مقالة منهجية

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

DOI:

10.3791/55196

⸱

نوفمبر 1, 2017

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، فإننا نقدم pluripotent البشرية بروتوكولات الثقافة الخلايا الجذعية (هبسك)، يستخدم للتفريق بين هبسكس إلى CD34+ فروعه المكونة للدم. يستخدم هذا الأسلوب الخاصة بمرحلة التلاعب الكنسي WNT الإشارات لتحديد الخلايا حصرا لأي برنامج نهائي أو البدائية المكونة للدم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد الأهداف الرئيسية للطب التجديدي هو الجيل والحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). حتى وقت قريب، الجهود الرامية إلى التمييز بين هبسكس إلى هسكس الغالب ولدت فروعه المكونة للدم التي تفتقر إلى إمكانات HSC، وبدلاً من ذلك تشبه كيس ألمح هيماتوبويسيس. قد تكون محدودة فروعه المكونة للدم الناتجة عن هذه الأداة المساعدة لفي المختبر النمذجة المرض من مختلف الاضطرابات المكونة للدم الكبار، لا سيما تلك المتعلقة الأنساب اللمفاوية. بيد أننا مؤخرا وصف أساليب توليد اريثرو-ميلو-اللمفاوية فروعه المكونة للدم نهائي مولتيلينيجي من هبسكس استخدام بروتوكول تمايز موجهة الخاصة بالمرحلة، التي تبين لنا هنا. من خلال الانفصال الانزيمية من هبسكس على الغشاء بلاستيكواري المغلفة بالمصفوفة، تتشكل الهيئات امبريويد (EBs). ميزت الحديدية إلى ميسوديرم من BMP4 المؤتلف، التي تم تحديدها في وقت لاحق إلى نهائي البرنامج المكونة للدم مثبط GSK3β، CHIR99021. بدلاً من ذلك، يتم تحديد هيماتوبويسيس البدائية من مثبط بوركن، IWP2. هيماتوبويسيس إضافية مدفوعة عن طريق إضافة المؤتلف VEGF وداعمة السيتوكينات المكونة للدم. موروث المكونة للدم الناتجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب لديها القدرة على استخدامها للمرض والنمذجة التنموية، و في المختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) وتعرف بأنها تشمل كلا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، ولديها القدرة على فريدة من نوعها ليس فقط تمر الذاتي تجديد تحت ظروف النمو المناسبة، ولكن أيضا، القدرة على التفريق في جميع أنواع الخلايا المستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث: الأنسجة، mesoderm، والأديم الظاهر1. بسبب هذه قدرات فريدة من نوعها، هبسكس تبشر كبيرة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والعلاج يستند إلى الخلية2. بينما تم بنجاح التمييز بين أنواع متعددة من الخلايا من هبسكس، هو أحد التحديات الهامة في المختبر المواصفات حصرا الكبار مثل المستمدة من هبسك المكونة للدم الخلايا الجذعية (HSCs) وفروعه المكونة للدم نهائي.

أحد الحواجز المحتملة لتنمية البشرية هسكس من هبسكس هو وجود العديد من البرامج المكونة للدم في الجنين البشري3. البرنامج الأول الذي يخرج، يطلق عليه "هيماتوبويسيس البدائية،" ينشأ داخل الأنسجة اكسترامبريونيك صفار الكيس وأفضل تتميز بإنتاجها عابر اريثروبلاست موروث (أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية)، والضامة وميجاكاريوسيتيس. جدير بالذكر أن هذا البرنامج لا تثير هسكس ولا يعطي الارتفاع إلى فروعه اللمفاوية تي وب. ومع ذلك، كيس ألمح عابر تؤدي إلى فروعه المكونة للدم نهائية مقيدة، مثل السلف اريثرو النقوي (EMP4،5،6،،من78) وتفتقر إلى محمر اللمفاوية معبي multipotent السلف (لمب9). ومع ذلك، EMPs لا لمبس multipotent تماما، أو قادرة على انجرافتمينت مثل HSC في المستفيدين الكبار. على النقيض من ذلك، لاحقاً في التنمية، ويتم تحديد البرنامج المكونة للدم "نهائي" محددة بطريقة كلاسيكية في منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنين السليم، مما أدى إلى جميع الأنساب المكونة للدم الكبار، بما في ذلك HSC. مواصفات هذه الخلايا المكونة للدم نهائي داخل الجنينية يحدث بطريقة تعتمد على درجة، عبر مرحلة انتقالية غشائي--إلى--المكونة للدم من هيموجينيك البطانة (أنه)3،10،11 ،،من1213،14. وبصرف النظر عن القدرة على إعادة تشكيل، يمكن استخدام مولتيلينيجي المحتملة، ودرجة الاعتماد على هذه الخلايا لتمييز هذه فروعه المكونة للدم نهائياً من النبض الكهرومغناطيسي ولمب (إعادة النظر في الإشارات3،13 ).

