقة المنتج الأجسام المضادة للتخفيف الموصى بها (عادة، 1: 1000 كافية لل إيفا). إذا الأجسام المضادة هي أونكونجوغاتد، استخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية المختلفة مترافق مع الأصباغ الفلورية لتسمية الأجسام المضادة الأولية.
      3. مراقبة الخلايا المسمى على المجهر الفلورسنت مع المرشحات المناسبة للأصباغ الفلورسنت الثانوية. الحصول على كفاءة ترنسفكأيشن بقسمة عدد الطفيليات الإيجابية غفب من قبل عدد من الطفيليات الكلي.
        ملاحظة: يجب أن الأجسام المضادة المستخدمة ل إيفا تأتي من نوعين المضيفين مختلفة، على سبيل المثال باستخدام مزيج من الماوس لمكافحة غفب والأرنب المضادة تغالد.
    3. حدد fريكنسي المقاومة سينفونجين في الطفيليات ترانزفكتد.
      1. لطفيليات ترانزفكتد المستزرعة في قوارير T25، وتنمو لهم لمدة 2-3 د حتى الخروج الطبيعي. ثم جمع الطفيليات، إبرة حادة ليز الخلايا المضيفة للافراج عن الطفيليات داخل الخلايا، وتنقيتها عن طريق الترشيح من خلال الأغشية مع حجم المسام من 3 ميكرون. عد الطفيليات مع عدادة الكريات لتقدير الكثافة.
      2. إضافة الطفيليات النقي إلى 6 لوحات جيدا المصنفة مع خلايا هف متموجة: للصف الأول (3 بئر)، إضافة 200 الطفيليات / جيدا وتنمو في العادي D10 المتوسطة (2 مل / بئر). للصف الثاني، إضافة 5000 الطفيليات / جيدا وتنمو في وسط D10 تحتوي على 0.3 ميكرومتر سينيفونجين.
      3. وضع لوحات في 5٪ كو 2 حاضنة وتنمو الطفيليات لفي 37 درجة مئوية 8-10 د دون اضطراب للسماح لويحات لتشكيل. إصلاح العينات مع الايثانول 70٪ (2 مل / جيدا) وصمة عار أحادي الطبقة مع 0.1٪ البنفسجي الكريستال (2 مل / بئر). غسل الآبار مع الماء لتصورلويحات (مناطق واضحة) التي شكلتها نمو الطفيلي.
        ملاحظة: ينبغي معالجة عنصر التحكم السلبي بنفس الطريقة جنبا إلى جنب.
    4. حساب معدل كريسبر التي يسببها مقاومة سينفونجين.
      1. الحصول على متوسط ​​عدد (X) من اللويحات من الآبار التي تحتوي على أي دواء وحساب قابلية الطفيلي كما X / 200. الحصول على متوسط ​​عدد (Y) من اللويحات من الآبار التي تحتوي على سينفونجين لحساب معدل المقاومة سينسونجين المستحثة كريسبر على النحو التالي:
        معدل المقاومة التي يسببها كريسبر = 200 × Y / (5000 × × × كفاءة ترنسفكأيشن)
        ملاحظة: يتم الحصول على كفاءة ترنسفكأيشن من 4.3.2.
  4. دراسة الطفرات إندل التي يسببها كريسبر / Cas9
    1. تنمو الطفيليات إليكتروبوراتد من القسم 4.2.9 في قارورة T25 المصنفة مع خلايا هف لمدة 2 د عند 37 درجة مئوية. ثم، استبدال المتوسطة مع 5 مل وسط D10 تحتوي على 0.3 ميكرومتر سينفونجين (اختيار المتوسطة).
      1. الحفاظ على الطفيليات في وسط اختيار لمدة لا يقل عن 3 ممرات حتى يصبح تجمع مقاومة مستقرة (المشار إليها من قبل عدم وجود نمو الطفيليات في مجموعة السيطرة السلبية ولكن نمو الطفيليات قوية في المجموعة التجريبية).
    2. سوبكلون تجمع مقاومة سينفونجين للحصول على سلالات نسلي.
      1. جمع الطفيليات الخروج حديثا، وتنقية من قبل 3 ميكرون الترشيح غشاء و سوبكلون في لوحات 96 جيدا المصنف مع خلايا هف متموجة في 150 ميكرولتر D10 المتوسطة. تنمو الثقافات سوبكلونينغ في حاضنة كو 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 7-10 د دون إزعاج لوحات.
        ملاحظة: انظر البروتوكول 4.4.2.1 ملاحظة في S ملف تكميلي 1 .
    3. تحقق من لوحات 96 جيدا تحت مجهر مقلوب الطور مقلوب للبحث عن الآبار التي تحتوي على لوحة واحدة فقط. علامة مثل هذه الآبار وبعد ذلك نقل الخلايا من كل بئر إلى لوحات 24 جيدا المصنف مع خلايا هف باستخدام ماصة.
      4. <لي> عندما 80-90٪ من الخلايا هف في بئر ليسد، حصاد الطفيليات (حوالي 500 ميكرولتر) وتمرير 50 ​​ميكرولتر حل الطفيليات لبئر جديد للحفاظ على سلالة. استخدام بقية (≈450 ميكرولتر) لاستخراج الحمض النووي الجيني لتضخيم ير.
      1. لعزل الحمض النووي الجيني من استنساخ شنف R ، بيليه الطفيليات (كميات صغيرة من هف تلوث الخلايا هو قابل للتحمل) في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل الطفيليات مكعبات مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) مرة واحدة وبيليه لهم مرة أخرى. عزل الحمض النووي الجيني من خلايا مكعبات باستخدام مجموعة التجارية أو عن طريق الغليان. ريسوسبيند الطفيليات في 50-100 ميكرولتر بس.
        ملاحظة: أداء ير للحصول على جزء من الجينات SNR1 للتسلسل. استخدم الاشعال التالية لتضخيم موضع SNR1 2 : SNR1-أمب-فو: 5 'كغاكاكا كاتك و SNR1-أمب-رف: 5'GACGTGATTCACTTTTTTACAGACAGAC. استخدام البلمرة الحمض النووي عالية الدقة. تضخيم موضع وت لأغراض التحكم.
    4. أداء tهو ير مع 20 حجم رد فعل ميكرولتر وتشغيله مع البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة، تليها التمديد النهائي لمدة 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
      ملاحظة: تسلسل المنتجات ير باستخدام الاشعال التالية: SNR1-Seq1: 5 'غك أكا تغك ت أغك غغ، SNR1-Seq2: 5' تسك تكت سكا تسا كغغ غت غ، SNR1-Seq3: 5 'غسا أغا غك غغ تغا سغ ، SNR1-Seq4: 5 'كتك تسك سغك غت سغا G، SNR1-Seq5: 5' غسا كسغ تسك غسا أغك، و SNR1-Seq6: 5 'كسغ غا غت غا تسغ تك تك.
    5. قارن تسلسل الجينات SNR1 من المسوخ المقاومة سينفونجين إلى أن سلالة وت باستخدام أداة محاذاة تسلسل.
      ملاحظة: انظر الملف التكميلي 2 بروتوكول 5 للحصول على تفاصيل حول استخدام اختيار السلبي في موضع SNR1 لتكملة وراثية أو بناء سلالة المعدلة وراثيا.

