يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي

8.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55222

⸱

يناير 20, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

في هذه المقالة

ملخص

تعتبر الخلايا المناعية المقيمة في الرئة < p class = 'jove_content'> ، بما في ذلك الخلايا المتغصنة (DCs) في البشر ، ضرورية للدفاع ضد مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية المستنشقة. ومع ذلك ، نظرا لندرة أنسجة الرئة البشرية ، فإن الدراسات محدودة. يقدم هذا العمل بروتوكولات لمعالجة خزعات داخل القصبة المخاطية البشرية لدراسة DCs للرئة باستخدام الكيمياء المناعية وقياس التدفق الخلوي.

الملخص

تتعرض الرئتان باستمرار للبيئة الخارجية ، والتي بالإضافة إلى الجسيمات غير الضارة ، تحتوي أيضا على مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية والسموم. من أجل الحفاظ على التسامح أو تحفيز الاستجابة المناعية ، يجب على الجهاز المناعي التعامل بشكل مناسب مع المستضدات المستنشقة. تعتبر الخلايا المتغصنة الرئوية (DCs) ضرورية للحفاظ على توازن دقيق لبدء المناعة عند الحاجة دون التسبب في أضرار جانبية للرئتين بسبب استجابة التهابية مبالغ فيها. في حين أن هناك فهما مفصلا للنمط الظاهري ووظيفة الخلايا المناعية مثل DCs في دم الإنسان ، فإن معرفة هذه الخلايا في الأنسجة التي يصعب الوصول إليها ، مثل الرئتين ، محدودة للغاية ، نظرا لأن الدراسات التي أجريت على عينات أنسجة الرئة البشرية ، خاصة من الأفراد الأصحاء ، نادرة. يقدم هذا العمل استراتيجية لتوليد توصيف مكاني ونمط ظاهري مفصل للترابط المستمر المقيم في أنسجة الرئة في البشر الأصحاء الذين يخضعون لتنظير القصبات لأخذ عينات من الخزعات داخل القصبة. يمكن جمع العديد من الخزعات الصغيرة من كل فرد ويمكن تضمينها لاحقا للتقطيع متناهية الصغر أو هضمها إنزيميا لتحليل قياس التدفق الخلوي المتقدم. تم تحسين البروتوكولات الموضحة للحصول على أقصى قدر من المعلومات من عينات الأنسجة الصغيرة التي ، في ظل ظروف الحالة المستقرة ، تحتوي فقط على تردد منخفض من DCs. بينما يركز العمل الحالي على DCs ، يمكن توسيع الطرق الموصوفة مباشرة لتشمل الخلايا (المناعية) الأخرى ذات الأهمية الموجودة في أنسجة الرئة المخاطية. علاوة على ذلك ، تنطبق البروتوكولات أيضا بشكل مباشر على العينات التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض رئوية حيث يكون تنظير القصبات جزءا من تحديد التشخيص ، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) أو الساركويد أو سرطان الرئة.

المقدمة

الرئتين على اتصال مستمر مع البيئة الخارجية ويتعرضون للغاية لكلا جزيئات غير ضارة والميكروبات مع القدرة على التسبب في المرض. لذلك، من المهم جدا لجهاز المناعة لتركيب الاستجابات المناعية فعالة ضد الجراثيم الغازية، ولكن من المهم أيضا للحفاظ على التسامح لمستضدات استنشاقه التي لا تسبب المرض. لتوفير المراقبة المناعة قوية، واصطف الجهاز التنفسي مع وجود شبكة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS). البلدان النامية هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد مع قدرة فريدة على تنشيط خلايا T ساذجة. في الرئتين الإنسان، البلدان النامية المقيمين تواجه مستضد ومن ثم معالجة ونقل ذلك إلى الغدد الليمفاوية استنزاف الرئة لعرضها على وتنشيط خلايا T 1، 2، 3.

