يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

8.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55204

⸱

فبراير 24, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.

الملخص

خلايا عضلة القلب عرضة للتغيرات في دورة الخلية ، مثل التكرار الداخلي (الجولات المستمرة من تخليق الحمض النووي دون حركية النووية والحركية الخلوية) والانقسام الحركي الخلوي (الحركية النووية ولكن بدون الحركية الخلوية). تؤدي هذه الاختلافات غير النمطية في دورة الخلية إلى خلايا متعددة الصبغيات ومتعددة النوى بدلا من انقسام الخلايا. لذلك ، لتحديد دوران القلب وتجديده ، من الأهمية بمكان تحديد نوى خلايا عضلة القلب بشكل صحيح ، وعدد النوى لكل خلية ، وحالة دورة الخلية. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام العلامات النووية لتحديد نشاط دورة الخلية ، مثل نظائر الثايميدين Ki-67 أو PCNA أو pHH3. هنا ، نقدم طرقا للتعرف على خلايا عضلة القلب ونواتها وتحديد نشاط دورة الخلية. نستخدم نظامين معدلين وراثيا منشورين: خط الفأر المعدل وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وخط الفأر CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلية عن اختلافات دورة الخلية. يساهم هذان النظامان معا في تسهيل دراسة تجديد القلب واللدونة.

المقدمة

التحديد الصحيح للنوى cardiomyocyte ووضع دورة الخلية هي ذات أهمية حاسمة لتحديد قيمة التداول عضلة القلب والتجدد. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام علامات النووية، مثل pHH3، كي-67، أو النظير ثيميدين، لتحديد النشاط دورة الخلية هذا. كما أن قدرة التكاثري العضلية الثدييات الكبار صغيرة جدا 1، هوية مزورة من نواة إيجابية لعلامة انتشار نواة cardiomyocyte يمكن أن تحدث فرقا حاسما في نتائج فحص انتشار الأسلحة النووية. وعلاوة على ذلك، العضلية عرضة للتغيرات في دورة الخلية، مثل تنسخ داخلي والانقسام acytokinetic، مما يؤدي في الخلايا المتعددة الصبغيات ومتعددة النوى وليس في انقسام الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، تفسير تلوين الأجسام المضادة ضد علامات دورة الخلية المشتركة ليست قاطعة في جميع الحالات.

هنا، فإننا نقدم طرق ل-forwa على التوالي اعتراف طريق الخلايا العضلية الماوس وnuclearity في الخلايا المعزولة المحلية وأقسام الأنسجة السميكة على بعد الولادة وتعليم الكبار مراحل من تحديد لا لبس فيه من النواة. لهذا الغرض، تم استخدام خط الماوس المعدلة وراثيا مع التعبير عن cardiomyocyte معين من البروتين الانصهار تتكون من H2B هيستون البشري وmCherry تحت سيطرة المروج Myh6 (Myh6-H2B-صحة الأم والطفل) 2. التهجين هذا الخط الفأر مع خط الماوس مؤشر انتشار المعدلة وراثيا، والتي التعبير عن بروتين الانصهار EGFP-anillin تحت السيطرة في كل مكان المروج الأكتين الدجاج مع محسن CMV (CAG-EGFP-anillin)، يسمح لل تحديد الوضع دورة الخلية. وأعرب anillin البروتين السقالات على وجه التحديد في الخلية دورة الخلية النشطة 3، والتفضيلية توطين التحت خلوية لها خلال دورة الخلية يسمح ليعيش تتبع تقدم دورة الخلية مع دقة عالية من M-المرحلةEF "> 4. ولذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا مزدوج يمكن استخدامها للتمييز بين المتكاثرة العضلية وتلك التي تخضع لتغيرات دورة الخلية. وهذا يثبت مفيدة بشكل خاص في الكشف عن المواد يحفز تكاثر في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وكانت جميع الإجراءات من هذا البروتوكول تنطوي على الحيوانات وفقا للمعايير الأخلاقية من جامعة بون وامتثلت للمبادئ التوجيهية من التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية.

1. في المختبر تصور آخر دورة الخلية في ما بعد الولادة العضلية

  1. بعد الولادة التفكك cardiomyocyte
    1. استعدادات ما قبل التجريبية
      1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة (IMDM، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1٪ β-المركابتويثانول)؛ المتوسطة 1: إضافة FCS إلى 2٪، متوسط ​​2: إضافة FCS إلى 20٪.