النتائج

توضح هذه المقالة بالتفصيل عدة طرق التي يمكن استخدامها في الخلافة لتحديد الجين المسؤول عن مقاومة المخدرات ( الشكل 1 ). تم تقييم نسل 24 من ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب لمقاومة سينيفونجين المخدرات كما هو موضح في بروتوكول 1. باستخدام الخريطة الوراثية والنمط الظاهري شنف من سلالة، تم تشغيل مسح كتل في R / كتل - بروتوكول 2 ( الشكل 2 ). أدى هذا إلى ذروة واحدة كبيرة على الكروموسوم التاسع التي تمتد حوالي 1 ميغابايت. وفي هذه المنطقة يوجد الطفرة السببية.

لتحديد الطفرة السببية، وقراءة وس من سلالة تم محاذاة إلى الجينوم المرجعي فاند-سنف s باستخدام Bowtie2 - بروتوكول 3.1، تم استدعاء سنبس باستخدام mpilup2snp فارسكان - بروتوكول 3.2، وتم تحديد موقع كتل في الجينوم فاند باستخدام مومر - Protocأول 3.3. تم استخلاص النبضات المتعددة النسل داخل موقع كتل وتم مسحها ضوئيا لنمط حيث يكون لذرية ال سنف سنب و ال سنف s ، وهو أمر ممكن لأنه تم الحصول على السلالات النبضية بالمقارنة مع الجينوم المرجعي ل فاند-سنف ( الشكل 3 ) . واحد فقط سنب مطابقة هذا النمط الذي يؤدي إلى كودون وقف في وقت مبكر في الجين المفترض الحمض الأميني نقل اسمه SNR1 .