في نظام المناعة البشري، البلدان النامية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية، مع ديستانط م ولكن تداخل وظائف: CD1c + وCD141 + البلدان النامية الدم النخاعي (MDCs) وCD123 + البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS) 4، 5. في حين أن معظم المعرفة التفصيلية على البلدان النامية الإنسان تنبع من الدراسات في الدم، فمن الواضح الآن أن الرئتين الإنسان أيضا تؤوي السكان نادر من مجموعات فرعية العاصمة مع خلايا T قدرة تنشيطية 6، 7، 8، 9. ومع ذلك، تشير البيانات المتراكمة التي الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، تختلف في تكرارها، النمط الظاهري، وظيفة اعتمادا على الموقع التشريحي من 10. وبالتالي، فمن المهم دراسة الخلايا المناعية من الأنسجة ذات الصلة لفهم مساهمتها في الحصانة المحلية والتسامح. أخذت معا، وهذا يؤكد الحاجة لدراسة البلدان النامية والرئة المقيمين عند معالجة أمراض الرئة، على الرغم من البلدان النامية الدم يجري أكثر متوفرة بسهولة والوصول إليها في البشر.

أولى الدراسات التي حققت البلدان النامية والرئة المقيمين في البشر تعتمد في المقام الأول على التشكل والتعبير عن علامات واحدة، مثل HLA-DR وCD11c و، في أقسام الأنسجة باستخدام المناعية 11، 12، 13. في المقابل، المزيد من الدراسات الحديثة تعتمد عادة على cytometric تدفق التحليلات لدراسة مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية. ومع ذلك، نظرا لأنه من الصعب العثور على علامة سطح الخلية واحدة أن يعرف بشكل فريد مجموعة فرعية العاصمة محددة، والحد المحتمل للدراسات تطبق فقط أربعة ألوان قياس التدفق الخلوي هو خطر بما في ذلك سكان الخلية مع علامات المظهرية مماثلة لبلدان النامية. على سبيل المثال، يتم التعبير عن CD11c وعلى كافة DC الدم النخاعي، والغالبية العظمى من وحيدات. من ناحية أخرى، في الدراسات التي تطبق أكثر تقدما لوحات التدفق الخلوي، استخدمت أنسجة الرئة غير سرطانية من استئصال الجراحي للمرضى عادةXREF "> 10، 14، 15، 16، على الرغم من أنه من غير الواضح ما إذا كان هؤلاء السكان نادرة تمثل فعلا البلدان النامية موجودة في الاشخاص الاصحاء. وعموما، هناك دراسات محدودة إلى حد كبير يرجع ذلك إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة.

للتغلب على بعض من هذه القيود، ويصف هذا العمل كيفية إجراء تحليل مفصل لتوزيع المكاني وتحديد المظهري من البلدان النامية في الخزعات ضمن القصبة المخاطية التي تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء الذين خضعوا لتنظير القصبات. عدة خزعات صغيرة يمكن جمعها من كل فرد، ويمكن بعد ذلك أن جزءا لا يتجزأ من لباجتزاء والتحليل باستخدام المناعية أو إنزيمي هضمها لتحليل تدفق cytometric المتقدمة. باستخدام أنسجة الرئة في شكل خزعات ضمن القصبة تم الحصول عليها من bronchoscopies يمنح ميزة مما يجعل من الممكن لأداء الحاديudy على متطوعين أصحاء، على عكس الجراحة المفتوحة للرئتين، لأسباب واضحة، ويقتصر على المرضى التي تتطلب جراحة الصدر. وعلاوة على ذلك، فإن الأنسجة التي أخذت عينات خلال القصبات من المتطوعين الأصحاء أمر طبيعي من الناحية الفسيولوجية، على النقيض من منطقة غير المتضررة من أنسجة الرئة في المرضى الذين يعانون من مرض رئوي. من ناحية أخرى، الخزعات صغيرة وعدد الخلايا التي تم استردادها، حتى عندما تجمع عدة خزعات، يحد نوع من التحليلات التي يمكن القيام بها.