      2. معطف طبق ثقافة 96-جيدا (منطقة نصف النمو: 15 ملم 2) مع الجيلاتين 0.1٪ في حل برنامج تلفزيوني.
    2. تشريح القلب
      1. إعداد طبق بيتري مع 15 مل من برنامج تلفزيوني وتخزينها على الجليد. تعقيم اثنين من ملاقط ومقصات صغيرة من خلال وضعها في جاف الزجاج حبة معقمة.
      2. التضحية الفئران المعدلة وراثيا حديثي الولادة (CAG-EGFP-anillin / Myh6-H2B-صحة الأم والطفل) من خلال قطع الرأس. فتح القفص الصدري، تشريح القلب بها، كما هو موضح في Ehler وآخرون. 2013 (J فيس التصدير؛ (79): 50154 دوى: 10.3791 / 50154)، وتحويلها إلى برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. الانتقال إلى الماوس المقبل.
      3. في حالة استخدام غير متماثل زوجا فقط، التعرف على القلوب المعدلة وراثيا مع المجهر الفلورسنت. وضع قلوب في برنامج تلفزيوني تحت المجهر الفلورسنت. تحقق للتعبير EGFP-anillin (مثال: 488 نانومتر. م .: 509 نانومتر) وH2B-صحة الأم والطفل التعبير (مثال: 587 نانومتر. م .: 610 نانومتر) مع مجموعات مرشح المناسبة.
    3. العزلة Cardiomyocyte
      1. فصل قلوب اختيار باستخدام الأطفال حديثي الولادة عدة التفكك القلب. احتضان مزيج انزيم 1 عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. للحصول على 1 مل من مزيج انزيم النهائي، إضافة 945 ميكرولتر من مزيج انزيم 1-55 ميكرولتر من مزيج انزيم 2.
      2. نقل ما يصل إلى 4 قلوب من P1 - الفئران P3 أو ما يصل إلى 2 قلوب من P4 - الفئران P6 لص 1.5 ملأنبوب eaction تحتوي على 1 مل من مزيج انزيم وقطع القلب إلى قطع صغيرة مع مقص. نقل الحل في 15 أنابيب رد فعل مل.
      3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتحقيق أقصى قدر من الاتصال بين الأنسجة والأنزيمات، ووضع أنبوب 15 مل أفقيا تقريبا في الحاضنة. مزيج من قبل pipetting 5-10 مرات صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
      4. إضافة 7.5 مل من المتوسط ​​2 (20٪ FCS) لوقف رد فعل الانزيم. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع 3 مل من المتوسط ​​2.
      5. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 × ز لمدة 15 دقيقة وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من المتوسطة 1؛ ليس مطلوبا الأحمر تحلل خلايا الدم لمزيد من التجارب. الماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في غرفة عد الخلايا وتحديد عدد الخلايا.
      6. لوحة 96-جيدا: البذور 10000 خلايا لكل بئر في 120 ميليلتر من متوسط ​​1 (2٪ FCS). مكانالخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2)، والشروع فورا في ترنسفكأيشن.
  2. ترنسفكأيشن العضلية حديثي الولادة مع الرناوات siRNAs أو miRNAs
    1. مسح مقعد مع ريبونوكلياز الحل لإزالة التلوث لإزالة RNases. تنظيف المواد التالية مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث: 10 ميكرولتر، 100 ميكرولتر، و 200 ميكرولتر الماصات والجليد مربع. قسامات ذوبان الجليد سيرنا الأوراق المالية (100 ميكرومتر) على الجليد.
    2. إعداد مخزون عمل 2 ميكرومتر سي / miRNAs في انخفاض سيرم (98 ميكرولتر من انخفاض سيرم + 2 ميكرولتر من سيرنا 100 ميكرومتر الأسهم). يجب استخدام الأوراق المالية العاملة في نفس اليوم. لا ينصح التجمد.
    3. إضافة 4 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ميكرومتر إلى 6 ميكرولتر من انخفاض سيرم لأنبوب رد فعل 0،5 مل (مقدار واحد 96-جيدا، الاشتراكية النهائي / تركيز ميرنا في 140 ميكرولتر: ~ 57 نانومتر). اختيار حجم مناسب لعدد من الآبار لتكون transfected مع الاشتراكية معين / ميرنا.
    4. إعداد مزيج الرئيسي كاشف ترنسفكأيشن. استخدام 10 ميكرولتر (0.6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن + 9.4 ميكرولتر من انخفاض سيرم) لكل بئر (مجموع 96 بئرا).