تأكيد أن SNR1 هو الجين المقاومة R سنف تم تنفيذها باستخدام نظام كريسبر / Cas9. وقد تم إنشاء كريسمر جديد / Cas9 البلازميد المهندسة ل T. غونديي التحرير الجيني تحتوي على الحمض الريبي النووي الذواب استهداف الجين SNR1 بالقرب من شنف ص طفرة التي تم تحديدها في ذرية - بروتوكول 4 ( الشكل 4A ). وقد تم استخدام SNR1 استهداف البلازميد كريسبر / Cas9 إليكتروبوراتد إلى شطف طيف طفيلي سلالة وت متحولات مقاومة تم الحصول عليها عندما عبادةأوريد في 0.3 ميكرومتر سينفونجين. لم يتم الحصول على الطفيليات r شنف عندما إليكتروبوراتد مع أوبرت استهداف كريسمر / Cas9 البلازميد. تم استنساخ العديد من الطفرات سرف r كريسبر وتم تسلسل المنطقة حول الهدف SNR1 غرنا. وكان كل متحولة إندل أن تعطل تسلسل الترميز للجين SNR1 ( الشكل 4B ). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإدراج بناء استهداف في موضع SNR1 عبر نهيج ( الشكل 5)، أو عن طريق الموارد البشرية ( الشكل 6 ) - ملف تكميلي 2 .

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التخطيطي للتجارب المبينة في البروتوكولات. وتظهر الخطوات الرئيسية في تحديد وتأكيد الجين شنف r باستخدام M49-فودر r X فاند-شنف ص الصليب مع الإشارة إلى البروتوكولات المناسبة المبينة في tمقالته. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: R / كتل الأوامر لتشغيل كتل المسح الضوئي على شنف النمط الظاهري. تم تشغيل الأوامر كما هو موضح في البروتوكول 2 في R باستخدام حزمة كتل. يتم عرض أوامر الممثل والمؤامرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: موقع سنب السببية. تم محاذاة ذرية وس قراءات إلى الجينوم المرجعي فاند-سنف مع بوتي 2، تم استدعاء سنبس مع فارسكان، والمراسلة إنغ، فاند، كتل، لوكوس، حدد حدد، ب، مومر. تم استيراد سنبس الموجودة داخل موضع كتل في جدول بيانات وتم تحديد سنب السببي. سنف ص النسل (الأصفر)، سنف s النسل (الأخضر)، شنف r سنب (الأحمر) (انظر ملف البيانات 3 ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تأكيد SNR1 كما شنف ص الجيني باستخدام كريسبر / Cas9. ( A ) كريسبر / Cas9 الطفرات إندل التي يسببها (الأخضر) في موضع SNR1 . ( B ) ممثل إندلس في SNR1 الناجمة عن اثنين من SNR1 مختلفة البلازميدات كريسبر محددة (C5 و C6 على التوالي). ر هو سلالة وت و C5 و C6 هي شنف ص المسوخ. (B مأخوذة من المرجعs = "كريف"> 2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. الطفرات الإدراج باستخدام كريسبر / Cas9. ( A ) إدراج الجينات التكميلية أو المعدلة وراثيا في موضع SNR1 من قبل كريسر / Cas9 بوساطة التكامل موقع معين. هناك اتجاهان محتملان للجين المصغر دفر * و الجينات المصغرة المستخدمة في تحديد الهوية، F1 / 2 و R1 / 2 تمثل مواقع فتيلة أوليغوس المستخدمة في تقارير إنجاز المشروعات التشخيصية. ( B ) ير ير التشخيص من واحد snr1 :: دفر * استنساخ، ر يستخدم كسيطرة وت. ير يتم تضمين ير من GRA1p باعتبارها مراقبة فحص نوعية الحمض النووي الجيني كما القوالب. النجمة تشير الممرات مع العصابات غير محددة (الشكل 5B مأخوذ من ريفيرنسي 2 ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: خروج المغلوب الجيني باستخدام كريسبر / Cas9. تصميم كلاسيكي ل كريسبر / Cas9 بوساطة استبدال الجينات مثلي في T. غونديي . يتم إصلاح التوجه من التحوير إدراجها في هذه الحالة. F1 / R1، F2 / R2 و F3 / R3 تمثل مواقع فتيلة أوليغوس المستخدمة في تقارير إنجاز المشروعات التشخيصية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف البيانات 1: ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب ملف fأو استخدام في R / كتل، "كسف" تنسيق. ملف .csv واحد يمكن تحميله إلى R / كتل مع تنسيق = "كسف" الخيار. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف البيانات 2: (تكريد شريد، تكست النمط الجيني، markerpos.txt، mname.txt، vinonames.txt، و vinos.txt). ME49-فودر r X فاند-شنف r كروس الملفات لاستخدامها في R / كتل، "غاري" تنسيق. ستة ملفات .txt التي يمكن تحميلها في R / كتل مع الشكل = "غاري" الخيار. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف البيانات 3. جدول البيانات مع تعدد الأشكال ذرية عبر شنف r كتل لوكوس. يحتوي على ورقة عمل واحدة مع سنبس النسل، وورقة عمل ثانية مع البيانات المظهرية للوالدين ونسل الصليب. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: تفاصيل البروتوكول الإضافي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: البروتوكول 5 - استخدام التحديد السلبي في SNR1 موقع التكامل الجيني أو سلالة المعدلة وراثيا البناء. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

