هنا، فإننا نقدم pluripotent البشرية بروتوكولات الثقافة الخلايا الجذعية (هبسك)، يستخدم للتفريق بين هبسكس إلى CD34+ فروعه المكونة للدم. يستخدم هذا الأسلوب الخاصة بمرحلة التلاعب الكنسي WNT الإشارات لتحديد الخلايا حصرا لأي برنامج نهائي أو البدائية المكونة للدم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أحد الأهداف الرئيسية للطب التجديدي هو الجيل والحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). حتى وقت قريب، الجهود الرامية إلى التمييز بين هبسكس إلى هسكس الغالب ولدت فروعه المكونة للدم التي تفتقر إلى إمكانات HSC، وبدلاً من ذلك تشبه كيس ألمح هيماتوبويسيس. قد تكون محدودة فروعه المكونة للدم الناتجة عن هذه الأداة المساعدة لفي المختبر النمذجة المرض من مختلف الاضطرابات المكونة للدم الكبار، لا سيما تلك المتعلقة الأنساب اللمفاوية. بيد أننا مؤخرا وصف أساليب توليد اريثرو-ميلو-اللمفاوية فروعه المكونة للدم نهائي مولتيلينيجي من هبسكس استخدام بروتوكول تمايز موجهة الخاصة بالمرحلة، التي تبين لنا هنا. من خلال الانفصال الانزيمية من هبسكس على الغشاء بلاستيكواري المغلفة بالمصفوفة، تتشكل الهيئات امبريويد (EBs). ميزت الحديدية إلى ميسوديرم من BMP4 المؤتلف، التي تم تحديدها في وقت لاحق إلى نهائي البرنامج المكونة للدم مثبط GSK3β، CHIR99021. بدلاً من ذلك، يتم تحديد هيماتوبويسيس البدائية من مثبط بوركن، IWP2. هيماتوبويسيس إضافية مدفوعة عن طريق إضافة المؤتلف VEGF وداعمة السيتوكينات المكونة للدم. موروث المكونة للدم الناتجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب لديها القدرة على استخدامها للمرض والنمذجة التنموية، و في المختبر.
المقدمة
الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) وتعرف بأنها تشمل كلا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، ولديها القدرة على فريدة من نوعها ليس فقط تمر الذاتي تجديد تحت ظروف النمو المناسبة، ولكن أيضا، القدرة على التفريق في جميع أنواع الخلايا المستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث: الأنسجة، mesoderm، والأديم الظاهر1. بسبب هذه قدرات فريدة من نوعها، هبسكس تبشر كبيرة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والعلاج يستند إلى الخلية2. بينما تم بنجاح التمييز بين أنواع متعددة من الخلايا من هبسكس، هو أحد التحديات الهامة في المختبر المواصفات حصرا الكبار مثل المستمدة من هبسك ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الكواشف
،- الحصول على خلية خطوط؛ هيسكس أو هيبسكس 1، الماوس الليفية الجنينية (MEFs) 29، OP9-DL4 ستروما 30 31-
- إعداد كاشف
- تعد حلاً 0.1% w/v الجيلاتين في برنامج تلفزيوني. تعقيم بالتعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية بعد اليقوتينج.
- تحضير بلاستيكواري المغلفة بالجيلاتين. معطف الأطباق 6-جيدا مع 1.5 مل من محلول الجيلاتين 0.1%. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فورا قبل الاستخدام، نضح المتبقية الجيلاتين الحل.
- تحضير الوسائط MEF بجعل إيمدم مع 15% v/v FBS والمضادات الحيوية 1 x. تكملة مع 2 ....
- تعد حلاً 0.1% w/v الجيلاتين في برنامج تلفزيوني. تعقيم بالتعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية بعد اليقوتينج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويتضح تخطيطي يصور تنصيب فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي من هبسكس في الشكل 1. Mesoderm الزخرفة قبل الكنسي WNT مما يشير إلى حدوث خلال أيام 2-3 للتمايز، تليها مواصفات السلف المكونة للدم.