    5. إضافة الاشتراكية / ميرنا مزيج إلى المزيج ترنسفكأيشن الكاشف. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. الماصة 20 ميكرولتر في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ ثم قم باستبدال المتوسطة في كل بئر مع 120 ميكرولتر من المتوسطة 1. بعد 24 ساعة أو أكثر، والمضي قدما في تثبيت وتلوين المناعي.
  3. تثبيت والمناعي تلطيخ
    1. إزالة المتوسطة وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تغطية الخلايا مع 4٪ محلول الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة. خلع الحل الفورمالديهايد وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم تغطيتها مع برنامج تلفزيوني للتخزين أو الشروع في المناعية.
    2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (تركيز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في 0.2٪ تريتون-X و 5٪ المصل حمار لمدة 2 ساعة على الأقل.إذا تلطيخ لα-actinin (التخفيف 1: 400، وحيدة النسيلة المضادة للα-actinin)، وصمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تمييع الضد الثانوية في هويشت محلول 1: 400، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT محمية من الضوء. إزالة الأجسام المضادة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، وتغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني للتخزين عند 4 درجات مئوية.
  4. متحد البؤر المجهري الفيديو
    1. استخدام المجهر متحد البؤر لاقتناء الصورة. فتح برامج التصوير. فتح "إعدادات A1plus" وحدد المربعات لCH1، CH2، وCH3. تعيين CH1 إلى دابي، CH2 إلى EGFP، CH3 لو Cy3، وCH4 إلى Cy4 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      1. لكل قناة، انقر على HV وتعيينه إلى 80 باستخدام شريط التمرير. تعيين لإزاحة 0 باستخدام القضبان انزلاق، وانقر على زر "الوطن" لتعيين الثقب إلى موقف البيت. تعيين حجم المسح إلى 1024 X 1024 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      2. انقر الأمثل لفتح"XYZ الحجم الإعداد" نافذة. خانة "الكمال فوكسل" تحت عنوان "الخطوة المقترحة (ض)". زيادة كثافة الليزر حتى الصورة ليست قليلة التعرض ولا تعريض.
        ملاحظة: على سبيل المثال، CH1 (دابي): 16٪، CH2 (EGFP): 12٪، CH3 (و Cy3): 100٪، CH4 (Cy5): 1٪. تعيين أوفست لجميع القنوات إلى 0.
    2. التقاط الصور باستخدام الهدف 20X (200X التكبير). مسح صورة كبيرة تتكون من الصور البلاط (على سبيل المثال، 3 × 3).
      1. في برامج التصوير، انتقل إلى "اكتساب" واختيار "مسح صورة كبيرة" من القائمة المنسدلة. تحت عنوان "منطقة"، اختر "الوضع الحالي هو في أعلى الزاوية اليسرى" من القائمة المنسدلة وتعيين "عدد من الحقول في X و Y" ل3 × 3. انقر فوق "مسح".
  5. تحليل الصور
    1. تحديد عدد من نوى cardiomyocyte عن طريق عد إشارات H2B CH وعدد الخلايا العضلية عن طريق عد الإشارات α-actinin.
        <لى> انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من القائمة المنسدلة المقبلة. انقر على النوى مع إشارات H2B-صحة الأم والطفل، وبالتالي وضع العلامات واعدهم. تفعل الشيء نفسه للخلايا α-actinin إيجابية للحصول على عدد الخلايا العضلية.
    2. عد S / العضلية المرحلة G2 مع إشارات EGFP-anillin النووية (EGFP-anillin + / + H2BmCh نوى). انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من القائمة المنسدلة المقبلة. علامة نوى مع إشارات EGFP-anillin وإشارات H2B-صحة الأم والطفل من خلال النقر عليها.
    3. عد العضلية مع إشارات الانقسام محدد EGFP-anillin (على سبيل المثال، الشكل 1F وG)، مثل إشارات cytoplasmatic، حلقات مقلص، وmidbodies. انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من بول المقبلالقائمة ldown. العضلية علامة مع إشارات الانقسام محدد EGFP-anillin (على سبيل المثال، الشكل 1F وG)، وإشارات cytoplasmatic، حلقات مقلص، وmidbodies من خلال النقر عليها.