فهم الآليات الناظمة البدائية ونهائي مواصفات المكونة للدم من هبسكس المرجح الحرجة لإنتاج استنساخه من فروعه المكونة للدم نهائي عبر مجموعة متنوعة من خطوط هبسك. حتى وقت قريب، هبسك التمايز البروتوكولات التي يمكن أن تفصل multipotent فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي لا يوجد17،15،،من1618، 19،20،21،،من2223،،من2425. العديد من نهج استخدام مصل الدم البقري الجنين (FBS) و/أو الثقافة المشتركة stromal أولاً أوجز إمكانات المكونة للدم هبسك التمايز، مع خليط من البدائية والنهائية المكونة للدم المحتملين15،16، 17،،من1922،،من2325. علاوة على ذلك، وقد وصف العديد من البروتوكولات المكونة للدم خالية من المصل متطلبات إشارة لمواصفات mesoderm من هبسكس التي تؤوي المكونة للدم المحتملة18،،من2021، 24-ومع ذلك، كما لا تزال هذه الأساليب قد أثارت مخاليط غير متجانسة من كلا البرنامجين، قد يكون استخدامها في التطبيقات السريرية، وفهم آليات إنمائية محدودة.

أننا بنينا مؤخرا في هذه الدراسات، وقد حددت احتياجات الإشارات الخاصة بمرحلة أضافت/نضال وإشارات WNT في مواصفات المكونة للدم البدائية ونهائي من mesoderm المستمدة من هبسك18،26 . هذا الأخير كان خاصة فريدة من نوعها، كما استخدامها لمعالجة الإشارات WNT الخاصة بالمرحلة يسمح لمواصفات أما حصرا بدائية أو حصرا فروعه المكونة للدم نهائي26. خلال مواصفات mesoderm، يؤدي إلى تثبيط الإشارات WNT المتعارف عليه مع مثبط بوركن IWP2 مواصفات CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية وفروعه النقوي، مع احتمال اللمفاوية لا يمكن كشفها. في تناقض حاد، أدى حفز الكنسي WNT الإشارات مع مثبط GSK3β، CHIR99021، خلال المرحلة ذاتها من التمايز الغياب الكامل للاكتشاف CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية، بينما تؤدي في الوقت نفسه إلى مواصفات CD34+CD43− أنه. تمتلك هذه الفئة من السكان النقوي، HBG-الإعراب عن محمر، وإمكانات T اللمفاوية. التحاليل اللاحقة حددت هذا كان أنها تفتقر إلى التعبير عن CD7327،28 و CD18428، وإمكاناتها المكونة للدم تعتمد على درجة28. أظهرت التحليلات الاستنساخ علاوة على ذلك، خلية واحدة أن هذه السلالات المكونة للدم نهائي يمكن أن تستمد من خلايا مفردة multipotent28. أخذت معا، تشير هذه الدراسات إلى أن تحديد WNT مرحلة محددة مما يشير إلى التلاعب نقية فروعه المكونة للدم البدائية، أو تعتمد على درجة multipotent نهائي فروعه المكونة للدم.

هنا، فإننا مخطط استراتيجيتنا التمايز غلة فروعه المكونة للدم حصرا بدائية أو نهائية، عن طريق التلاعب بالمتعارف عليه WNT الإشارات خلال الزخرفة ميسوديرمال، وهذه النسب المكونة للدم المصب فحوصات. هذا البروتوكول قيمة كبيرة للمحققين الذين يرغبون في إنتاج بدائية أو نهائي أما فروعه المكونة للدم من هبسكس لتطبيقات الطب التجديدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الكواشف