هذه البروتوكولات تقدم عدة طرق عندما مجتمعة تسمح لتحديد الجينات المقاومة للأدوية في T. غونديي . اثنان على وجه الخصوص كانت جزءا لا يتجزأ من المشروع، وطريقة محنك نسبيا من كتل رسم الخرائط وطريقة وضعت مؤخرا من كريسبر / Cas9 تحرير الجينات. نشرت لاندر وبوتستين ورقة مؤثرة في عام 1989 مما يدل على رسم الخرائط كتل التي تربط بين الوراثة الجينية مع الظواهر 36 . في الآونة الأخيرة في عام 2012، وصف دوندا وشاربنتيه نظام تحرير كريسبر / Cas9 في العقدية بيوجينيس 22 التي تم تكييفها بسرعة كأداة وراثية في العديد من النماذج المختلفة، بما في ذلك T. غونديي 13 ، 17 . كانت كلتا الطريقتين مفيدتين هنا، حيث حددت خريطة كتل الموضع الذي يحتوي على طفرة مقاومة المخدرات التي تم تحديدها في نهاية المطاف باستخدام وس استنادا كشف سنب، و كريسبر / Cas9 التحرير قدمت لي أنس لتأكيد SNR1 هو جينفونجين جين المقاومة المخدرات.

وقد تم تطوير ME49-فودر ص X فاند-شنف ص الصليب 8 أصلا لاستجواب النمط الظاهري الفوعة 19 ، ولكن سلالات الوالدين كما حدث أن يكون الفرق المظهري الإضافي الذي لم يعرف الجين السببية، ومقاومة سينفونجين في الأم فاند. هذا يسلط الضوء على فائدة واحدة من الصلبان في أنه يمكن إعادة استخدامها عند ملاحظة الاختلافات المظهري إضافية في الآباء والأمهات. كان هذا هو الحال بالنسبة لثلاثة توكسوبلازما أخرى، نوع 2 × نوع 3، حيث تم العثور على عدة جينات تشارك في الفوعة من خلال رسم خرائط المظاهر المتعددة 37 ، 38 ، 39 ، 40 . حتى الآن، تم وصف أربعة مفارق T. غونديي مختلفة وتستخدم لرسم خريطة الجينات المسؤولة عن المظاهرسس = "كريف"> 8 ، 37 ، 41 ، 42 ، وكلها لديها القدرة على إعادة استخدامها لرسم المظاهر الجديدة التي لا أساس لها أساس جيني. وعلى طول هذه الخطوط، تم تسلسل الجينومات ل 62 سلالة غونديي T. تمثل التنوع الجيني العالمي المعروف 43 . يمكن أن تكون الصلبان الجديدة من هذا التجمع لسلالات تختلف في الظواهر المثيرة للاهتمام. بعد أن طغت على مزايا رسم الخرائط كتل، فإنه يجب أن يقال أن توليد الصليب ليست مهمة طفيفة. هناك طرق أخرى يمكن استخدامها لتحديد الجينات السببية. تقنية واحدة قوية تستخدم الطفرات الكيميائية لخلق المسوخ التي يمكن فحصها عن المظاهر. للعثور على الجينات السببية، يمكن أن تكون إما المسوخ يمكن أن تستكمل مع المكتبات الكونية 44 أو طرق الجينوم ريسكنسينغ يمكن استخدامها للعثور على الطفرة السببية 45 . ل موعلى هذا، انظر اثنين من جوف المقالات التي كتبها كولمان وآخرون. ووالوين وآخرون. التي تحدد هذه النهج 46 و 47 .