2. تحديد التنوي في العضلية الكبار من Langendorff التفكك وأقسام الأنسجة السميكة

  1. عزل العضلية الكبار بحلول Langendorff التفكك
    1. الاستعدادات قبل تشريح القلب
      1. ملء حقنة الأنسولين (عيار 30 إبرة) مع الهيبارين (20 وحدة / غرام من وزن الجسم). فهم الماوس من القفا من الرقبة. رفع وتحويل الماوس الى الوراء لفضح البطن للحقن.
      2. إجراء حقن داخل الصفاق. ضع الماوس heparinized مرة أخرى في قفص والانتظار على الأقل 15 دقيقة قبل البدء في تشريح القلب. شطف وتهوية الجهاز Langendorff مع 5-10 مل من العازلة نضح (العازلة نضح: 135 مم كلوريد الصوديوم، 4 ملي بوكل، 1 ملم MgCl2، 2.5 ملي HEPES، 5 ملي الجلوكوز، و 25 ملي بي دي إم في ده 2 O، وضبط لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
    2. تشريح القلب
      1. إعداد 10 سم طبق بتري مع المبردة (4 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد. ملء وتهوية حقنة 1 مل متصلة (قياس 20) قنية مع برنامج تلفزيوني. إصلاح قنية مع الصلصال على الحدود من طبق بيتري. ضع طرف قنية أقل قليلا من سطح برنامج تلفزيوني.
      2. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. مسح البطن مع 70٪ من محلول الإيثانول. إجراء شق من البطن منتصف إلى القص مع مقص جراحي. إزالة الحجاب الحاجز وقطع القفص الصدري بشكل ثنائي مع مقص جراحي.
      3. رفع وإصلاح القص بإبرة 20 عيار، فتح التجويف الصدري، وفهم بلطف القلب مع ملقط التشريحية. رفع القلب وإزالته من الرئتين والأوعية الدموية عن طريق خفض السفن في المسالك التدفق.
        ملاحظة: لتحديد الشريان الأورطي، ضع القلبفي بطني حتى الجانب. هذا يقلل من المسافة بين كل من الأذينين، وبالتالي فإن الشريان الأورطي مع فروعها يمكن العثور بين الأذينين. اعتمادا على بنية القلب الفردية، وفروع يمكن إزالتها إذا كان فرع الرئيسي من الشريان الأورطي لا يزال طويلا بما فيه الكفاية.
      4. نقل القلب إلى طبق بتري 10 سم تحتوي على برود برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 2.1.2.1). يقني؛ يدخل القنية القلب عن طريق سحب الأبهر الصاعد على قنية حقن G20x1 ½، الذي قلل من قبل أداة متعددة تتأرجح لتجنب تلف الأنسجة. إصلاح الشريان الأورطي مع موضوع على قنية. شطف بلطف القلب مع برنامج تلفزيوني لإزالة الدم الزائد عن طريق دفع المكبس حقنة. وينبغي أن يكون توسيع طفيف في قلب مرئية.
    3. Langendorff التفكك القلب
      1. ربط القلب مقنى بسرعة إلى محول قفل لور في جهاز نضح Langendorff. يروي القلب مع 30 مل من العازلة نضح الاوكسيجين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع معدل التدفق من 1 قطرة / ثانية. عشريمكن تكييفها معدل التدفق الإلكتروني عن طريق تنظيم تدفق O 2 داخل جهاز Langendorff باستخدام صمام تخفيض الضغط (ضغط بين 0 و 200 مليبار).
      2. إعداد العازلة الهضم مباشرة قبل الاستعمال: العازلة نضح مع 6 U كولاجيناز B، 10،000 وحدة التربسين، و 50 ميكرومتر CaCl 2. إزالة المنطقة العازلة نضح وبدء عملية الهضم الأنزيمي بإضافة 30 مل من الحارة (37 درجة مئوية) والاوكسيجين العازلة الهضم.
        ملاحظة: مقدار كولاجيناز B يحتاج إلى معاير تبعا لنوع النشاط من دفعات مختلفة.
      3. ضبط تدفق إلى نسبة 1 قطرة / ثانية واستيعاب القلب ل10-13 دقيقة. لتجنب التلوث، لا تستخدم هروب رأس المال مرة أخرى. نقل القلب إلى طبق بتري 10 سم مع 5 مل من العازلة الهضم. تشريح الأنسجة يدويا بالملقط من خلال عقد القلب مع زوج واحد من الملقط واستخدام الزوج الآخر أن يمزق القلب إلى قطع صغيرة.