تحليل تدفق الممثل سيتوميتريك ومستعمرة تشكيل فحوصات methylcellulose الثقافات المستمدة من هبسك التمايز المكونة للدم مبينة في الشكل 2. سوف تسفر عن الثقافات التمايز تعامل IWP2 CD34 متميزة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول وصف أسلوب السريع، خالية من المصل، خالية من سدى للتفريق بين فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائية. يمكن تحقيق مواصفات ميسوديرمال من فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائي موثوق استخدام لدينا البروتوكول، الذي يستغل فريد مثبطات جزيء صغير من إشارات WNT المتعارف عليه. الخاصة بالمرحلة WNT التنشيط بواسطة مثبط GSK3β CHIR9902133 تثير mesoderm المكونة للدم نهائياً، بينما تعين تثبيط WNT بمثبطات بوركن IWP234 ميسوديرم المكونة للدم البدائية26. من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
كلية الطب جامعة واشنطن قسم الطب الباطني، "شعبة أمراض الدم"، دعمت هذا العمل. وأيد مؤتمر نزع السلاح T32HL007088 من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد. وأيد "المجتمع الأمريكي لأمراض الدم الباحث جائزة" CMS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
مصل الجوزاء الحيوي المصنف بالخلايا الدم الدم الدم الدم متعددة الغازات اختبار 5 السلامة الخلايا حمام مائي TreeStar ثلاجة كورنينج أوتوكلاف - فريزر 20 سي - فريزر 80 سي
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Dulbecco المتوسط المعدل (IMD) | Corning | 10-016 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، | مصل | ES 100-500 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine ، محلول 200 ملي | Life Technologies | 25030-081 | |
| البنسلين والستربتومايسين | الحياة تقنيات | 15070-063 | |
| 0.25٪ Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| الجيلاتين ، جلد الخنازير ، النوع A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| استبدال المصل بالضربة القاضية | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol ، محلول 55 ملي مولار | Life Technologies | 21985023 | |
| حمض الهيدروكلوريك | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V ، مصل الأبقار الألبومين | فيشر ملحق Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 ، بدون فيتامين أ | تقنيات الحياة | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) Life | Technologies | 10639011 | "SP34" |
| عامل النمو يقلل من Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| حمض الامتصاص | سيجما ألدريتش | A4403 | |
| ترانسفيرين مصل الإنسان | سيجما ألدريتش | 10652202001 | |
| مونوثيوجلسرين (MTG) | سيجما ألدريتش | M6145 | |
| كولاجيناز ب | روش | 11088831001 | |
| كولاجيناز II | لايف | تكنولوجيز 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | تقنيات الحياة | 14190144 | |
| bFGF | R& أنظمة D | 233-FB | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R& D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R& D Systems | 293-VE | |
| SCF | R& D أنظمة | 255-SC | |
| IGF-1 | R & أنظمة | D 291-G1 | |
| IL-3 | R& أنظمة D | 203-IL | |
| IL-6 | R & أنظمة D | 206-IL | |
| IL-7 | R & أنظمة D | 207-IL | |
| IL-11 | R& أنظمة D | 218-1L | |
| TPO | R & D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R & amp D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 استنساخ RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | التخفيف 1:100 ؛ فحص الخلايا التائية |
| CD8 PE استنساخ RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | التخفيف 1:10 ؛ فحص الخلايا التائية |
| CD34 APC استنساخ 8G12 | BD Biosciences | 340441 | التخفيف 1: 100 ؛ اختبار EHT |
| CD34 PE-Cy7 استنساخ 8G12 | BD Biosciences | 348801 | التخفيف 1: 100 ؛ بطانة |
| CD43 FITC استنساخ 1G10 | BD Biosciences | 555475 | التخفيف 1:10 ؛ بطانة |
| CD45 APC-Cy7 استنساخ 2D1 | BD Biosciences | 557833 | التخفيف 1:50 ؛ فحص الخلايا التائية |
| CD45 eFluor450 استنساخ 2D1 | BD Biosciences | 642284 | التخفيف 1:50 ؛ اختبار EHT |
| CD56 APC استنساخ B159 | BD Biosciences | 555518 | التخفيف 1:20 ؛ فحص الخلايا التائية |
| CD73 PE استنساخ AD2 | BD Biosciences | 550257 | التخفيف 1:50 ؛ بطانة |
| CD184 APC استنساخ 12G5 | BD Biosciences | 555976 | التخفيف 1:50 ؛ بطانة |
| المنشأ 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | التخفيف 1: 10,000; فحص الخلايا التائية |
| OP9 DL4 خلايا | هولمز ، ر. وجي سي زونيجا بفلوكر. كولد سبرينج حرب بروتوك ، 2009. 2009 (2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| نظام تنقية المياه | EMD Millipore | ||
| 5٪ CO2 حاضنة | مجموعة في 37 درجة مئوية | ||
| حاضنة | عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 5٪ O2 | ||
| 6 لوحة زراعة أنسجة الآبار | Corning | 353046 | |
| 24 لوحة زراعة أنسجة البئر | Corning | 353226 | |
| 6 آبار لوحة زراعة الأنسجة منخفضة الالتصاق | Corning | 3471 | |
| 24 لوحة ثقافة الأنسجة منخفضة الالتصاق | Corning | 3473 | |
| 35 مم أطباق زراعة الأنسجة | Corning | 353001 | |
| إبرة حادة ، 16 مقياس | Corning | 305198 | |
| 3 cc محاقن | كورنينج | 309657 | |
| 5 مل البولي بروبيلين أنبوب | كورنينج | 352063 | |
| 5 مل البوليسترين | كورنينج | 352058 | |
| 15 مل البولي بروبيلين المخروطي | 430791 | كورنينج | |
| 50 مل بولي بروبيلين مخروطي | 430921 | ||
| 2 مل ماصة مصلية | كورنينج | 357507 | |
| ماصة مصلية 5 مل | كورنينج | 4487 | |
| 10 مل ماصة مصلية | كورنينج | 4488 | |
| 25 مل ماصة مصلية | كورنينج | 4489 | |
| كاشطات خلوية | كورنينج | 353085 | |
| 2.0 مل كريوفيالات | كورنينج | 430488 | |
| مل أنبوب اختبار مع 40 ميكرو ؛ مصفاة الخلايا M | Corning | 352235 | |
| 40 & micro; مصفاة الخلايا M | Corning | 352340 | |
| شفاط | |||
| الحيوية لثقافة | |||
| FACS AriaII أو ما يعادله | |||
| من LSRii أو ما يعادله | |||
| من برنامج FlowJo | مجموعة | ||
| عند 37 درجة مئوية | |||
| 0.22 وميكرو ؛ نظام الترشيح M | |||
| 4 سي | |||
المراجع
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic developme....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