،
  1. الحصول على خلية خطوط؛ هيسكس أو هيبسكس 1، الماوس الليفية الجنينية (MEFs) 29، OP9-DL4 ستروما 30 31-
  2. إعداد كاشف
    1. تعد حلاً 0.1% w/v الجيلاتين في برنامج تلفزيوني. تعقيم بالتعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية بعد اليقوتينج.
      1. تحضير بلاستيكواري المغلفة بالجيلاتين. معطف الأطباق 6-جيدا مع 1.5 مل من محلول الجيلاتين 0.1%. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فورا قبل الاستخدام، نضح المتبقية الجيلاتين الحل.
    2. تحضير الوسائط MEF بجعل إيمدم مع 15% v/v FBS والمضادات الحيوية 1 x. تكملة مع 2 مم L-الجلوتامين و 400 ميكرون مونوثيوجليسيرول (قهوة) قبل استخدامها وتخزينها في 4 ° C.
    3. إعداد وسائط الثقافة هبسك كحل من DMEM/F12 مع 20% v/v خروج المغلوب المصل الاستبدال (قصر)، 1 x الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا) والمضادات الحيوية x 1، 55 ميكرومتر β-mercaptoethanol، مم 2 لتر-الجلوتامين و 10 نانوغرام/مل بفجف. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزينها في الظلام في 4 ° C.
    4. تحضير المصل خالية يغسل وسائط الإعلام كحل من DMEM/F12 مع 5% v/v قصر و 4 ملم HCl. تصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر، الكوة، وتخزينها في الظلام في 4 ° C.
      5. جعل
    5. 1 ملغ/مل الدناز أنا الحل بتذويب الدناز أنا ح 3-4 في المياه المثلج، العقيمة على الجليد. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    6. إعداد الحل وقف مع وسائل الإعلام يغسل: إضافة 10% FBS و 10 ميكروغرام/مل الدناز أنا. وينبغي إعداد الحل إيقاف فورا قبل الاستخدام.
    7. إعداد مصفوفة الغشاء (مثلاً، ماتريجيل، المشار إليها كحصيرة الممتلكات) حل الخليط.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون تنفيذ كافة الخطوات إعداد واستخدام خليط حصيرة على الجليد أو في 4 ° جيم ذوبان الجليد مجمدة حصيرة في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تمييع حصيرة 1:1 بإضافة 10 مل المثلج إيمدم والبرد في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تمييع خليط حصيرة مع 20 مل إضافية المثلج إيمدم والبرد في الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قاسمة في أنابيب مبردة مسبقاً ومخزن في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. عندما تكون جاهزاً للاستخدام، ذوبان الجليد الخليط الشروط المتفق عليها تبادلياً بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لوحات ثقافة الخلية
      1. معطف حصيرة.
        ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات لطلاء ألواح حصيرة على الجليد. قبل chill لوحات 6-جيدا وكذلك 24 في-20 درجة مئوية على الأقل 1 ح. عندما تكون جاهزاً للوحات معطف، وضعها على الجليد. معطف كل بئر مع حصيرة 4 x المخفف، إزالة وإعادة استخدام أي حل الزائدة. ترك على الجليد لمدة 30-60 دقيقة، ونضح حصيرة الزائدة. الجاف للألواح المغلفة حصيرة في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة للحد ني حاء 3 الاستخدام داخل ح 72 لطلاء.
    8. إعداد حل 10% ألبومين المصل البقري (BSA) بتذويب 10% w/v جيش صرب البوسنة في الماء المثلج، المقطر، منزوع في 4 درجات مئوية عن 3-4 ﻫ. تصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر في زجاجة حجب الضوء ومخزن في 4 ° C.
    9. إعداد الحل حمض الأسكوربيك. يحل حلاً 5 ملغ/مل من حمض الأسكوربيك L في الماء المثلج، المقطر، منزوع على الجليد حاء 3-4 دوامة أحياناً حتى يذوب ببطء. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    10. تحضير الوسائط التمايز خالية من المصل (الصندوق) بجعل حل أقاليمهم IMDM:Ham ' s F-12، ثم قم بإضافة 0.5% جيش صرب البوسنة، 1 x B27، و 0.5 x N2 ملاحق. مخزن في 4 ° إضافة جيم 1 x لام الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك، 400 ميكرون قهوة، و 150 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين السابقة مباشرة لاستخدام-
    11. إعداد وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل الخلايا الجذعية (مثلاً، ستيمبرو، يشار SP34 الممتلكات) كل الشركة المصنعة ' تعليمات s. مخزن في 4 ° إضافة جيم 1 x لام الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك، 400 ميكرون قهوة، و 150 ميكروغرام/مل هولو-ترانسفيرين السابقة مباشرة لاستخدام-
    12. إعداد الحل "الثاني كولاجيناز" 0.2% بحل "ثانيا كولاجيناز" بتركيز 0.2% w/v في 1:4 FBS:PBS الحل نهائي. تذوب في حمام الماء 37 درجة مئوية على الأقل 15 دقيقة عامل التصفية لتعقيم الحل مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    13. إعداد المخزن المؤقت Fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) كحل 5% FBS في إيمدم السابقة مباشرة لاستخدام-
    14. OP9 إعداد الوسائط كحل α-الفنزويلية، 20% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين، والمضادات الحيوية 1 x. عامل التصفية لتعقيم مع عامل تصفية 2 ميكرومتر وتخزينها في 4 ° C.
    15. الحصول على وسائل الإعلام على أساس ميثيلسيلولوسي (مثلاً، ميثوكولت، يشار إليه كوزارة التعليم والعلوم بالممتلكات) كميات ما قبل اليكووتيد 3 مل أو كزجاجة 100 مل. في حالة استخدام 100 مل وزارة التعليم والعلوم، ولدى وصوله، تقسم إلى مختبرين 2.5 مل في أنابيب مخروطية الشكل 14 مل.
      ملاحظة: يجب تخزين كافة مختبرين في-20 درجة مئوية. وزارة التعليم المتوسط ينبغي إذابة مختبرين فورا قبل أن استخدام.