        ملاحظة: في هذه الخطوة، الأذينين يمكن فصلها، يقتطع الصغيرةقطعة (مع مقص القزحية)، وهضمها لمدة 30 دقيقة في 750 ميكرولتر من العازلة الهضم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية وذلك للحصول على خلايا الأذيني معزولة. للحصول على العضلية الأذينية نقية، الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة 1 مل. وقف رد فعل الانزيم بإضافة 750 ميكرولتر من وقف الحل.
      4. وقف عملية الهضم وذلك بإضافة 5 مل من حل توقف (العازلة نضح مع 5٪ FBS و 50 ميكرومتر CaCl 2). باستخدام ماصة المصلية، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون وجمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية التي تمت تصفيتها في 80 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه الخلية في 10 مل من توقف الحل باستخدام ماصة المصلية 10 مل. الطرد المركزي تعليق خلية في 80 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      6. بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من مستنبت (IMDM مع 20٪ FCS، 0.1 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 50 ميكروغرام / مل كل من البنسلين والستربتومايسين، و 0.1 ملي β-المركابتويثانول) للزراعة. بدلا من ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.2، "المناعي تلطيخ"، وإصلاح الخلايا.
      7. لتثبيت على 24 لوحات جيدا، لوحة 10،000 من خلايا معزولة لكل بئر في 8 ميكروغرام / مل coverslips المغلفة laminin في 24 لوحات جيدة مع 500 ميكرولتر من مستنبت عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة على الأقل .
  2. تلوين المناعي على العضلية معزولة Langendorff في تعليق
    1. إصلاح العضلية معزولة Langendorff في 1 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة تثبيتي، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    2. Resuspend والعضلية الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وإما المضي قدما في تلطيخ المناعي أو تخزينها في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر على24 لوحة جيدا في 4 درجات مئوية. نقل جزء من تعليق خلية (~ 100-200 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge. الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
    3. Permeabilize، كتلة، وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية ضد α-actinin بإضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 400 في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ تريتون X-100 و 5٪ المصل حمار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. غسل بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واحتضان في 200 ميكرولتر من اليكسا فلور مترافق الضد الثانوية (مكافحة فأر IgG1) المخفف 1: 400 في هويشت صبغ (العمل الحل: 1 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة. حماية عينة من الضوء. Resuspend الخلايا في 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقل 100-300 ميكرولتر من تعليق خلية إلى بئر من غرفة الفحص المجهري. إغلاق غطاء غرفة وتخزين الخلايا في 4 درجات مئوية حتى التصوير. احم من الضوء.
  3. تحليل nuclearity العضلية معزولة Langendorff-
    1. التقاط صور من العضلية ملطخة α-actinin مع هدف 25X، الموافق التكبير 250X. حساب عدد H2B-صحة الأم والطفل + نوى إلا في تلك العضلية التي هي ملطخة بشكل منتظم من قبل α-actinin وعرض نموذجي قضيب على شكل التشكل، وبالتالي يفترض أن تكون سليمة.
    2. عدد لا يقل عن 100 العضلية من ثلاثة قلوب مختلفة. حساب النسب المئوية من وحيدات النوى، ثنائي النواة، والعضلية trinuclear.
      ملاحظة: عادة، يجب أن خلايا ثنائي النواة يشكلون حوالي 80 - 90٪، في حين أن الخلايا trinuclear وذوي أعداد أكبر من نوى نادرة (<1٪ في العضلية معزولة Langendorff، <3٪ في شرائح سميكة). العضلية الأذينية هي أصغر بكثير من العضلية البطين. عادة، وخلايا وحيدات النوى يشكلون 90٪ من مجموع السكان.
  4. العزلة، التثبيت، والحفظ بالتبريد من قلوب الكبار كتحضير للشرائح سميكة
    1. تجميع جهاز نضح لتثبيت من خلال ربط حقنة 50 مل إلى 3 في اتجاه ومحبس مع تمديد أنبوب هايدلبيرغر و3-الطريقة الثانية محبس. إصلاح حقنة في موقف في مثل هذه الطريقة يتم تمكين هذا التدفق من خلال طريق الجاذبية. ملء النظام مع 15 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. اتبع الخطوات 2.1.2.1-2.1.2.4 "إعداد القلب." ربط حقن قنية G20x1 ½ مع القلب إلى تأمين محول لور من جهاز نضح مملوءة PBS-فقاعة خالية ويروي مع برنامج تلفزيوني. ملء النظام مع 10-15 مل من 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، وهو ما يتم perfused من خلال القلب. الغمر إصلاح القلب في 4٪ محلول الفورمالديهايد بين عشية وضحاها.