في حين يركز هذا العمل على البلدان النامية، والأساليب المذكورة يمكن توسيعها مباشرة لتشمل عددا آخر من الخلايا (المناعة) من الفائدة الموجودة في الأنسجة المخاطية رئة الإنسان. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات هي أيضا قابلة للتطبيق مباشرة لعينات تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أمراض رئوية حيث القصبات هي جزء من وضع التشخيص، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الساركويد، أو سرطان الرئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البحث من قبل مجلس المراجعة الأخلاقية الإقليمي في أوميا، السويد.

1. تنظير القصبات لأخذ العينات ضمن القصبة خزعات من الموضوعات الإنسان

  1. الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المشاركين.
  2. علاج الموضوعات مع ميدازولام عن طريق الفم (4-8 ملغ) وغليكوبيرونيوم الوريد (0،2 حتي 04 ملغ) 30 دقيقة قبل القصبات. تطبيق التخدير الموضعي مع يدوكائين في الحنجرة والقصبات الهوائية. السماح للغرغرة الموضوع مع ~ 3 مل من يدوكائين 4٪ وتطبيق 3 مل إلى قاعدة اللسان وفي الحنجرة عن طريق حقنة الحنجرة. تحسين التخدير الموضعي مع 8-10 جرعة من رذاذ يدوكائين. تنفيذ هذه الخطوة مع الجلوس الموضوع.
  3. إدراج المنظار الفيديو مرنة من خلال الفم عن طريق لسان حال البلاستيك مع هذا الموضوع في موقف ضعيف. استخدام رذاذ القسطرة من صنع هدف لاستكمال التخدير الموضعي من القصبة الهوائية والشعب الهوائية البعيدة عن طريق المنظار. هنا، استخدام جرعة من حوالي5-10 مل من يدوكائين 2٪.
  4. يستغرق 6-9 خزعات المخاطية داخل القصبة من كارينا الرئيسي والانقسامات الشعب الهوائية الرئيسية باستخدام ملقط منوفذة (الشكل 1). بعد القصبات وقبل خروجه من المستشفى، والسماح للبقية الموضوع لمدة 2-4 ساعة وتقدم له / لها مع وجبة خفيفة.

2. تضمين الخزعات في جلايكول Methylacrylate (GMA) الراتنج

ملاحظة: تم وضع بروتوكول المناعية GMA أصلا في جامعة ساوثهامبتون، وحدة بحوث كيمياء أنسجة 17.

  1. تثبيت: لالمناعية، وإزالة خزعات من ملقط ووضعها مباشرة في قارورة زجاجية تحتوي على 3 مل من المجففة الأسيتون ومثبطات الأنزيم البروتيني المثلج (phenylmethylsulfonyl فلوريد (35 ملغ / 100 مل الأسيتون) وiodoacetamide (370 ملغ / 100 مل الأسيتون )). إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب PERFO الخطوات التاليةrmed في غطاء الدخان مع قفازات النتريل المناسبة. طقم التضمين تحتوي على المكونات التي يمكن أن تسبب ردود فعل الحساسية، وتهيج، و / أو حساسية الجلد. يجب التخلص من جميع النفايات من نفايات خطرة.
  2. الجفاف: إزالة الأسيتون مع مثبطات واستبدالها مع الأسيتون المجففة الطازجة (بدون مثبطات) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة الأسيتون واستبدالها بنزوات الميثيل لمدة 15 دقيقة.
  3. تسلل: إعداد محلول معالجة 5٪ حل بنزوات الميثيل في مونومر غليكول ميتاكريليت. 10 مل كافية لقنينة واحدة. استخدام ماصات باستور البلاستيك، مص قبالة حل بنزوات الميثيل واستبدالها مع 3 مل من محلول معالجة. احتضان الخزعات وحل معالجة الزائد عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. الماصات باستور يمكن استخدامها لجميع التغييرات حل لاحقة، بما في ذلك تضمين حل.
  4. تبادل حل معالجة كل 2 ساعة (3X 2 حضانات ساعة)، وبالتالي فإن مجموع الوقت تسلل الحيويةpsies في حل معالجة هو لا يقل عن 6 ساعة. إدراج ملصقات ورقية في نهاية العلوي من الكبسولات تضمين لتحديد الخزعات.
  5. يعد حل التضمين من 75 ملغ البنزويل بيروكسايد في 10 مل من مونومر غليكول ميتاكريليت. إضافة 0.25 مل من N، N بولي -dimethylaniline (أكسيد الاثيلين) (التسريع) إلى حل التضمين لبدء رد فعل البلمرة. إزالة حل معالجة ووضع خزعة واحدة في كبسولة التضمين ذات الصلة باستخدام ملقط.
  6. ببطء ملء الكبسولة تضمين إلى الأعلى مع تضمين حل وأغلق الغطاء. تجنب إزعاج خزعة وخلق فقاعات الهواء الكبيرة. احتضان الكبسولات في 4 درجات مئوية حتى بلمرة الراتنج تماما.
  7. تخزين الخزعات جزءا لا يتجزأ في -20 درجة مئوية في أنبوب 50 مل تحتوي على ما يقرب من 5 غ من هلام السيليكا.