تعتمد العديد من الخطوات المؤدية إلى التعرف على الطفرات السببية (شيف) (البروتوكولان 2 و 3) على الأساليب الحسابية التي يتم إجراؤها باستخدام البرمجيات المتوفرة مجانا للاستخدام الأكاديمي. يتم توفير أوامر مفصلة لكل خطوة وعندما تشغيل مع الملفات المناسبة سوف تسمح للمستخدم لإعادة إنشاء مجموعات البيانات اللازمة للعثور على السببية سنف ص سنب. نضع في اعتبارنا أن بعض بناء الجملة في الأوامر تشير إلى أسماء الملفات أو بنية الدليل ($ باث) التي يمكن تعديلها لتفضيل المستخدم. على الرغم من أن الأوامر الواردة هنا بالتأكيد لا تستنفد طرق يمكن للمرء أن تحليل الصليب مع تحليل كتل و وس استنادا سنب تحديد، فهي شاملة بما فيه الكفاية لتكرار التجربة المذكورة في هذه المقالة، وينبغي أن تسمح للمستخدم لتصبح م خام دراية كيف يتم استخدام هذه النهج بطريقة خطوة بخطوة.

على الرغم من أن كتل رسم الخرائط و وس على أساس تسلسل سنب على أساس كاف لتحديد الجين مرشح شنف r ، وهناك حاجة إلى تجارب إضافية لتأكيد دورها في مقاومة المخدرات. وهذا يمكن أن يكون مقنعا من خلال تعطيل الجينات أو تقنيات خروج المغلوب، وكلاهما يمكن أن يتحقق باستخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينات. يتم إعطاء أساليب مفصلة لاستخدام كريسبر / Cas9 إما توليد الطفرات إندل أو إدراج يبني المعدلة وراثيا في الجين الهدف في T. غونديي . خصوصية الاستهداف التي يوفرها كريسبر / Cas9 يزيد من كفاءة تحرير الجينات على الطرق التقليدية. أيضا، وهذا زيادة بكفاءة جعلت من الممكن استخدام سلالات غير المختبر تكييفها للدراسات الوراثية التي كان من الصعب سابقا تعديل 13 . على الرغم من أن في مرحلة الطفولة الأولى، كريسبر / Cas9 قد استخدمت بالفعل لجعل اضطرابات الجيناتلاس = "كريف"> 2 ، 13 ، 17 ، 18 ، 48 ، 49 ، الجينات الوسم 17 ، وجعل الجينات القاضية 16 ، 19 ، 50 ، 51 ، 52 ، 53 ، 54 في T. غونديي ، واعدة أن تكون أداة مفيدة للعديد من الدراسات الأخرى في المستقبل.

اكتشاف أن SNR1 تعطيل يؤدي إلى مقاومة سينفونجين يجعل SNR1 موقع موقع واعد لإدخال التحوير أو تكامل وراثي. لتحقيق أقصى قدر من النجاح في استخدام كريسبر / Cas9 بوساطة الجينات المستهدفة لتوجيه دمج التحوير في موضع SNR1 ، يجب أن تكون الجوانب التالية كونسيدالأحمر، إبان، ال التعريف، تجريبي، ديسين. أولا، ويوصى علامة اختيار ليتم تضمينها في بناء المعدلة وراثيا لزيادة كفاءة بناء سلالة. إذا تم تضمين علامة التحديد، يمكن استخدام كل من اختيار الإيجابية والسلبية، مما أدى إلى ما يقرب من 100٪ من الطفيليات المختارة مضاعفة كونها المعدلة وراثيا مع الحكومة الإسرائيلية متكاملة في موضع SNR1 . في المقابل، إذا كان البناء المعدلة وراثيا لا تحتوي على سمات اختيارية إضافية وتعتمد على الاختيار السلبي في موضع SNR1 ، وكفاءة ترانزجينيسيس ناجحة يعتمد إلى حد كبير على كفاءة نقل كبد من البلازميد كريسبر والبناء المعدلة وراثيا.

ثانيا، على الرغم من أن التكامل كريسبر / Cas9 بوساطة موقع معين من جزء الحمض النووي غير متماثلة وكثيرا ما تستخدم لتكملة و ترانزجينيسيس، تجدر الإشارة إلى أن التوجه الإدراج لا يمكن أن تكون مضمونة في مثل هذه الحالات كما إما الاتجاه ممكن. وهذا قد يشكل مشكلةمللي ثانية إلى بعض التطبيقات. على سبيل المثال، لتكملة متحولة مع الأليلات الجينات المختلفة، فمن الصعب التأكد من أن يتم إدراج جميع الأليلات في نفس التوجه، والتناقضات في التوجه قد يسبب الاختلافات التعبير. لهذا النوع من التطبيق، يبني الحمض النووي مع تسلسل مثلي لمكان SNR1 ينصح بها، والتي سوف تدفع التوجه التكامل الصحيح ( الشكل 6 ).