    3. استبدال الفورمالديهايد 4٪الحل مع برنامج تلفزيوني، ويغسل القلب في برنامج تلفزيوني على شاكر الأفقي في 150 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تبادل برنامج تلفزيوني مع محلول السكروز 20٪ إلى يذوى القلب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. تجميد القلب في المتوسط ​​تضمين البرد في قالب صغير.
      1. إعداد كوب مملوء 2-methylbutane وضعه في مربع مع الثلج الجاف. وضع القلب في قالب تجميد سابقا شغل نصف مع البرد تضمين المتوسطة وتغطية ذلك تماما مع البرد تضمينها المتوسطة. وضع بعناية القالب في الكأس الباردة، ومنع الاتصال من الخطة المتوسطة الأجل تضمين البرد لدى methylbutane 2. تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. إعداد شرائح سميكة القلب
    1. استخدام الإعداد التالية في مبضع بردي: درجة حرارة جسم من -18 إلى -20 درجة مئوية، ودرجة حرارة الغرفة -21 إلى -23 درجة مئوية، زاوية المقاصة على حامل السكين من 4 درجات، والريشة R35 شفرات مشراح.
    2. خذ يا cryopreservedrgan من الحاوية تجميد وإصلاحه على القرص العينة مع متوسطة تضمين البرد باستخدام رف التجميد السريع. وضع القلب في مثل هذه الطريقة التي باجتزاء يبدأ في ذروة.
    3. تقليم بعيدا شرائح 50 ميكرومتر حتى يتحقق طائرة حتى قطع والجهاز تصبح مرئية. قطع 50 ميكرومتر شرائح الأنسجة باستخدام مبضع بردي في الوضع اليدوي مع سرعة بطيئة ومع لوحة المضادة للدوران وضعت على سكين. شرائح جبل على الشرائح المجهر المعالجة المالحة. السماح للشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتخزين الشرائح في -80 درجة مئوية أو وصمة عار مباشرة.
  6. تلطيخ شرائح سميكة قلب (نواة وأغشية الخلايا)
    1. علاج شرائح القلب مع ريبونوكلياز ألف (20 ميكروغرام / مل) في غسل العازلة (0.5 M كلوريد الصوديوم، 0.1 م تريس 7.5 درجة الحموضة، و 50 ملي EDTA) في كفيت لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. احتضان الشرائح في 0.2٪ تريتون-X في غسل العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل شرائح مرتين لمدة 5 دقائق في كل من غسل العازلة في كوفيت علىشاكر الأفقي في درجة حرارة الغرفة.
    2. وصمة عار بين عشية وضحاها مع 1 ميكرومتر TO-PRO3 يوديد (642/661) وإلى جانب فلوريسئين جنين القمح راصة (WGA، 1: 100) في غسل العازلة عند 4 درجات مئوية. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع كل غسل العازلة في cuvettes على شاكر الأفقي وتغطيتها مع البولي فينيل الكحول المتوسطة المتزايدة مع كاشف يتلاشى مكافحة وساترة الزجاج.
  7. الحصول على الصور
    1. من الناحية المثالية، استخدم مقلوب ليزر متحد البؤر مجهر المسح مجهزة NA الهدف المياه غمس 40X / 1.15. البحث عن طريق العين إحدى المناطق في نطاق الشريحة التي تتكون من العضلية اصطف طوليا. لهذا الغرض، وقناة فلوريسئين-WGA (مثال: نانومتر 488) هو الانسب.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية، والحدود العليا والدنيا للالعضلية يجب أن يكون مرئيا داخل ض المكدس للتحليلات لاحقة. كما يقتصر عمق التصوير ل~ 30 نانومتر، وسمك شريحة 50 ميكرون، فإنه ليس من الممكن ايمعبر عمر أقسام من هذه الخلايا (طول الخلية: ~ 120 ميكرون).
    2. ضبط الإعداد ضمن برامج التصوير. فتح برامج التصوير. افتح إعدادات A1plus والتحقق من صناديق لCH2، CH3، وCH4. تعيين CH2 إلى EGFP، CH3 إلى Alx546، وCH4 إلى Alx647 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      1. لكل قناة، انقر على HV وتعيينه إلى 80 باستخدام شريط التمرير. تعيين إزاحة 0 باستخدام قضبان المنزلق. انقر على زر "الوطن" لتعيين الثقب إلى موضعها الأصلي. تعيين حجم المسح إلى 1024 X 1024 عن طريق النقر على القائمة المنسدلة وانقر فوق تحسين لفتح نافذة "XYZ الحجم الإعداد". ضع علامة في المربع "الكمال فوكسل" تحت عنوان "الخطوة المقترحة (ض)".
