مقالة منهجية

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و في الموقع القرب من ربط الفحص

DOI:

10.3791/55218

⸱

يناير 16, 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تحدث تفاعلات البروتين والبروتين في كل من نواة الخلية وسيتوبلازمها. للتحقيق في هذه التفاعلات ، يتم تطبيق الترسيب المناعي المشترك التقليدي ومقايسة ربط القرب الحديثة. في هذه الدراسة ، نقارن هاتين الطريقتين لتصور توزيع تفاعلات NF90-RBM3 في النواة والسيتوبلازم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشارك تفاعلات البروتين والبروتين في آلاف العمليات الخلوية وتحدث في سياق مكاني متميز. تقليديا ، يعد الترسيب المناعي المشترك تقنية شائعة للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين. تحليل اللطخة الغربية اللاحقة هو الطريقة الأكثر شيوعا لتصور البروتينات المترسبة المناعية المشتركة. في الآونة الأخيرة ، أصبح اختبار ربط القرب أداة قوية لتصور تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع ويوفر إمكانية تحديد تفاعلات البروتين والبروتين بهذه الطريقة. على غرار الكيمياء المناعية التقليدية ، تعتمد تقنية فحص ربط القرب أيضا على إمكانية وصول الأجسام المضادة الأولية إلى المستضدات ، ولكن في المقابل ، يكتشف اختبار ربط القرب تفاعلات البروتين والبروتين بتقنية فريدة تتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل للدائرة المتدحرجة ، بينما تظهر الكيمياء المناعية التقليدية فقط التوطين المشترك للبروتينات. < p class = 'jove_content'> تم إثبات العامل النووي 90 (NF90) وبروتين الشكل المرتبط بالحمض النووي الريبي 3 (RBM3) سابقا كشركاء متفاعلين. يتم توطينها في الغالب في النواة ، ولكنها تهاجر أيضا إلى السيتوبلازم وتنظم مسارات الإشارات في الحجرة السيتوبلازمية. هنا ، قارنا تفاعل NF90-RBM3 في كل من النواة والسيتوبلازم عن طريق الترسيب المناعي المشترك ومقايسة ربط التقارب. بالإضافة إلى ذلك ، ناقشنا مزايا وقيود هاتين التقنيتين في تصور تفاعلات البروتين والبروتين فيما يتعلق بالتوزيع المكاني وخصائص تفاعلات البروتين والبروتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العامل النووي 90 (NF90) هو بروتين متعددة ISOFORM مع وظائف عديدة بما في ذلك الاستجابة للعدوى الفيروسية، وتنظيم انترلوكين 2 بعد النسخ وتنظيم ميرنا نشوء حيوي 1-3. RBM3 هو بروتين ملزمة RNA، والمشاركة في الترجمة وميرنا نشوء حيوي ويمكن الناجمة عن الضغوطات المختلفة بما في ذلك انخفاض حرارة الجسم ونقص الأكسجة 4-6. مؤخرا، وجدنا NF90 وRBM3 في مجمع بروتين 7. تفاعل NF90 وRBM3 ضروري لتعديل بروتين كيناز مثل RNA اندوبلازمية شبكية كيناز (بيرك) النشاط في استجابة البروتين تكشفت 7. وتقع كل من NF90 وRBM3 في الغالب في النواة ولكن نسبة صغيرة من NF90 ومكوك RBM3 إلى السيتوبلازم وربط هناك لبعضها البعض من أجل وظائف محددة، على سبيل المثال لتنظيم النشاط ورفع معنوياته. وبالتالي، فمن المهم أن تصور توزيع التفاعلات NF90-RBM3 في مقصورة التحت خلوية، والتي قد تشير إلىأدوارهم المختلفة في مقصورة منها.