3. باجتزاء من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-

  1. طلاء شريحة المجهر: تغسل الشرائح المجهر فيغسالة الصحون في دورة عادية. تغطية الشرائح والسماح لهم الهواء الجاف.
  2. يعد حل طلاء من 10٪ بولي-L-ليسين (PLL) حل في الماء المقطر. غمر الشرائح في حل الطلاء لمدة 5 دقائق، ثم السماح لهم الهواء الجاف. تخزين جافة الشرائح المغلفة PLL في صناديق الأصلية.
  3. تغسل شرائح الزجاج ورقة مع 0.1٪ توين 20 في الماء المقطر. شطف الزجاج مع الايثانول 70٪ والجافة مع المناشف الورقية. قطع ريش الزجاج من قطاع الزجاج باستخدام صانع سكين. تخزين شفرات في حاوية يمنع الحركة لضمان طليعة لا يحصل تلف أو رصدت.
  4. خزعة تقليم: ضع الكبسولة خزعة في التقسيم كبسولة وخفض كل جانب باستخدام الكربون الصلب حافة شفرة واحدة. إزالة خزعة جزءا لا يتجزأ من GMA-ووضعه بقوة في الرذيلة. تقليم الزائد GMA من جميع أنحاء الخزعة باستخدام شفرة الفولاذ.
  5. GMA باجتزاء.
    1. إعداد 0.05٪ محلول الأمونيا مع الماء المقطر. ضع السكين والزجاج، وخزعة في الالبريد مشراح. بعناية محاذاة كتلة خزعة مع شفرة عن طريق ضبط حامل سكين وزاوية كتلة خزعة بحيث تقع شفرة مسطحة ضد سطح الكتلة.
    2. قطع 2 ميكرون أبواب سميكة باستخدام مشراح على سرعة القطع بطيئة واستخدام ملقط لنقل وتطفو من المقاطع على الماء والأمونيا. تطفو على أقسام لل45-90 ثانية، مما يسمح لطيف استرجاع مستضد وتتكشف من هذا الباب.
    3. التقاط المقاطع مع شريحة المجهر. فحص الأنسجة خزعة من تلطيخ بسرعة مع طولويدين الأزرق.
    4. تجفيف الشرائح على مجموعة لوحة الساخن إلى 50 درجة مئوية، وتطبيق 500 ميكرولتر من طولويدين تصفيتها وصمة عار الزرقاء إلى قسم باستخدام ماصة باستير البلاستيك. تدفئة القسم على صفيحة ساخنة حتى تبدأ حلقة الخضراء في الظهور على حافة وصمة عار، ثم غسله بالماء.
    5. باستخدام المجهر الضوئي، والتحقق من الأنسجة الخزعة. أقسام المستخدمة لالمناعية يجب أن يحتوي على مناطق جيدة من الصفيحة التالفةالمخصوصة وظهارة، مع عدد قليل من الغدد وكما تذكر العضلات الملساء وقت ممكن.
    6. كما هو الحال في القسم 3.4.2، وقطع الفروع التي لديها الأنسجة جيدة واعتقالهما مع شرائح المجهر المغلفة PLL لتلطيخ المناعى. قطع اثنين على الأقل مقاطع من كل خزعة للتحليل. الشرائح الجافة لا يقل عن 1 ساعة. بعد التجفيف، وأقسام يمكن أن تكون ملفوفة في احباط القصدير وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع، أو أنها يمكن immunostained على الفور.