    3. انقر على "مسح العيش" وضبط شدة الليزر عن طريق النقر على أشرطة التمرير على القنوات الفردية. ضع علامة في المربع "زد" على نافذة "ND اقتناء" وانقر على "يحددها الزر العلوي" مربع. تحديد أعلى وزر من ض المكدس عن طريق النقر على الأزرار المناسبة بعد ضبط التركيز على المجهر. تعيين عرض ض خطوة إلى 0.5 ميكرون.
      ملاحظة: عمق ض المكدس محدودة بسبب اختراق البصرية داخل الأنسجة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    4. انتقل إلى "إعدادات A1plus" وتعيين خط متوسط ​​/ جزءا لا يتجزأ من 2-4 بالضغط على القائمة المنسدلة. صقل شدة الليزر. وينبغي أن يكون الثقب صغيرا قدر الإمكان من أجل صورة في المستوى البؤري.
  8. تحليل التنوي
    1. فتح برنامج تحليل الصور وتحميل ض المكدس في المصالح.
    2. يدويا تحديد التنوي في Z-مداخن بالتنقل بين طبقات مختلفة من كومة من أجل تحديد الخلايا التي تقع بالكامل داخل كومة. هذا هو الحال عندما تلطيخ WGA مرئيا في جميع الأبعاد. حساب عدد النوى (ومعظمهم من سيكون ثنائي النواة) وعلامة الخلية تحليلها من قبل الشرح في البرنامج.
      3. <لى> تحديد عدد النوى سم (H2B-صحة الأم والطفل +) ومجموع النوى (TO-PRO3 +) في عمليات إعادة البناء 3D للقنوات واحدة (الشكل 2D). في برامج التصوير، اضغط على "ثنائي" ثم اختر "تحديد عتبة 3D" من القائمة المنسدلة. اختر من القائمة المنسدلة قناة إما Alx546 لعدد من نوى CM أو Alx647 عن إجمالي عدد النوى. من خلال النقر على الأسهم المناسبة، وضع برنامج ل"4X السلس"، 1X تنظيف، وملء الثقوب. ضع علامة في المربع "حجم" وتعيينه إلى 5 ميكرون باستخدام شريط التمرير. تعيين عتبة باستخدام شريط التمرير حتى تظهر كائنات منفصلة.
      ملاحظة: بعد تطبيق تجزئة، يظهر إطار النتائج جدول الأحداث كميا وتجزئة اللون من الصورة. حيث أن بعض نوى الاتصال مباشرة بعضها البعض، يدويا تصحيح نتيجة القياس التلقائي للالحلل، والتي قد لا يمكن فصلها بشكل صحيح من قبل البرنامج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل تحليل آثار الرناوات siRNAs / miRNAs على النشاط دورة الخلية العضلية بعد الولادة في المختبر، العضلية من ضعف المعدلة وراثيا الفئران Myh6-H2B-صحة الأم والطفل / CAG-EGFP-anillin تم عزل في يوم ما بعد الولادة 3 (P3) وtransfected مع النشاط الذي يحفز دورة الخلية miR199 5، سيرنا P27، وسيرنا Fzr1. بالمقارنة مع سيطرة سلبية (الشكل 1A)، وصورا لmiR199- (الشكل 1B) وسيرنا p27- (الشكل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك جدل حول ما اذا العضلية قادرة على إعادة إدخال دورة الخلية وتقسيم بعد الاصابه وخلال توازن الأنسجة. وقد تم إعطاء القيم لدوران الأساسي العضلية في نطاق بين 1٪ 1 و 80٪ 7. أيضا بعد الآفة القلبية، وقد تم الإبلاغ عن تحريض النشاط دورة الخلية وتوليد العضلية الجديدة في المنطقة الحدودية، مع القيم بين 0.0083٪ 8 و 25 - 40٪ 7. يمكن أن يفسر جزئيا هذه التناقضات التي كتبها النهج التجريبية المختلفة لت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر S. Grünberg (بون، ألمانيا) و P. Freitag (بون، ألمانيا) على مساعدتهما الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 10 سمSarstedt821472
100 & micro ؛ مصفاة الخلايا mBecton Dickinson GmbH / Falcon352360
2،3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ ؛ قنية الحقن ، StericanBraun ، Melsungen4657519
إبرة قياس 20Becton Dickinson GmbH301300
ألواح 24 بئراBecton Dickinson GmbH / Falcon353047
2-ميثيل بوتانCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
محلول فورمالديهايد 37٪AppliChem GmbH & nbsp ؛A0936،1000
3-way stopcockB. Braun Medical Inc.16494C
حقنة 50 ملB. Braun Medical Inc.8728810F