منذ عقود، وقد وضعت الخميرة اثنين الهجين (Y2H) للكشف عن التفاعل بين اثنين من البروتينات 8. ومع ذلك، بسبب البناء الاصطناعي للبروتينات تنصهر، قيدت نتائج إيجابية كاذبة تطبيق هذا الأسلوب. لفترة طويلة، وكان شارك في مناعي التقنية الرئيسية لتحليل تفاعلات البروتين البروتين، خصوصا في ظروف endogeneous 9. لتحليل بروتين معقد immunoprecipitated المشترك، لطخة الغربية هي الأسلوب الأكثر ملاءمة، في حين يتم استخدام مطياف الكتلة عندما يتم المطلوب حساسية فائقة ودقة. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت قرب ربط الفحص باعتبارها طريقة جديدة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في كل من الخلايا والأنسجة في الموقع 10،11.

هنا، قارنا طريقة شارك في مناعي الأكثر شعبية ورواية نسبيا قرب ربط طريقة الفحص في التقاط NF9التفاعل 0-RBM3 في الكسور التحت خلوية. ناقشنا أيضا مزايا والقيود المفروضة على كل من التقنيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. شركة مناعي

  1. البذور HEK293 الخلايا في 2 × 10 5 خلايا لكل بئر في واحدة لوحة 6 جيدا في 2 مل معدلة المتوسطة (DMEM) ملحق النسر Dulbecco ومع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلين، الستربتوميسين (القلم بكتيريا) .
  2. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. غسل الخلايا مع الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد كسور النووية وهيولي باستخدام الكواشف استخراج النووية وهيولي التجارية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة مع بعض التعديلات.
    1. استخدام 3 × 10 6 خلايا لتجربة واحدة شارك في مناعي (ما يقرب من 90٪ confluency من 3 آبار واحدة لوحة 6 جيدا). إضافة 300 حل الباردة ميكرولتر حشوية استخراج (CER الأول) ودوامة لمدة 15 ثانية على أعلى سرعة.
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. أثناء الحضانة، vorteس لمدة 5 ق كل 10 دقيقة.
    3. إضافة 16.5 الباردة ميكرولتر استخراج حشوية الحل الثاني (CER الثاني)، دوامة لمدة 5 ثوان، واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
    4. دوامة لمدة 5 ثوان وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. نقل طاف (استخراج حشوية) في أنبوب جديد قبل المبردة، والحفاظ على الجليد حتى استخدامها.
    6. غسل الكريات غير قابلة للذوبان (التي تحتوي على نوى) ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 مل البارد في كل مرة من قبل pipetting صعودا وهبوطا خمس مرات. إزالة برنامج تلفزيوني بعد غسل.
    7. إضافة 150 ميكرولتر الباردة حل استخراج النووي (معدل الالتحاق الصافي)، دوامة لمدة 15 ثانية، واحتضان 1 ساعة على الجليد. أثناء الحضانة، ودوامة لمدة 15 ثانية وماصة 10 مرات مع تلميح 200 ميكرولتر كل 10 دقيقة.
    8. دوامة لمدة 15 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    9. نقل طاف (استخراج النووي) في أنبوب جديد قبل المبردة، والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
  5. إخراج 10٪ من حجم مقتطفات النووية وهيولي كل كمدخلات.
  6. ادد برنامج تلفزيوني الباردة إلى مقتطفات المتبقية إلى الحجم النهائي من 1 مل. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