4. المناعى تلطيخ من التحليلات ضمن القصبة جزءا لا يتجزأ من GMA-

ملاحظة: أزيد الصوديوم السامة. تحضير 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم داخل غطاء الدخان وبعيدا عن الأحماض. الاتصال مع الأحماض يحرر غاز سام.

  1. رسم حول المقاطع باستخدام قلم الماس ذات الرؤوس وترتيب الشرائح على رف تلطيخ.
  2. أداء كتلة البيروكسيد. يعد حل كتلة البيروكسيديز من 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في 0.1٪ محلول أزيد الصوديوم. تطبيق ورقةذ 1 مل من كتلة البيروكسيديز إلى أقسام واحتضان لمدة 30 دقيقة.
  3. إعداد محلول غسل 0.05 مخزنة المالحة تريس-M (TBS)، ودرجة الحموضة 7.6. تغسل الشرائح في TBS، 3X 5 دقائق.
  4. يعد حل كتلة BSA 1٪ في DMEM. القيام بذلك في وقت مبكر وبكميات كبيرة، قسامة وتجميده لحين الحاجة إليها. استنزاف الشرائح واحتضان المقاطع في حل كتلة لمدة 30 دقيقة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. إذا غير محددة ملزمة لا يزال يحدث، وتشمل حضانة خطوة 30 دقيقة مع كتلة المصل 5٪ من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية (CD45 أو CD1a) في TBS إلى تركيز المطلوب (CD45 المخفف في 1: 1000، CD1a المخفف في 1: 1،00) وتطبيقه على الشرائح. ساترة الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في RT.
  6. غسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تمييع الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز (موجهة ضد الأنواع المضيفة الأجسام المضادة الأولية، في هذه الحالة أرنب لمكافحة فأر F (أ ب "2)) في TBS إلى تركيز المطلوب (1:300 تمييع) وتطبيقه على الشرائح. احتضان لمدة 2 ساعة على RT.
  7. إعداد معقدة لا يقل عن 30 دقيقة البيوتين البيروكسيديز streptavidin قبل الاستخدام. ضمان وجود ما يكفي لتغطية كافة الشرائح. تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. تطبيق الحل على الشرائح واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
  8. تغسل الشرائح في TBS ثلاث مرات. إعداد 3-أمينو-9-ethylcarbazole (AEC) حل البيروكسيديز الركيزة (صنع في تعليمات الشركة الصانعة). تطبيقه على الشرائح واحتضان لمدة 20-30 دقيقة أو حتى شدة وصمة عار المطلوب يتطور.
  9. شطف الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق. مباين الأقسام مع حل haematoxylin تصفيتها ماير لمدة 2 دقيقة. تغسل الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
  10. استنزاف الشرائح وتغطية أقسام المتوسطة مع تصاعد مائي دائم. تجفيف الشرائح في 80 درجة مئوية في فرن التجفيف. السماح للشرائح حتى يبرد، ومن ثم تحميل لهم DPX ووضع ساترة.

5. القديستحليل aining

  1. تحليل الأقسام في 40X التكبير باستخدام المجهر الضوئي مع كاميرا محمولة متصلة بجهاز كمبيوتر.
    ملاحظة: للحصول على تحليل الخلوي، العد الملون بشكل إيجابي، وخلايا الأنوية داخل الصفيحة المخصوصة القصبي وظهارة سليمة، باستثناء مناطق العضلات الملساء والغدد والأوعية الدموية الكبيرة، والأنسجة غير متطابقة أو التالفة.
  2. متوسط ​​عدد الخلايا وتصحيح متوسط ​​عدد خلايا لمنطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة. ويمكن حساب منطقة الصفيحة المخصوصة وطول ظهارة باستخدام برنامج تحليل الصور.

6. الأنزيمية الهضم من ضمن القصبة الخزعات

  1. الخزعات غسل: استخدام ملقط معقم، مكان الخزعات سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزنة هانك (HBSS) (الشكل 3). احتضان لمدة 5 دقائق على RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة. نقل الخزعات إلى د معقمإيش من قبل الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS.
  2. تعطيل المخاط مع DTT: استبدال HBSS في أنبوب مع 10 مل من HBSS تحتوي على 5 ملم 1،4-dithiothreitol (DTT). نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
  3. دوامة أنبوب بلطف لمدة 15 ثانية. نقل الخزعات على طبق العقيمة التي كتبها الصب محتوى أنبوب 15 مل مع HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي.
  4. نقل الخزعات إلى ثقافة المتوسط: استبدال HBSS والتلفزيون الرقمي الأرضي في الأنبوب مع 10 مل من RPMI 1640 مستنبت. نقل الخزعات مرة أخرى في أنبوب 15 مل باستخدام ملقط معقم. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT على منصة هزاز في 30 دورة في الدقيقة.
  5. هضم الخزعات مع كولاجيناز والدناز.
    1. يعد حل هضم كولاجيناز الثاني (0.25 ملغ / مل)، والدناز (0.2 ملغ / مل) في درجة حرارة ما قبل RPMI تحتوي على 1 حل M HEPES. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل بئر في عبادة الأنسجة 48-جيدا لوحة لدى عودتهم.
    2. ضع 1 خزعة لكل بئر في حل الهضم. احتضان لوحة على منصة تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة. ماصة صعودا وهبوطا بعد 30 دقيقة لإعادة تفريق الخزعات، وبعد 60 دقيقة، لتفصيل تماما الأنسجة.
  6. إعداد تعليق خلية واحدة.
    1. تجمع معا الخزعات هضمها من الآبار في أنبوب 50 مل بتمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. جمع الخلايا المتبقية عن طريق غسل الآبار مع العازلة FACS المثلج (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني).
    2. ضغط على الأنسجة المتبقية على مصفاة الخلية باستخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنة. الطرد المركزي الخلايا هضمها في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف و resuspend بيليه في 5 مل من FACS العازلة الجليد الباردة. عد الخلايا يدويا باستخدام عدادة الكريات والتريبان وصمة عار الزرقاء لتقييم جدوى من الخلايا.

= "jove_title"> 7. تدفق تحليل Cytometric من الخلايا واحدة من ضمن القصبة الخزعات بعد الأنزيمية الهضم

  1. Resuspend وبيليه الخلية إلى ما يقرب من 1 × 10 6 خلايا في 200 ميكرولتر من FACS العازلة.
  2. إضافة صبغة بقاء الخلية لاستبعاد خلية ميتة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من FCR حجب كاشف واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. إضافة الأجسام المضادة سطح الخلية ضد CD45 (2 ميكرولتر)، النسب (CD3، CD20، CD56، CD66abce، وCD14، 2 ميكرولتر لكل منهما)، CD16 (0.5 ميكرولتر)، HLA-DR (3 ميكرولتر)، CD11c و(5 ميكرولتر)، CD123 (5 ميكرولتر)، CD1c (3 ميكرولتر)، وCD103 (2 ميكرولتر) واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تفاصيل عن الأجسام المضادة يمكن العثور عليها في قسم الطرق، ولكن عاير وتحسين الأجسام المضادة لتدفق الدقيق الكريات في الاستخدام. يغسل الأجسام المضادة الزائدة مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في 400 ز س. الحصول على عينات جديدة على قياس التدفق الخلوي أو إصلاح الخلايا في 1٪ امتصاص العرق قبل acquisit في وقت لاحقأيون.
  5. تحديد البلدان النامية الإنسان في الخزعات الرئة باستخدام التدفق الخلوي مقايسة 18 (الشكل 4).
    ملاحظة: استخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، وتتميز الخلايا المناعية من خلايا الرئة الأخرى التي تبوب على CD45. يمكن استبعاد الخلايا الميتة كما الخلايا التي هي ايجابية لايف / صبغ الميت. جميع CD45 + الحية الخلايا، والخلايا النسب (خلايا B وخلايا T، الخلايا القاتلة الطبيعية، العدلات، وحيدات) يمكن استبعاد باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD20، CD3، CD56، CD66abce، CD14، CD16 وفي قناة واحدة. وبعد ذلك، HLA-DR + خلايا سيسمح بتحديد كافة DC الإنسان. MDCs يمكن تمييزها عن PDCS على أساس التعبير عن CD11c وأو عدم وجود CD11c و، على التوالي. MDCs يمكن تقسيمها الى مزيد من CD1c + MDCs أو CD141 +.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الدراسات التي تميز الجهاز التنفسي الخلايا المناعية الأنسجة المقيمين الإنسان، بما في ذلك البلدان النامية، محدودة، يرجع إلى حد كبير إلى حقيقة أن ازالتها جراحيا أو كاملة أنسجة الرئة البشرية الشحيحة. هنا، والخطوط العريضة لطريقة أقل الغازية للحصول على أنسجة الرئة من الخزعات ضمن القصبة (EBB) من المتطوعين الأصحاء والبروتوكولات وضعت لدراسة الخلايا المناعية في النسيج باستخدام المناعية أو التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتصف هذه الورقة كيفية إنشاء توصيف المكاني وphenotypical مفصل من الرئة البلدان النامية الأنسجة المقيمين في البشر صحية باستخدام المناعية والتدفق الخلوي على خزعات المخاطية داخل القصبة التي تم جمعها خلال تنظير القصبات. في الفقرات التالية تناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول في التفاصيل.

خطوات حاسمة للبروتوكول

باجتزاء والمناعية: فمن الأهمية بمكان للحفاظ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر المتطوعين الذين ساهموا المواد السريرية لهذه الدراسة. ونحن أيضا ممتنون للموظفين في وزارة الصحة العامة والطب السريري، شعبة الطب / طب الجهاز التنفسي في مستشفى جامعة، أوميا (Norrlands universitetssjukhus) لجمع جميع المواد السريرية.