2. التفريق بين mesoderm هبسكس

  1. تنمو هبسك خطوط الخلايا في ميفس إلى كونفلوينسي 70-80%، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
    ملاحظة: يجب أن يكون هبسكس حدود حادة وغير متمايزة.
  2. بلاستيكواري المغلفة "إعداد حصيرة" 24 ساعة قبل باساجينج هبسكس-
    ملاحظة: يختلف العدد الإجمالي للاطباق 6-جيدا المغلفة حصيرة عبر خطوط هبسك. عادة، تكفي ثلاثة آبار 6 أطباق كل طبق 6-جيدا من هبسكس متكدسة في ميفس.
    1. إجراء محاكمة علبة التغذية بالورق-استنفاد مع نسب مختلفة من آبار hPSCs:MAT المتلاقية (1:4، 1:3، 1:2، إلخ) قبل المفاضلة الأولى لتحديد الأطباق 6-جيدا المغلفة حصيرة كم ينبغي أن تستخدم للاختلاف اللاحقة-
      ملاحظة: يجب أن يكون 24 ساعة بعد الطلاء على حصيرة، هبسكس روافد 80-90 في المائة، مع كتل خلية حوالي 10-20 في الخلايا في الحجم.
  3. اعقلوها هبسك وسائل الإعلام وإضافة 1 مل 37 درجة مئوية 0.25% التربسين-أدتا إلى كل خير بالنسبة للحد الأدنى 1 أسبيراتي وإضافة 1 مل توقف وسائل الإعلام لكل بئر. باستخدام مكشطة خلية، كشط الخلايا خارج اللوحة. أضف 1 مل أغسل المخزن المؤقت لكل بئر.
    1. مع بيبيت مصلية 2 مل، تريتوراتي 3-5 مرات كسر كتل كبيرة من الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الطرد المركزي هبسكس في 330 x ز للحد الأدنى 5
  4. ريسوسبيند الخلايا في إجمالي حجم الوسائط هبسك يعادل 2 مل كل بئر بلاستيكواري المغلفة حصيرة لاستخدامها. إضافة 2 مل/جيدا من هبسكس إلى بلاستيكواري واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
  5. 24 ساعة في وقت لاحق، نضح وسائط الإعلام، واستبدال مع 37 درجة مئوية 0.05% نضح التربسين-يدتا يدتا التربسين للحد الأدنى 1 وإضافة 1 مل توقف وسائل الإعلام. كشط الخلايا بقوة مع كاشطة لخلية. أضف 1 مل أغسل وسائط لكل بئر. مع بيبيت مصلية 2 مل، تريتوراتي الخلايا 1-2 مرات ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الطرد المركزي خلايا في 220 ز x للحد الأدنى 5
    ملاحظة: طول الوقت شو العلاج يدتا التربسينيحدد المحقق لكل خط هبسك دينار. وينبغي تطبيق معاملة التربسين لأطول فترة ممكنة دون أن تسبب تفكك خلية واحدة. هذه الخطوة يجب فصل جميع هبسكس من لوحات المغلفة بالشروط المتفق عليها تبادلياً، ولكن لا تؤدي إلى الانفصال من خلية واحدة. الحديدية الناتجة يجب أن تكون الخلايا 6-10، وفي المتوسط-
    6. نضح
  6. وسائل الإعلام. استخدام بيبيت مصلية 5 مل، ريسوسبيند برفق الخلايا في 20 مل أغسل وسائط الإعلام. أجهزة الطرد المركزي في 220 س ز للحد الأدنى 5
  7. ريسوسبيند برفق الحديدية في وسائل الإعلام اليوم 0 (الجدول 1). الاستغناء عن 2 مل التمايز الوسائط التي تحتوي على الحديدية إلى كل من طبق الثقافة خلية منخفض 6-جيدا-تمسكا باستخدام بيبيت مصلية 10 مل جيدا. مكان في 37 درجة مئوية 5% CO 2% 5 س 2 (الغاز متعددة) حاضنة.
    ملاحظة: اليوم 0 وسائط الإعلام: وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع 10 نانوغرام/مل BMP4 (الجدول 1). لكل لوحات اثنين من هبسكس، استخدام الخلية منخفض 6-جيدا-تمسكا الثقافة صحن واحد.
  8. 24 ساعة في وقت لاحق، إضافة 2 مل 1 اليوم وسائل الإعلام (الجدول 1). احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة غاز متعددة.
    ملاحظة: يوم 1 وسائل الإعلام: وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع 10 نانوغرام/مل BMP4 و 10 نانوغرام/مل بفجف لكل بئر (الجدول 1).
  9. ح 18 في وقت لاحق، حصاد الحديدية مع 5 مل بيبيت المصلية وتدور في 100 غ س لأدنى 5 يغسل برفق والجمع بين ثقافة كاملة مع 10 مل إيمدم. تدور في 100 غ س لأدنى 5 Aspirate وسائط الإعلام-
    ملاحظة: سوف يوجد الحطام في الثقافات. هذه الخطوة الطرد المركزي بسرعة منخفضة (100 x ز) سيتم إزالة الأنقاض.
  10. ريسوسبيند الحديدية لطف في وسائل الإعلام الصندوق الاجتماعي للتنمية تستكمل مع وسائل الإعلام يوم 2 (الجدول 1) ومن ثم الاستغناء عن 2 مل كل بئر في لوحات ثقافة الخلية منخفض 6-جيدا-تمسكا. احتضان في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة ل 30 h.
    ملاحظة: يوم 2 وسائط الإعلام: 10 نانوغرام/مل BMP4، و 5 نانوغرام/مل بفجف، ومناسبة WNT مؤثر أو خصم (الجدول 1).
    1. إضافة 3 ميكرومتر CHIR99021 لتحديد نهائي فروعه المكونة للدم. وبدلاً من ذلك، أضف 3 ميكرومتر IWP2 و 1 نانوغرام/مليلتر أضافت A لتحديد المتكفل المكونة للدم البدائية.
  11. الاستمرار في القسم 3 لمواصفات السلف المكونة للدم.

