Method Article

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا عضلة القلب عرضة للتغيرات في دورة الخلية ، مثل التكرار الداخلي (الجولات المستمرة من تخليق الحمض النووي دون حركية النووية والحركية الخلوية) والانقسام الحركي الخلوي (الحركية النووية ولكن بدون الحركية الخلوية). تؤدي هذه الاختلافات غير النمطية في دورة الخلية إلى خلايا متعددة الصبغيات ومتعددة النوى بدلا من انقسام الخلايا. لذلك ، لتحديد دوران القلب وتجديده ، من الأهمية بمكان تحديد نوى خلايا عضلة القلب بشكل صحيح ، وعدد النوى لكل خلية ، وحالة دورة الخلية. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام العلامات النووية لتحديد نشاط دورة الخلية ، مثل نظائر الثايميدين Ki-67 أو PCNA أو pHH3. هنا ، نقدم طرقا للتعرف على خلايا عضلة القلب ونواتها وتحديد نشاط دورة الخلية. نستخدم نظامين معدلين وراثيا منشورين: خط الفأر المعدل وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وخط الفأر CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلية عن اختلافات دورة الخلية. يساهم هذان النظامان معا في تسهيل دراسة تجديد القلب واللدونة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديد الصحيح للنوى cardiomyocyte ووضع دورة الخلية هي ذات أهمية حاسمة لتحديد قيمة التداول عضلة القلب والتجدد. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام علامات النووية، مثل pHH3، كي-67، أو النظير ثيميدين، لتحديد النشاط دورة الخلية هذا. كما أن قدرة التكاثري العضلية الثدييات الكبار صغيرة جدا 1، هوية مزورة من نواة إيجابية لعلامة انتشار نواة cardiomyocyte يمكن أن تحدث فرقا حاسما في نتائج فحص انتشار الأسلحة النووية. وعلاوة على ذلك، العضلية عرضة للتغيرات في دورة الخلية، مثل تنسخ داخلي والانقسام acytokinetic، مما يؤدي في الخلايا المتعددة الصبغيات ومتعددة النوى وليس في انقسام الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، تفسير تلوين الأجسا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت جميع الإجراءات من هذا البروتوكول تنطوي على الحيوانات وفقا للمعايير الأخلاقية من جامعة بون وامتثلت للمبادئ التوجيهية من التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية.