ثالثا، خلال ترنسفكأيشن، والنسبة بين البلازميد كريسبر وجزيء الحمض النووي المعدلة وراثيا أمر بالغ الأهمية لنجاح بناء سلالة المعدلة وراثيا. ويتعين تعديل هذه النسبة وفقا لاستراتيجيات الاختيار. ويوصى بالمبادئ التوجيهية التالية: 1) إذا كان بناء المعدلة وراثيا يحتوي على علامة مقاومة المخدرات والدواء المقابل هو الاختيار الوحيد المستخدم لتوليد الطفيليات المعدلة وراثيا، أي لا يستخدم سينفونجين، والنسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازما كريسبرمعرف هو 1: 5. استخدام المزيد من البلازميد كريسبر في هذه الحالة يزيد من احتمال أن الطفيليات تلقي بناء المعدلة وراثيا سوف تتلقى أيضا البلازميد كريسبر، وبالتالي الطفيليات المقاومة للمخدرات هي أكثر عرضة ليكون علامة إدراجها في موقع استهداف كريسبر. إذا تم عكس نسبة، فإن معظم الطفيليات التي تتلقى بناء المعدلة وراثيا لن تحصل على البلازميد كريسبر. ونتيجة لذلك، فإن الغالبية العظمى من الطفيليات المقاومة للمخدرات الحصول على بناء المعدلة وراثيا من خلال التكامل العشوائي لا يرتبط مع كريسبر / CAS9 بوساطة موقع محدد الإدراج. 2) إذا كان بناء المعدلة وراثيا يحتوي على علامة مقاومة المخدرات ويستخدم الدواء المقابلة جنبا إلى جنب مع سينفونجين لتحديد الطفيليات المعدلة وراثيا، والنسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازميد كريسبر هو 1: 1. توفر هذه الاستراتيجية أعلى كفاءة البناء سلالة المعدلة وراثيا. 3) إذا كان التركيب المعدلة وراثيا لا يحتوي على صانع للاختيار، والاعتماد على اختيار السلبيةبواسطة سينفونجين وحدها للحصول على الطفيليات المعدلة وراثيا، ونسبة المولي المقترحة بين البناء المعدلة وراثيا والبلازميد كريسبر هو 5: 1. والأساس المنطقي لهذا التصميم هو نفسه كما في المبدأ التوجيهي الأول أعلاه. منذ استخدام كل من بيريميثامين و سينفونجين للاختيار في البروتوكول 5، تم تعيين النسبة بين دفر * الجينات البسيطة و SNR1 استهداف البلازميد كريسبر كما 1: 1.

وإذا أخذنا معا، فإن الأساليب المبينة هنا لها مستوى من التفصيل لم يكن ممكنا نقله في المنشور الأصلي الذي حدد SNR1 2 . هذه البروتوكولات. على وجه التحديد، وبناء جملة سطر الأوامر، والتخطيط التسلسلي للبرامج المستخدمة، واستخدام كريسبر / Cas9 يجب أن تساعد المساعي المستقبلية لتحديد الجينات الجديدة المسؤولة عن المظاهر.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر L. ديفيد سيبلي وآسيس خان لمساهمتهم في المنشور الأصلي الذي تستند إليه هذه البروتوكولات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة AI108721.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير T25كورنينج430639
الخلايا الليفية للقلفة البشرية (HFF)ATCCSCRC-1041
< م > T. gondii < / em > سلالة ME49ATCC50840
< م > T. gondii < / em> VAND سلالةATCCPRA-344
DMEM (بدون بيكربونات الصوديوم) علومالحياة 12800017
بيكربونات الصوديومSigma AldrichS5761
HEPESSigma AldrichH3375
مصل الأبقار الجنينية (FBS) Premium GradeVWR International97068-085
L-Glutamine  200 mMSigma AldrichG7513
Gentamicin (10 mg / mL)Life Technologies مكشطة خلية 15710064
للقوارير VWRInternational10062-904
حقنة 10 ملBD309604
إبر حادة 22 جم × 1 "منتجات BRICOBN2210
النواة 3.0 & مايكرو ؛ م ، 25 ممGE Healthcare110612
Swin-Lok حامل فلتر 25 ممGE Healthcare420200
الدمPropper MFG90001
SinefunginEnzo Life Sciences380-070-M001
R & nbsp ؛مؤسسة Rhttps://www.r-project.org/
J / qtlمجموعة تشرشلhttp://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml
Bowtie2جامعة جون هوبكنزhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
NCBI SRA ToolkitNCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc
SAMtoolsمعهد ويلكوم ترست سانجرhttp://www.htslib.org/
جامعة فارسكانواشنطن ، سانت لويسhttp://varscan.sourceforge.net/
MUMmerJCVI & amp; جامعة هامبورغhttp://mummer.sourceforge.net/
pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRTAddgenePlasmid # 54467T. gondii < / em> بلازميد CRISPR لقطع جين UPRT
pSAG1 :: CAS9-U6 :: sg290860-6AddgenePlasmid # 59855 T. gondii < / em> CRISPR بلازميد لقطع جين TG * _290860 SNR1
pUPRT: :D HFR-DAddgenePlasmid # 58528قالب ل DHFR * < / em> جين صغير
Q5 طفرات موجهة إلى الموقع  New England BiolabsE0552S
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
LB مرقفيشر ScientificDF0446-07-5
كلوريد البوتاسيومSigma AldrichP9541
كلوريد الكالسيومSigma Aldrich746495
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشP9791
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشP5504
EDTAسيجما ألدريتشE5134
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM1028
أدينوزين تريبوشبات (ATP)سيجما ألدريتشA6419
L-جلوتاثيون (GSH)سيجما AldrichG4251
ECM 830 نظام التثقيب الكهربائيBTX45-0002
Electroporation Cuvette   4 ممجهاز هارفارد45-0126
Crytal VioletAlfa AesarB21932-14
6 آبار TC لوحةCorning353046
24 بئر TC لوحةCorning353935
غطاء زجاجي دائري 12 ممVWR International89015-724
96 بئر TC لوحةCorning353075
Gibson Assembly Simulator Kit (متعدد الأجزاء)New England BiolabsE5510S
Q5 بوليميراز عالي الدقة   ؛New England BiolabsM0491S
PyrimethamineTCI AMERICAP2037-1Gاستخدم التكتيم عند استخدام الطفيليات المقاومة للبيريميثامين - انظر البروتوكول
مرشح مقياس