3-مواصفات CD34 + "فروعه المكونة للدم"

  1. بعد ح 30، عزل الحديدية مع بيبيت مصلية 2 مل في اليوم 3 من التفريق. نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 330 x ز 5 دقيقة ريسوسبيند بلطف ويغسل مع 10 مل إيمدم. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 330 x ز للحد الأدنى 5
  2. ريسوسبيند الحديدية في وسائل الإعلام اليوم 3 (الجدول 2)، والاستغناء عن 2 مل في كل من لوحات ملتصقة منخفضة 6-جيدا جيدا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة ل 72 h.
    ملاحظة: يوم 3 وسائط: SP34، وتستكمل مع 15 نانوغرام/ملليلتر VEGF وبفجف 5 نانوغرام/مليلتر (الجدول 2). إضافة المزيد من الوسائط للبئر الواحد إذا كان الرقم الهيدروجيني لوسائل الإعلام تحصد في يوم 3 من التمايز تغيرا كبيرا (أي وسائل الإعلام الأصفر-البرتقالي). بدلاً من ذلك استخدام الحديدية أقل للبئر الواحد في اليوم 0-
  3. ح بعد 72 من الحضانة، إضافة 2 مل 6 اليوم وسائل الإعلام (الجدول 2) لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية غاز متعددة حاضنة h. 48 إضافية
    ملاحظة: يوم 6 وسائط الإعلام: الإعلام SP34 تستكمل مع 15 نانوغرام/مل فيجف 5 نانوغرام/مل بفجف، 200 نانوغرام/مليلتر SCF، 4 وحدة دولية البراءات، 20 نانوغرام/مليلتر إيل-6، 10 نانوغرام/مل 11 إيل و 50 نانوغرام/مل IGF-1 (الجدول 2). إذا تمت إضافة المزيد من الوسائط في الخطوة 3.1، ثم إضافة المبلغ المعادل لوسائل الإعلام في الخطوة 3، 2 حتى تظل التركيزات سيتوكين النهائي نفسه.
    4. عزل
  4. الحديدية تعامل CHIR99021 في يوم 8 من التفريق. انتقل إلى القسم 4-
  5. IWP2--يتم حصادها الحديدية المعالجة في يوم 8 من التمايز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 ريسوسبيند برفق في وسائل الإعلام اليوم 8 (الجدول 2). احتضانها ح 24 في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة في الأطباق ملتصقة منخفضة. انتقل إلى القسم 4-
    ملاحظة: يوم 8 وسائل الإعلام: الإعلام SP34 تستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر SCF، 2 وحدة دولية البراءات، 10 نانوغرام/مل إيل-6، 5 نانوغرام/مليلتر إيل-11، 25 نانوغرام/مل منتدى إدارة الإنترنت-1، 30 نانوغرام/مليلتر TPO، 10 نانوغرام/مل Flt3-L، و 30 نانوغرام/مليلتر إيل-3 (الجدول 2).

4. الانزيمية تفارق الحديدية والمكونة للدم السلف العزلة

أنبوب
  1. عزل الحديدية مع بيبيت مصلية إلى 50 مل مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية.
    2. إضافة
  2. 2 مل من 0.25% التربسين-يدتا الحديدية. دوامة إينكوباتي س. 5 في حمام مائي 37 درجة مئوية للحد الأدنى 8 إضافة 5 مل من محلول الإيقاف. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية.
  3. ريسوسبيند الحديدية في 5 مل كولاجيناز الثاني. دوامة ل 5 ق واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 60 دقيقة، دوامة ل 5 ق وإضافة 5 مل من محلول الإيقاف. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5 Aspirate قبالة المادة طافية.
  4. في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، ريسوسبيند الخلايا. تمر الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. يؤدي هذا إلى إزالة أي كتل الخلايا أونديسوسياتيد-
  5. عد الخلايا. الكوة 1 × 10 6 خلايا في أنبوب مخروطي 14 مل. تدور الخلايا في 330 x ز لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 10 6 خلايا/مل في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. قاسمة وتجمع 10% من الخلايا في كل شرط لتدفق عناصر تحكم بالألوان سيتوميتريك. احتضان الخلايا في أجسام مضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد، وفي الظلام-
    ملاحظة: انظر اقترح تركيبات فلوروفوري في الجدول للمواد.
    1. IWP2 لتعامل الخلايا، استخدام الأجسام المضادة-CD34 ومكافحة CD43.
    2. CHIR99021 لتعامل الخلايا، استخدام الأجسام المضادة-CD34، CD43 المضادة ومكافحة--CD73 ومكافحة--CD184-
  6. شطف الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا بتركيز نهائي 5 × 10 6 خلايا/مل.
  7. تحليل أو عزل الخلايا بالتدفق الخلوي. لفروعه المكونة للدم البدائية، تحليل التعبير CD34 و CD43 ( الشكل 2A). لفروعه المكونة للدم نهائي، عزل أنه (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) بنظام مراقبة الأصول الميدانية ( الشكل 2). جمع الخلايا في أنابيب تحتوي على المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية المثلجة.
  8. لتقييم إمكانات المكونة للدم نهائياً من عزلة أنه، الاستمرار في القسم 5 للانتقال غشائي--إلى--المكونة للدم، أو القسم 7 للمقايسة T اللمفاوية. لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية المكونة للدم البدائية، الاستمرار في القسم 6-

5. الانتقال غشائي--إلى--المكونة للدم

  1. تدور CD34 المعزولة + CD43 − CD73 − CD184 − ريسوسبيند الخلايا في 330 x ز للحد الأدنى 5 خلايا في أنه وسائل الإعلام في 200,000 خلايا/مل ( الجدول 2). توزيع الخلايا في 50 ميليلتر مختبرين في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا منخفض-ملتصقة. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 5% 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون 5% O 2 2 حاضنة غاز متعددة.
    ملاحظة: أنه وسائل الإعلام: SP34 وسائل الإعلام وتستكمل مع 5 نانوغرام/مل VEGF، 5 نانوغرام/مل بفجف، 100 نانوغرام/مليلتر SCF، 2 وحدة دولية البراءات، 10 نانوغرام/مل إيل-6، 5 نانوغرام/مليلتر إيل-11, 25 نانوغرام/مل منتدى إدارة الإنترنت-1، 30 نانوغرام/مليلتر TPO، 10 نانوغرام/مل FLT3-L، 30 نانوغرام/مليلتر إيل-3، 10 نانوغرام/مل BMP4، 20 نانوغرام/مليلتر SHH، 10 ميكروغرام/مل "الثاني انجيوتنسين"، وبوتاسيوم اللوسارتان 100 ميكرومتر في 2 × 10 5 خلايا/مل (الجدول 2).
  2. إعداد 24-جيدا المغلفة حصيرة لوحات (راجع الخطوة 1.2.7.1)، وحسب الحاجة.
  3. الخلايا سوف تتجمع في كتل من 6-10 خلايا بين عشية وضحاها. لكل 50 ميليلتر حجم الخلايا ريجريجاتيد، بلطف نقل الخلايا داخل المركز من صفيحة المغلفة حصيرة 24-جيدا في صباح اليوم التالي. بلطف ضع لوحة في 37 درجة مئوية الغاز متعددة حاضنة ح 4-6، حتى يتم إرفاق الخلايا.
  4. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام أنه الطازجة لكل بئر، بعد أن يتم إرفاق الخلايا. احتضان الخلايا في 5% 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون 5% O 2 2 حاضنة غاز متعددة حتى تظهر الخلايا المكونة للدم (عادة 5-7 أيام؛ الشكل 2D). تصور تحت 100 X التكبير باستخدام مجهر ضوء.
  5. الحصاد موروث المكونة للدم نهائي بلطف إزالة وسائل الإعلام أنه من الخلايا. تمرير هذه الوسائط من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع. للخلايا ملتصقة في البئر، قم بإضافة 0.5 مل 0.25% التربسين-أدتا إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إضافة 0.5 مل وقف الحل لكل بئر. تمرير من خلال الخلايا من خلال نفس مصفاة خلية 40 ميكرومتر تجمع جميع ملتصقة والخلايا غير ملتصقة معا. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
    1. لتقييم إمكانات هذه الثقافة معظم مركبات الكربون الكلورية فلورية، تابع إلى القسم 6.
  6. تغسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
  7. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 5 × 10 6 خلايا/مل. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على أجسام المضادة CD45 ومكافحة-CD34 لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام (اقترح fluorophores في الجدول للمواد)-
    8. أغسل
  8. الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
    9. عزل
  9. CD34 + CD45 + الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية ( الشكل 2E). فرز الخلايا في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية المثلجة.
  10. تقييم CD34 نهائي + CD45 + فروعه المكونة للدم كاللازمة (مقايسة مركبات الكربون الكلورية فلورية في القسم 6 أو إمكانات اللمفاوية في الفرع 7 المقايسة آخر بدأ المحقق).

6. مركبات الكربون الكلورية فلورية بالانزيم

  1. ذوبان الجليد مختبرين لوزارة التعليم والعلوم لكل عينة المستخدمة لتحليل مركبات الكربون الكلورية فلورية-
    2. إضافة
  2. الخلايا لتكون جزيئي (خطوات 4.5 أو 4.7 أو 5.5 أو 5.9) في وزارة التعليم والعلوم. دوامة جيدا وترك الثقافات MeC الوقوف لمدة 5-10 دقائق حتى تتبدد فقاعات الهواء، وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. استخدام 16 ½ قياس الإبرة على حقنه 3 مل، بعناية إزالة 2 مل من وزارة التعليم والعلوم-
    ملاحظة: نموذجية والطلاء كثافات تتراوح من 1,000 20,000 خلايا/مل، تبعاً لتواتر السلف المتوقعة.
  3. الاستغناء بعناية، 1 مل MeC خلية الخليط في كل واحد من اثنين من الأطباق زراعة الأنسجة 35 ملم. توزيع وزارة التعليم والعلوم في الأطباق 35 ملم بالتنصت بلطف وتدوير الطبق بالتساوي. ضع كل من الأطباق المذكورة أعلاه إلى طبق استنبات الأنسجة 15 سم مملوءة بالمياه. احتضان في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة.
  4. تصور ثقافات MeC استخدام مجهر ضوء باستخدام 40 X التكبير. تحديد كمية مركبات الكربون الكلورية فلورية المختلفة التي تم الحصول عليها. تحليل فحوصات "البدائية مركبات الكربون الكلورية فلورية" 8-10 أيام بعد الطلاء ( الشكل 2). تحليل فحوصات "نهائية مركبات الكربون الكلورية فلورية" 14 يوما بعد الطلاء. يمكن رؤية الممثل مركبات الكربون الكلورية فلورية المقايسة مستعمرة مورفولوجيس في الشكل 2 واو-

7. والرزن خلية T إلى "وضع نهائي المكونة للدم المحتملة"

  1. النمو OP9-DL4 الخلايا حتى روافد في طبق استنبات الأنسجة 100 ملم 30 ، 31 ، 32-
    1. OP9-DL4 ذوبان الجليد خلايا ح 72-96 قبل التصفيحات فحوصات الخلايا T. ريسوسبيند OP9-DL4 الخلايا في 10 مل OP9 وسائل الإعلام والاستغناء عن إلى صفيحة 10 سم. تنمو في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة حتى روافد 70-90 ٪.
      2. قم بإزالة الوسائط
    2. لحصاد الخلايا OP9-DL4 من طبق 100 مم، وإضافة 5 مل 0.25% يدتا التربسين للحد الأدنى 5 وقف النشاط التربسين مع 5 مل OP9 وسائل الإعلام. عد الخلايا وتدور الخلايا في 330 x ز لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل الإعلام OP9-
      ملاحظة: لوح 10 سم واحد من الخلايا OP9-DL4 المتلاقية سوف تسفر عن حوالي 10 × 10 6 خلايا OP9-DL4-
    3. ح 48 قبل فحص خلية T، لوحة 2 × 10 6 خلايا في 12 مل OP9 وسائل الإعلام في صحن 24-جيدا (0.5 مل/جيد). تنمو في 37 درجة مئوية 5% CO 2 حاضنة.
  2. إضافة خلايا 2,000-10,000 تكون جزيئي (كما حصل في خطوات 4.5 أو 4.7 أو 5.5 أو 5.9) 1 جيدا من الخلايا OP9-DL4 في وسائل الإعلام OP9 وتستكمل مع: 30 نانوغرام/مليلتر (أول 6 أيام فقط) من صندوق إنقاذ الطفولة و 5 نانوغرام/مليلتر إيل-7 5 نانوغرام/مليلتر "احتضان" لام FLT3 في 37 درجة مئوية 5% CO 2 لجنة التفاوض الحكومية الدولية أوباتور. تحدث أية تغييرات في وسائل الإعلام في هذه الخطوة.
  3. كل 4-5 أيام، ممر المتكفل خلية T على الطازجة OP9-DL4 الخلايا اللحمية في طبق 6-جيدا. تريتوراتي الخلايا مع بيبيت 1 مل وتمر من خلال عامل تصفية 40 ميكرون لإزالة كتل. تدور في 330 x ز لأدنى 5 Aspirate قبالة وسائط الإعلام. ريسوسبيند الخلايا في 2 مل الإعلام OP9 جديدة تستكمل مع 5 نانوغرام/مل 7 إيل و 5 نانوغرام/مل Flt3-L، ومكان على الطازجة OP9-DL4 الخلايا.
    ملاحظة: 48 ساعة قبل باساجينج، لوحة 2 × 10 6 خلايا OP9-DL4 الطازجة في 12 مل OP9 وسائل الإعلام، وتوزيع 2 مل/بئر إلى الأطباق 6-جيدا-
  4. بعد 21 يوما على الأقل من الثقافة المشتركة، تريتوراتي الخلايا بقوة، وتمر من خلال عامل تصفية 40 ميكرون لإزالة الحطام خلية. تدور في 330 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.
    5. أغسل
  5. الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية الباردة. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
  6. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 5 × 10 6 خلايا/مل. خلايا وصمة عار مع الأجسام المضادة CD45 مكافحة و CD56 المضادة ومكافحة CD4 والمضادة-CD8 لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام (fluorophore المقترحة تركيبات في الجدول للمواد). تطبيق وصمة خلية يعيش الميت (DAPI، إلخ) لإزالة الحطام من التحليل-
    7. أغسل
  7. الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. تدور في 330 x ز للحد الأدنى 5
  8. تحليل الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق لتقييم وجود اللمفاويات التائية موروث ( الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح تخطيطي يصور تنصيب فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي من هبسكس في الشكل 1. Mesoderm الزخرفة قبل الكنسي WNT مما يشير إلى حدوث خلال أيام 2-3 للتمايز، تليها مواصفات السلف المكونة للدم.

تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك ومستعمرة تشكيل فحوصات methylcellulose الثقافات المستمدة من هبسك التمايز المكونة للدم مبينة في الشكل 2. سوف تسفر عن الثقافات التمايز تعامل IWP2 CD34 متميزة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول وصف أسلوب السريع، خالية من المصل، خالية من سدى للتفريق بين فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائية. يمكن تحقيق مواصفات ميسوديرمال من فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائي موثوق استخدام لدينا البروتوكول، الذي يستغل فريد مثبطات جزيء صغير من إشارات WNT المتعارف عليه. الخاصة بالمرحلة WNT التنشيط بواسطة مثبط GSK3β CHIR9902133 تثير mesoderm المكونة للدم نهائياً، بينما تعين تثبيط WNT بمثبطات بوركن IWP234 ميسوديرم المكونة للدم البدائية26. من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كلية الطب جامعة واشنطن قسم الطب الباطني، "شعبة أمراض الدم"، دعمت هذا العمل. وأيد مؤتمر نزع السلاح T32HL007088 من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد. وأيد "المجتمع الأمريكي لأمراض الدم الباحث جائزة" CMS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

مصل الجوزاء الحيوي المصنف بالخلايا الدم الدم الدم الدم متعددة الغازات اختبار 5 السلامة الخلايا حمام مائي TreeStar ثلاجة كورنينج أوتوكلاف - فريزر 20 سي - فريزر 80 سي