    ملاحظة: قبل إزالة ليست ضرورية عند استخدام البروتين حبات مغناطيسية-G مترافق. ومع ذلك، إذا كانت الخلفية عالية، نفذ ما قبل المقاصة التي يحتضنها 40 البروتين ميكرولتر الخرز G-مترافق المغناطيسي (50٪ الطين) و 1 مل مخففة المحللة من هذه الخطوة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على محور دوار. طاف منفصل (مسح قبل المحللة) من الخرز مع حامل المغناطيسي. تجاهل الخرز.
  7. إلى الأجسام المضادة الأولية زوجين مع حبات مغناطيسية البروتين G-مترافق، واحتضان 40 ميكرولتر البروتين حبات مغناطيسية G-مترافق (50٪ الطين) مع الأجسام المضادة 4 ميكروغرام الأرنب بولكلونل مكافحة RBM3 أو مفتش أرنب (المراقبة السلبية) في 200 ميكرولتر PBS بالإضافة توين 20 عازلة (PBST، توين 20 0.02٪) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 40 دقيقة على محور دوار.
  8. منفصل الخرز وطاف الأجسام المضادة يقترن مع رف المغناطيسي، وتجاهل طاف. تغسل حبات مرة واحدة مع 200 PBST ميكرولتر (0.02٪).
  9. إضافة 1المخفف مل لست] (أو إذا لزم الأمر، لست] مسح مسبقا) إلى الخرز، واحتضان على محور دوار عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  10. في اليوم التالي، فصل الخرز وطاف بواسطة رف المغناطيسي، وتجاهل طاف. غسل 3 × 10 دقيقة مع 0.5 مل PBST (0.02٪) لكل أنبوب في 4 درجات مئوية على محور دوار مع سرعة ثابتة من 20 دورة في الدقيقة.
  11. أزل البروتينات من الخرز بإضافة عازلة عينة 40 ميكرولتر (عينة العازلة التجاري 1X و 50 ملم 1،4-dithiothreitol (DTT)). الحرارة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تدور باستمرار والسوائل نقل إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
  12. تمييع لست] مساهمة في عينة العازلة (تركيز النهائي: عينة العازلة التجاري 1X و 50 ملي DTT) والحرارة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. المدخلات تحميل والبروتينات immunoprecipitated من الخطوة الأخيرة لالجاهزة 4-12٪ مكرر تريس هلام. يجب أن لا يتجاوز حجم التحميل من كل بئر 20 ميكرولتر. أداء الكهربائي في المخزن تشغيل التجاري 1X على الجليد لمدة 35 دقيقة.
    ملاحظة: تحميل النووية واستخراج حشويةالصورة في نسبة 1: 2 (V / V)، وهو ما يعكس نفس المبلغ الأولي من الخلايا.
  13. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF في المخزن نقل التجاري 1X في 30 V لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  14. غشاء كتلة مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم في PBST (0.1٪ توين 20) في RT لمدة 40 دقيقة على شاكر.
  15. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (سواء المخفف في 1: 1000) في PBST (0.1٪) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  16. غسل 3 × 10 دقيقة مع PBST (0.1٪) في RT على شاكر.
  17. احتضان الغشاء مع الفجل البيروكسيداز (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس أو المضادة للأرنب (سواء المخفف في 1: 5000) في PBST (0.1٪) في RT لمدة 1 ساعة.
  18. غسل 3 × 10 دقيقة مع PBST (0.1٪) في RT على شاكر.
  19. استخدام 0.2 مل تعزيز التوهج (ECL) الركيزة خليط لكل سم 2 غشاء، في احتضان RT لمدة 5 دقائق. تجنب كل ضوء من هذه الخطوة فصاعدا إلا أضواء حمراء.
  20. تجاهل السائل وفضح إلى فيلم الأشعة السينية في شريط الفيلم. تطوير الفيلم باستخدام العلاقات العامة الفيلم التلقائيآلة ocessing.