وأيد هذا العمل عن طريق منح ل AS-S من مجلس السويدية البحوث، والمؤسسة السويدية القلب والرئة، والمؤسسة السويدية للأبحاث الاستراتيجية، ومعهد كارولينسكا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td colspan = "4" >< قوي > GMA معالجة وتضمينها < / قوي> تجفيف محلول 555813 مقياس
<قوي>تنظير القصبات< / strong>
منظار القصبات BF1T160أوليمبوسBF1T160
مصدر الضوء أوليمبوسإكسيرا CV-160
ملقط مجسمأوليمبوسFB21Cيستخدم لأخذ الخزعات
كتلة لدغةكونميد142920 مم × 27 مم
جلوكوز 25٪  500 مل
جليكوبيرونيوم بروميد في الوريد 0.2 مجم / ملعن طريق الوريد. يمنع إفراز المخاط / اللعاب
ميكس. يمكن استخدام ميدازولام 1 مجم / مل سنويالمزيد من الاسترخاء
ليدوكائين ، 40 مجم / ملإعطاء الفم والحنجرة / الغرغرة
ليدوكائين 100 مجم / مل بخاخيعطى في الجزء الخلفي من الحلق
ليدوكائين 20 مجم / مل رذاذيعطى عن طريق منظار القصبات إلى الشعب الهوائية
قوارير زجاجية5 مل
AcetoneSigma-Aldrich32201-1L
المناخل الجزيئية ، 4 &# 197 ؛ألفا إيسار881203-4 مم الكريات قطرها
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدسيجما ألدريتشP-76260.035 جم / 100 مل أسيتون
يودوأسيتاميدسيجما ألدريتشI-61250.37 جم / 100 مل أسيتون
بوليثين مسطح   ؛ كبسولات تضمين TAABمختبراتTAAB C094500x 8 مم قطر ، بوليثين ، كبسولات مسطحة
القاع حامل كبسولةTAAB مختبراتC054يحمل 25 كبسولة 8 مم
JB-4 GMA طقمتضمين Polysciences00226يحتوي على JB-4 Solution A (0026A-800) ، JB-4 solution B (0026B-3.8) ، البنزويل بيروكسيد (02618-12)
بنزوات الميثيلSigma-Aldrich27614-1L
هلام السيليكا مع مؤشر الرطوبةScharlauGE00432.5-6 mm 
< قوي > GMA التقسيم < / قوي >
شرائح المجهر الزجاجيThermoFisher Scientific10143562CEFحواف مقطوعة ، نهاية بلوري
محلول Poly-L-LysineSigma-AldrichP8920-500mL1:10 لحل العمل
شرائط زجاجية للقطع الفائقAlkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287Wash محلول (0.1٪ Tween20)
LKB 7800B صانع سكاكينLKB
مقسم كبسولةمختبرات TAABC065
شفرات أحادية الحافة من الفولاذ الكربونيمختبراتTAAB B054
Vice
Amonia ، 25٪VWR1133.10002 مل في 1 لتر ، 1: 500 (0.05٪)
MicrotomeLeicaLeica RM 2165
مصدر الضوءLeica LeicaCLS 150 XE
المجهر مع حامل ذراع متأرجحLeica LeicaMZ6
GMA الكيمياء المناعية< / قوي>
الماس يميل القلمHistolab5218
بيروكسيد الهيدروجين 30٪ محلولAnalaR Normapur23619.264
أزيد الصوديومسيجما ألدريتشS8032
تريسروش10708976001
كلوريد الصوديومVWR المواد الكيميائية27810.295
ألبومين مصل البقرميليبور82-045-2درجة تشخيص البروبومين BSA
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)سيجما ألدريتشD5546
الجسم المضاد CD45 المضاد للإنسانBioLegend304002فأر أحادي النسيلة ، استنساخ HI30 ، النمط المتماثل IgG1k. تركيز العمل 500 نانوغرام / مل
الأجسام المضادة CD1a المضادة للإنسانAbD SerotechMCA80GAأحادي النسيلة للفأر ، استنساخ NA1 / 34-HLK ، النمط المتماثل IgG2a. تركيز العمل من 10 & جم / مل
ماوس أحادي النسيلة IgG1 التحكم في النمط المتشافيAbcamab27479
التحكم في النمط المماثل أحادي النسيلة IgG2aDakoX094301-2
Vectastain ABC مجموعة قياسيةVector LabsPK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) بيروكسيداز الركيزة طائرة ورقيةVector LabsSK-4200
Mayers haematoxylinHistoLab01820
تركيب مائي دائم متوسطAbD SerotechBUF058C
فرن
DPX حل تركيب دائم  VWR360292F
مجهر ضوئيLeicaLeica DMLB
كاميرا مجهرLeica LeicaDFC 320
برنامجتحليل LeicaLeica Qwin V3
<قوي > هضم إنزيمي < / قوي >
الملح المتوازن هانك (HBSS) سيجماألدريتش55021C
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
Collagenase IISigma-AldrichC6885
DNaseSigma-Aldrich10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
ملقط
منصة الروكأدوات منحةPMR-30
50 مل أنابيب مخروطيةFalcon14-432-22
40 & micro ؛ مصفاة الخلايا mFalcon352340
< قوي > قياس التدفق الخلوي < / قوي >
فوسفات مخزن محلول ملحي (PBS) طقم
بقع الخلايا الميتة LIVE / DEAD Aqua LifeTechnologiesL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD335829
CD56Biolegend318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
CD16Biolegend302026
CD11cBD560369
CD1cMiltenyi130-098-009
CD141Miltenyi130-090-514
CD103Biolegend350212
ParaformaldehydeSigma-AldrichF8775
LSR II مقياس التدفق الخلويBDالتدفق
الخلوي برنامج FlowJoFlowJoللتحليل

المراجع

  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا الإنسان الجذعية الرئة: التوزيع المكاني والمظهري تحديد في داخل القصبة التحليلات عن طريق المناعية والتدفق الخلوي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.