70٪ إيثانولOtto Fischar GmbH27669
الجسم المضاد الثانوي المترافق Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53 ، Mouse IgGSigma-Aldrich ، SteinheimA7811
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC4901
صفيحة ثقافة الخلايا ، 96 بئر ، نصف منطقةGreiner bio-one675986
كولاجيناز بيروش11088815001
مجهر متحد البؤر Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050Sمصل حمار لايكا
Jackson Immuno Research ، سوفولك ، GB017-000-121
فوسفات Dulbecco مخزن محلول ملحيسيجما ألدريتشD8537
EDTASigma-AldrichE4884
مصل ربلة الساق الجنينيةPromoCell ، محلول هايدلبرغ
فورمالديهايد (4٪)PanReac AppliChemA3697
الجيلاتين من جلد الخنازير ، النوع ASigma-Aldrich ،G2500
VWR631-0146
أنبوب تمديد الجلوكوزسيجما ألدريتشG7021
هايدلبرغرIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
نسبة الهيبارين-ناتريومفارم5394.02.00
شرائح مجهر هيبسسيجما-ألدريتشH3375
شرائح مجهر هيستوبوندمارينفيلد0810000
هوشست 33342 (1  ملغ / مل)سيجما ألدريتش ، TaufkirchenB2261
حقنة الأنسولينBecton Dickinson GmbH300334
Iscove ' s ModifiedDulbecco' s متوسطة (IMDM)Gibco / Life Technologies ، دارمشتات21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
المسح الضوئي بالليزر Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments ، D & uuml ؛ سلدورف
ليبوفاكتامين RNAiMAXInvitrogen / Life Technologies ، دارمشتات13778075
ماوس IgG Cy5 (حمار)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266
أنبوب الطرد المركزيالصغير Sarstedt72690
شاكر VWRالصغير12620-940
mirVana miRNA تقليد ، has-miR199a-3pAmbion / Thermo Fischer Scientific4464066
خزعة العفنSakura Finetek / VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
سلبي التحكم (الحمض النووي الريبي المخلوط)Ambion / Thermo Fischer ScientificAM4611
طقم تفكك قلب حديثي الولادةMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach130-098-373
NIS عناصر AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments ، D & uuml ؛ أحماض أمينية غير أساسية من سلدورف
، NEAAGibco / Life Technologies ، دارمستاد11140-035
Opti-MEM ، مصل متوسطمخفض جيبكو51985-026
P21-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion / Thermo Fischer Scientific4390771
البنسلين / الستربتومايسينGibco / Life Technologies ، دارمشتات15140-122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتش ، شتاينهايم14190-094
وسط تركيب كحول البولي فينيل مع DABCO & reg ؛ ، مضاد للبهتانSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen / Life Technologies ، دارمشتاتAM9780
حاويات العينة Vitlab80731
ماصة مصليةGreiner607180
برنامج NIS عناصرنيكون
السكروزSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. مركبساكورا فينيتيك / VWR25608-930
يوديد ToPro3 (642/661)جزيئي مجسات / ThermoFisher ScientificT3605
تريسسيجما ألدريتشT1503
تريتون إكسفلوكا93418
تريتون X-100فلوكا93418
التربسينسيجما-ألدريتشT1426
جرثومة القمح الرص (WGA) الفلورسين المسمىمختبرات ناقلاتVEC-FL-1021-5
ألفا ؛ الأجسام المضادة للأكتينينسيجما ألدريتشA7811
& بيتا ؛ - ميركابتو إيثانولسيجما ألدريتش ، شتاينهايمM3148
أغطية زجاجية Steinheim

المراجع

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نوى الخلايا العضلية القلبيةنشاط الدورة الخلويةترانزجينية H2B-mCherryإشارات EGFP Analinمجهر الفيديو البؤريهضم أنسجة القلبتحديد درجة التعدد النوويالكشف عن التضاعف الداخلي للحمض النوويتصوير الانقسام الفتيليتجديد القلب
تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.