2. سيتولوجية مناعية والقرب من ربط الفحص

  1. البذور HEK293 الخلايا في 1.5 × 10 4 خلايا في غرفة واحدة 8-غرفة بولي-D-يسين الشرائح المغلفة في 0.4 مل DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 100 U / مل القلم بكتيريا.
  2. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. نضح المتوسطة وإصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. نضح PFA، وغسل 3 × 10 دقيقة مع 0.5 مل برنامج تلفزيوني في الغرفة.
  5. Permeabilize والخلايا كتلة مع 0.5٪ تريتون X-100 و 5٪ الماعز العادي المصل (خ ع) في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 1 ساعة.
  6. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 0.1٪ تريتون X-100 و 5٪ خ ع في برنامج تلفزيوني على شاكر في 4 درجات مئوية خلال الليل. تمييع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للNF90 الأجسام المضادة وبولكلونل الأرنب مكافحة RBM3 الضد 1: 100 في برنامج تلفزيوني لالمزدوج تلطيخ. من أجل السيطرة السلبية، حذف بشكل مستقل إما من الأجسام المضادة الأولية اثنين، وحذف كل من الأجسام المضادة في عنصر تحكم الثالثة.
    ملاحظة: لا تستخدم حجب التجاري والكواشف تمييع.
  7. غسل 3 × 10 دقيقة مع 0.5 مل برنامج تلفزيوني في الغرفة.
  8. مع مراعاة مناعية أو القرب بروتوكولات ربط الفحص
    1. مناعية
      1. احتضان مع 1: 500 المخفف الأخضر الفلورسنت جانب صبغ مكافحة فأر والأجسام المضادة بالإضافة صبغة الفلورسنت الحمراء المضادة للأرنب الثانوية في RT لمدة 1 ساعة. تجنب ضوء من هذه الخطوة فصاعدا.
      2. نوى مباين مع 4 "، 6 diamidin-2-phenylindol (دابي) المخفف 1: 5000 في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 10 دقيقة.
      3. غسل 3 × 10 دقيقة مع 0.5 مل برنامج تلفزيوني في الغرفة.
      4. إزالة غرف من شريحة زجاجية وجافة. جبل مع 250 μ والمتوسطة لكل شريحة متزايدة.
    2. القرب فحص الربط
      1. إعداد القرب تحقيقات ربط الفحص. خلط وتمييع اثنين قرب تحقيقات ربط فحص (المضادة للماوس والمضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية المرفقة مع أليغنوكليوتيد المختلفة التي يمكن أن ligate عشرالخام إضافة اثنين من أليغنوكليوتيد أخرى في حل الربط) على حد سواء 1: 5 في 0.1٪ تريتون X-100 و 5٪ خ ع في برنامج تلفزيوني، بإجمالي 320 ميكرولتر لشريحة واحدة 8-غرفة (حوالي 40 ميكرولتر لكل سم 2) . في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
      2. إزالة غرف من شريحة زجاجية وإضافة تحقيقات المخفف. احتضان في حاضنة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. يعد حل الربط. مزيج 8 ميكرولتر يغاز، 64 ميكرولتر 5 × الأسهم ربط و 248 ميكرولتر H 2 O.
      4. الاستفادة من السائل من الشرائح، وغسل 2 × 5 دقائق في 1X الاحتياطي اغسل ألف (المقدمة مع عدة).
      5. إضافة الحل ربط واحتضان في حاضنة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      6. يعد حل التضخيم. خلط 4 ميكرولتر البلمرة، 64 ميكرولتر الأسهم التضخيم 5X و 252 ميكرولتر H 2 O. تجنب ضوء من هذه الخطوة فصاعدا.
      7. الاستفادة من السائل من الشرائح، وغسل 2 × 2 دقيقة في 1X الاحتياطي اغسل A.
      8. إضافة أمبيرحل lification واحتضان في حاضنة الرطوبة السوداء عند 37 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة.
      9. الاستفادة من السائل من الشرائح، وغسل 2 × 10 دقيقة في 1X الاحتياطي اغسل ب (المقدمة مع عدة). يغسل لمدة 1 دقيقة في 0.01x الاحتياطي اغسل B.
      10. تجف الشريحة وجبل مع 250 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة التجاري (مع دابي) لكل شريحة.
  9. دراسة الإشارات الفلورية تحت المجهر باستخدام عدسة العدسة 10X 20X والعدسة الشيئية. الحصول على صور بواسطة كاميرا CCD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل (1) التي NF90 وRBM3 كلاهما البروتينات النووية وفقط جزء صغير موجود في السيتوبلازم. والجدير بالذكر أن هناك ثلاثة نطاقات مختلفة ملطخة إيجابية لRBM3. أصغر أقل بقليل من 20 كيلو دالتون يعكس حجم الصحيح من RBM3 (وتنبأ الوزن الجزيئي للRBM3 هو 17 كيلو دالتون). يبقى أصل اثنين من فرق أخرى للتحقيق معهم. وكشفت التجارب المشتركة مناعي مع RBM3 كما البروتين الطعم أن التفاعلات NF90-RBM3 موجودة في الغالب في نواة وأقلية في السيتوبلازم. يدعم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من الفوائد، وكذلك أوجه القصور لكلتا الطريقتين. كما تقنية جديدة نسبيا، وهي ميزة واضحة لفحص القرب ربط هي جدوى لتوضيح البروتين البروتين التفاعلات على مستوى خلية واحدة بدلا من مجموعة من الخلايا غير المتجانسة. الصور مع فائق الضخامة والقرار (مثلا عن طريق المجهر متحد البؤر) توفر إمكانية القياس الكمي عن طريق عد البقع الفلورسنت واحدة. في المقابل، فإن الجمع التقليدي للتقنية شارك في مناعي مع لطخة غربية لا يمكن إلا أن شبه الكمي العصابات البروتين، وذلك بسبب تحكم التحميل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF ، 31003A_163305).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نسر دولبيكو المعدل s متوسط (DMEM)سيجماD6429ارتفاع الجلوكوز
4,500 مجم / لتر
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو ، ثيرمو فيشر10270106
البنسلين الستربتومايسين (PenStrep) BioConcept4-01F00-H
NE-PER كواشف الاستخراج النووي والسيتوبلازميThermo Fisher Scientific78833
1،4-Dithiothreitol (DTT)كارل روث6908.3
Dynabeads Protein GNovex و Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90 / NF110)مختبرات نقل الأجسام المضادة BD6121541: 1,000 ل WB و 1: 100 للأجسام المضادة ICC / PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APتستخدم 1: 1,000 ل WB و 1: 100 لتقنية
إشارات الخلايا المضادة للأجسام المضادة ICC / PLA Lamin A / C# 2032استخدم 1: 1,000 ل WB  
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHAbcamab82451: 1,000 ل WB & nbsp ؛
الأرنب العادي IgGSanta Cruzsc-2027
IgG المضاد للأرانب ، تقنية إشارات الخلية للأجسام المضادة الثانويةالمرتبطة ب HRP # 7074تستخدم 1: 5,000 ل WB & nbsp ؛
الجسم المضاد الثانوي HRP المضاد للفأرCarl Roth4759.1يستخدم 1: 5,000 ل WB & nbsp ؛
كلاريتي ويسترن ECL النشاف الركيزةBio-Rad# 1705060
NuPAGE Novex 4-12٪ Bis-Tris GelNovex ، Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS عينة عازلة (4x)Novex ، Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS قيد التشغيل Buffer (20x)Novex ، Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex ، Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 غشاء PVDFGE Healthcare LifeSciences 10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture SlideCorning BioCoat354632
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
مصل الماعز العادي (NGS)Gibco ، Thermo Fisher ScientificPCN5000
الماعز المضاد للفأر IgG (الجسم المضاد H + L) ، Alexa Fluor 488 المترافقThermo Fisher ScientificA-11001
الماعز المضاد للأرانب IgG (الجسم المضاد H + L) ، Alexa Fluor 568 المترافقThermo Fisher ScientificA-11011
4 & prime ؛ 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA مسبار مضاد للفأر PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA  مسبار مضاد للأرانب ناقصسيجماDUO92005
كواشف الكشف عن الثنائي الرابط الأحمرسيجماDUO92008
Duolink غسيل مخازن مضانسيجماDUO82049
ثنائي التركيب المتوسطة مع DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
مجهرأوليمبوسAX-70
كاميرا CCDSPOTInsight 2MP Firewire
فيلم الأشعة السينيةFujifilmSuper RX
آلة معالجة الأفلامFujifilmFPM-100A
العلمي تستخدم يستخدم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293 NF90 RBM3

مقالات ذات صلة