المراجع

  1. Dubey, J. P. The history of Toxoplasma gondii--the first 100 years. J Eukaryot Microbiol. 55 (6), 467-475 (2008).
  2. Behnke, M. S., Khan, A., Sibley, L. D. Genetic Mapping Reveals that Sinefungin Resistance in Toxoplasma gondii Is Controlled by a Putative Amino Acid Transporter Locus That Can Be Used as a Negative Selectable Marker. Eukaryot Cell. 14 (2), 140-148 (2015).
  3. Dubey, J. P. History of the discovery of the life cycle of Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. 39 (8), 877-882 (2009).
  4. Pfefferkorn, L. C., Pfefferkorn, E. R. Toxoplasma gondii: genetic recombination between drug resistant mutants. Exp Parasitol. 50 (3), 305-316 (1980).
  5. Donald, R. G., Roos, D. S. Insertional mutagenesis and marker rescue in a protozoan parasite: cloning of the uracil phosphoribosyltransferase locus from Toxoplasma gondii. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5749-5753 (1995).
  6. Sullivan, W. J. Jr Insertional tagging of at least two loci associated with resistance to adenine arabinoside in Toxoplasma gondii, and cloning of the adenosine kinase locus. Mol Biochem Parasitol. 103 (1), 1-14 (1999).
  7. Khan, A. Composite genome map and recombination parameters derived from three archetypal lineages of Toxoplasma gondii. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2980-2992 (2005).
  8. Khan, A. NextGen sequencing reveals short double crossovers contribute disproportionately to genetic diversity in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15 (1), 1168(2014).
  9. Shaik, J. S., Khan, A., Beverley, S. M., Sibley, L. REDHORSE-REcombination and Double crossover detection in Haploid Organisms using next-geneRation SEquencing data. BMC Genomics. 16 (1), 133(2015).
  10. Arends, D., Prins, P., Jansen, R. C., Broman, K. W. R/qtl: high-throughput multiple QTL mapping. Bioinformatics. 26 (23), 2990-2992 (2010).
  11. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  12. Koboldt, D. C. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  13. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9. MBio. 5 (3), e01114(2014).
  14. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryot Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
  15. Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryot Cell. 8 (4), 530-539 (2009).
  16. Wang, J. L. The Past, Present, and Future of Genetic Manipulation in Toxoplasma gondii. Trends Parasitol. , (2016).
  17. Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient genome engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. PLoS One. 9 (6), e100450(2014).
  18. Sugi, T., Kato, K., Weiss, L. M. An improved method for introducing site-directed point mutation into the Toxoplasma gondii genome using CRISPR/Cas9. Parasitol Int. , (2016).
  19. Behnke, M. S. Rhoptry Proteins ROP5 and ROP18 Are Major Murine Virulence Factors in Genetically Divergent South American Strains of Toxoplasma gondii. PLoS Genet. 11 (8), e1005434(2015).
  20. Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  21. Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
  22. Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Cong, L. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  24. Mali, P. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  25. Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S., Doudna, J. A. STRUCTURAL BIOLOGY. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science. 348 (6242), 1477-1481 (2015).
  26. Nishimasu, H. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  27. The R Project for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org (2016).
  28. Smith, R., Sheppard, K., DiPetrillo, K., Churchill, G. Quantitative trait locus analysis using J/qtl. Methods Mol Biol. 573, 175-188 (2009).
  29. The Churchill Group. , J/qtl. http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml (2013).
  30. Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Kurtz, S. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome Biol. 5 (2), (2004).
  32. Gajria, B. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36 (Database issue), D553-D556 (2008).
  33. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  34. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol. 219, 247-259 (1996).
  35. Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
  36. Lander, E. S., Botstein, D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics. 121 (1), 185-199 (1989).
  37. Saeij, J. P. Polymorphic secreted kinases are key virulence factors in toxoplasmosis. Science. 314 (5806), 1780-1783 (2006).
  38. Saeij, J. P. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  39. Rosowski, E. E. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  40. Reese, M. L., Zeiner, G. M., Saeij, J. P., Boothroyd, J. C., Boyle, J. P. Polymorphic family of injected pseudokinases is paramount in Toxoplasma virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9625-9630 (2011).
  41. Taylor, S. A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogen Toxoplasma gondii. Science. 314 (5806), 1776-1780 (2006).
  42. Behnke, M. S. Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9631-9636 (2011).
  43. Lorenzi, H. Local admixture of amplified and diversified secreted pathogenesis determinants shapes mosaic Toxoplasma gondii genomes. Nat Commun. 7, 10147(2016).
  44. Gubbels, M. J. Forward genetic analysis of the apicomplexan cell division cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36(2008).
  45. Farrell, A. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  46. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), (2012).
  47. Walwyn, O. Forward genetics screens using macrophages to identify Toxoplasma gondii genes important for resistance to IFN-gamma-dependent cell autonomous immunity. J Vis Exp. (97), (2015).
  48. Rugarabamu, G., Marq, J. B., Guerin, A., Lebrun, M., Soldati-Favre, D. Distinct contribution of Toxoplasma gondii rhomboid proteases 4 and 5 to micronemal protein protease 1 activity during invasion. Mol Microbiol. 97 (2), 244-262 (2015).
  49. Varberg, J. M., Padgett, L. R., Arrizabalaga, G., Sullivan, W. J. Jr TgATAT-Mediated alpha-Tubulin Acetylation Is Required for Division of the Protozoan Parasite Toxoplasma gondii. mSphere. 1 (1), (2016).
  50. Zheng, J., Jia, H., Zheng, Y. Knockout of leucine aminopeptidase in Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. Int J Parasitol. 45 (2-3), 141-148 (2015).
  51. Long, S., Wang, Q., Sibley, L. D. Analysis of Noncanonical Calcium-Dependent Protein Kinases in Toxoplasma gondii by Targeted Gene Deletion Using CRISPR/Cas9. Infect Immun. 84 (5), 1262-1273 (2016).
  52. Wang, K. Identification of Novel O-Linked Glycosylated Toxoplasma Proteins by Vicia villosa Lectin Chromatography. PLoS One. 11 (3), e0150561(2016).
  53. Yang, M., Zheng, J., Jia, H., Song, M. Functional characterization of X-prolyl aminopeptidase from Toxoplasma gondii. Parasitology. , 1-7 (2016).
  54. Zhang, W. Analysis of the virulence determination mechanisms in a local Toxoplasma strain (T.gHB1) isolated from central China. Parasitol Res. , (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقاومة السينيفونجينتسلسل الجينوم الكاملالخريطة الجينيةتحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردةتحرير الجيناتاستزراع الطفيلياتالتثقيب الكهربائي
كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.