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco المتوسط المعدل (IMD)Corning10-016
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ،مصلES 100-500
مصل الأبقار الجنينية (FBS)HycloneSH30396.03
L-glutamine ، محلول 200 مليLife Technologies25030-081
البنسلين والستربتومايسينالحياة تقنيات15070-063
0.25٪ Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0.05٪ Trypsin-EDTALife Technologies25300054
الجيلاتين ، جلد الخنازير ، النوع ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
استبدال المصل بالضربة القاضيةLife Technologies10828028"KOSR"
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)Life Technologies11140050
b-mercaptoethanol ، محلول 55 ملي مولارLife Technologies21985023
حمض الهيدروكلوريكSigma-AldrichH1758
Fraction V ، مصل الأبقار الألبومينفيشر ملحق ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2Life Technologies17502048
B27 ، بدون فيتامين أتقنيات الحياة12587010
Stempro-34 (SP34) LifeTechnologies10639011"SP34"
عامل النمو يقلل من MatrigelCorning354230"MAT"
حمض الامتصاصسيجما ألدريتشA4403
ترانسفيرين مصل الإنسانسيجما ألدريتش10652202001
مونوثيوجلسرين (MTG)سيجما ألدريتشM6145
كولاجيناز بروش11088831001
كولاجيناز IIلايفتكنولوجيز 17101015
DNaseICalbiochem260913
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)تقنيات الحياة14190144
bFGFR& أنظمة D233-FB
BMP4R & D Systems314-BP
Activin AR& D Systems338-AC
VEGFR& D Systems293-VE
SCFR& D أنظمة255-SC
IGF-1R & أنظمةD 291-G1
IL-3R& أنظمة D203-IL
IL-6R & أنظمة D206-IL
IL-7R & أنظمة D207-IL
IL-11R& أنظمة D218-1L
TPOR & D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L)R & amp D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan PotassiumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 استنساخ RPA-T4BD Biosciences560650التخفيف 1:100 ؛ فحص الخلايا التائية
CD8 PE استنساخ RPA-T8BD Biosciences561950التخفيف 1:10 ؛ فحص الخلايا التائية
CD34 APC استنساخ 8G12BD Biosciences340441التخفيف 1: 100 ؛ اختبار EHT
CD34 PE-Cy7 استنساخ 8G12BD Biosciences348801التخفيف 1: 100 ؛ بطانة
CD43 FITC استنساخ 1G10BD Biosciences555475التخفيف 1:10 ؛ بطانة
CD45 APC-Cy7 استنساخ 2D1BD Biosciences557833التخفيف 1:50 ؛ فحص الخلايا التائية
CD45 eFluor450 استنساخ 2D1BD Biosciences642284التخفيف 1:50 ؛ اختبار EHT
CD56 APC استنساخ B159BD Biosciences555518التخفيف 1:20 ؛ فحص الخلايا التائية
CD73 PE استنساخ AD2BD Biosciences550257التخفيف 1:50 ؛ بطانة
CD184 APC استنساخ 12G5BD Biosciences555976التخفيف 1:50 ؛ بطانة
المنشأ 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)BD Biosciences564907التخفيف 1: 10,000; فحص الخلايا التائية
OP9 DL4 خلاياهولمز ، ر. وجي سي زونيجا بفلوكر. كولد سبرينج حرب بروتوك ، 2009. 2009 (2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
نظام تنقية المياهEMD Millipore
5٪ CO2 حاضنةمجموعة في 37 درجة مئوية
حاضنةعند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 5٪ O2
6 لوحة زراعة أنسجة الآبارCorning353046
24 لوحة زراعة أنسجة البئرCorning353226
6 آبار لوحة زراعة الأنسجة منخفضة الالتصاقCorning3471
24 لوحة ثقافة الأنسجة منخفضة الالتصاقCorning3473
35 مم أطباق زراعة الأنسجةCorning353001
إبرة حادة ، 16 مقياسCorning305198
3 cc محاقنكورنينج309657
5 مل البولي بروبيلين أنبوبكورنينج352063
5 مل البوليسترينكورنينج352058
15 مل البولي بروبيلين المخروطي430791كورنينج
50 مل بولي بروبيلين مخروطي430921
2 مل ماصة مصليةكورنينج357507
ماصة مصلية 5 ملكورنينج4487
10 مل ماصة مصليةكورنينج4488
25 مل ماصة مصليةكورنينج4489
كاشطات خلويةكورنينج353085
2.0 مل كريوفيالاتكورنينج430488
مل أنبوب اختبار مع 40 ميكرو ؛ مصفاة الخلايا MCorning352235
40 & micro; مصفاة الخلايا MCorning352340
شفاط
الحيوية لثقافة
FACS AriaII أو ما يعادله
من LSRii أو ما يعادله
من برنامج FlowJoمجموعة
عند 37 درجة مئوية
0.22 وميكرو ؛ نظام الترشيح M
4 سي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  3. Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
  4. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  5. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  6. McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
  7. Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
  8. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  9. Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
  10. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  11. Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
  12. Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
  13. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  14. Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
  15. Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
  16. Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
  17. Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
  18. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  19. Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
  20. Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
  21. Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
  22. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
  23. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
  24. Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
  25. Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
  26. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
  27. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
  28. Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
  29. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
  30. La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
  31. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
  32. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
  33. Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
  34. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
  35. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
  36. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  37. Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GSK3 PORCN VEGF FACS

مقالات ذات صلة