1. في المختبر تصور آخر دورة الخلية في ما بعد الولادة العضلية

  1. بعد الولادة التفكك cardiomyocyte
    1. استعدادات ما قبل التجريبية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل تحليل آثار الرناوات siRNAs / miRNAs على النشاط دورة الخلية العضلية بعد الولادة في المختبر، العضلية من ضعف المعدلة وراثيا الفئران Myh6-H2B-صحة الأم والطفل / CAG-EGFP-anillin تم عزل في يوم ما بعد الولادة 3 (P3) وtransfected مع النشاط الذي يحفز دورة الخلية miR199 5، سيرنا P27، وسيرنا Fzr1. بالمقارنة مع سيطرة سلبية (الشكل 1A)، وصورا لmiR199- (الشكل 1B) وسيرنا p27- (الشكل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك جدل حول ما اذا العضلية قادرة على إعادة إدخال دورة الخلية وتقسيم بعد الاصابه وخلال توازن الأنسجة. وقد تم إعطاء القيم لدوران الأساسي العضلية في نطاق بين 1٪ 1 و 80٪ 7. أيضا بعد الآفة القلبية، وقد تم الإبلاغ عن تحريض النشاط دورة الخلية وتوليد العضلية الجديدة في المنطقة الحدودية، مع القيم بين 0.0083٪ 8 و 25 - 40٪ 7. يمكن أن يفسر جزئيا هذه التناقضات التي كتبها النهج التجريبية المختلفة لت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر S. Grünberg (بون، ألمانيا) و P. Freitag (بون، ألمانيا) على مساعدتهما الفنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طبق بتري 10 سمSarstedt821472
100 & micro ؛ مصفاة الخلايا mBecton Dickinson GmbH / Falcon352360
2،3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ ؛ قنية الحقن ، StericanBraun ، Melsungen4657519
إبرة قياس 20Becton Dickinson GmbH301300
ألواح 24 بئراBecton Dickinson GmbH / Falcon353047
2-ميثيل بوتانCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
محلول فورمالديهايد 37٪AppliChem GmbH & nbsp ؛A0936،1000
3-way stopcockB. Braun Medical Inc.16494C
حقنة 50 ملB. Braun Medical Inc.8728810F
70٪ إيثانولOtto Fischar GmbH27669
الجسم المضاد الثانوي المترافق Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53 ، Mouse IgGSigma-Aldrich ، SteinheimA7811
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC4901
صفيحة ثقافة الخلايا ، 96 بئر ، نصف منطقةGreiner bio-one675986
كولاجيناز بيروش11088815001
مجهر متحد البؤر Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050Sمصل حمار لايكا
Jackson Immuno Research ، سوفولك ، GB017-000-121
فوسفات Dulbecco مخزن محلول ملحيسيجما ألدريتشD8537
EDTASigma-AldrichE4884
مصل ربلة الساق الجنينيةPromoCell ، محلول هايدلبرغ
فورمالديهايد (4٪)PanReac AppliChemA3697
الجيلاتين من جلد الخنازير ، النوع ASigma-Aldrich ،G2500
VWR631-0146
أنبوب تمديد الجلوكوزسيجما ألدريتشG7021
هايدلبرغرIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
نسبة الهيبارين-ناتريومفارم5394.02.00
شرائح مجهر هيبسسيجما-ألدريتشH3375
شرائح مجهر هيستوبوندمارينفيلد0810000
هوشست 33342 (1  ملغ / مل)سيجما ألدريتش ، TaufkirchenB2261
حقنة الأنسولينBecton Dickinson GmbH300334
Iscove ' s ModifiedDulbecco' s متوسطة (IMDM)Gibco / Life Technologies ، دارمشتات21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
المسح الضوئي بالليزر Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments ، D & uuml ؛ سلدورف
ليبوفاكتامين RNAiMAXInvitrogen / Life Technologies ، دارمشتات13778075
ماوس IgG Cy5 (حمار)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266
أنبوب الطرد المركزيالصغير Sarstedt72690
شاكر VWRالصغير12620-940
mirVana miRNA تقليد ، has-miR199a-3pAmbion / Thermo Fischer Scientific4464066
خزعة العفنSakura Finetek / VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
سلبي التحكم (الحمض النووي الريبي المخلوط)Ambion / Thermo Fischer ScientificAM4611
طقم تفكك قلب حديثي الولادةMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach130-098-373
NIS عناصر AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments ، D & uuml ؛ أحماض أمينية غير أساسية من سلدورف
، NEAAGibco / Life Technologies ، دارمستاد11140-035
Opti-MEM ، مصل متوسطمخفض جيبكو51985-026
P21-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
البنسلين / الستربتومايسينGibco / Life Technologies ، دارمشتات15140-122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتش ، شتاينهايم14190-094
وسط تركيب كحول البولي فينيل مع DABCO & reg ؛ ، مضاد للبهتانSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen / Life Technologies ، دارمشتاتAM9780
حاويات العينة Vitlab80731
ماصة مصليةGreiner607180
برنامج NIS عناصرنيكون
السكروزSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. مركبساكورا فينيتيك / VWR25608-930
يوديد ToPro3 (642/661)جزيئي مجسات / ThermoFisher ScientificT3605
تريسسيجما ألدريتشT1503
تريتون إكسفلوكا93418
تريتون X-100فلوكا93418
التربسينسيجما-ألدريتشT1426
جرثومة القمح الرص (WGA) الفلورسين المسمىمختبرات ناقلاتVEC-FL-1021-5
ألفا ؛ الأجسام المضادة للأكتينينسيجما ألدريتشA7811
& بيتا ؛ - ميركابتو إيثانولسيجما ألدريتش ، شتاينهايمM3148
أغطية زجاجية Steinheim

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles