يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

10K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

يناير 20, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

في هذه المقالة

ملخص

تم عرض نماذج عدوى الزرد الجهازية والموضعية لفيروس الأنفلونزا البشرية A. باستخدام نموذج العدوى الجهازية ، يمكن استخدام أسماك الزرد لفحص الأدوية المضادة للفيروسات. باستخدام نموذج عدوى موضعي ، يمكن استخدام أسماك الزرد لتوصيف استجابات الخلايا المناعية المضيفة.

الملخص

في كل عام، تؤثر فاشيات الأنفلونزا الموسمية تأثيرا عميقا على المجتمعات في جميع أنحاء العالم. وعلى الرغم من الجهود العالمية، لا تزال الأنفلونزا تشكل عبئا مستعصيا في مجال الرعاية الصحية. الاستراتيجية الرئيسية للحد من العدوى هي التطعيم السنوي. في الأفراد الذين أصيبوا بالإنفلونزا ، يمكن للأدوية المضادة للفيروسات أن تخفف الأعراض. هناك حاجة واضحة وغير ملباة لوضع استراتيجيات بديلة لمكافحة الأنفلونزا. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لنمذجة التفاعلات المضيفة والإنفلونزا. هنا ، يتم وصف بروتوكولات توليد نماذج أسماك الزرد للعدوى الجهازية والموضعية بفيروس الأنفلونزا البشرية A (IAV). باستخدام نموذج عدوى IAV الجهازي ، يمكن فحص الجزيئات الصغيرة ذات النشاط المضاد للفيروسات المحتملة. كدليل على المبدأ ، تم وصف بروتوكول يوضح فعالية عقار زاناميفير المضاد للفيروسات في أسماك الزرد المصابة ب IAV. يوضح كيف يمكن قياس الأنماط الظاهرية للمرض لتسجيل الفعالية النسبية لمضادات الفيروسات المحتملة في أسماك الزرد المصابة ب IAV. في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدير متزايد للدور الحاسم الذي تلعبه العدلات في استجابة المضيف البشري لعدوى الأنفلونزا. أثبتت أسماك الزرد أنها نموذج لا غنى عنه لدراسة بيولوجيا العدلات ، مع تأثيرات مباشرة على الطب البشري. تم وصف بروتوكول لتوليد عدوى IAV موضعية في خط أسماك الزرد Tg (mpx: mCherry) لدراسة بيولوجيا العدلات في سياق عدوى فيروسية موضعية. يوفر تجنيد العدلات في مواقع العدوى الموضعية نمطا ظاهريا إضافيا قابلا للقياس الكمي لتقييم التلاعب التجريبي الذي قد يكون له تطبيقات علاجية. وصف كلا بروتوكولي أسماك الزرد بأمانة جوانب العدوى بفيروس الزرد البشري. يمتلك نموذج أسماك الزرد العديد من المزايا المتأصلة ، بما في ذلك الخصوبة العالية ، والوضوح البصري ، وقابلية فحص الأدوية ، وتوافر الخطوط المعدلة وراثيا ، بما في ذلك تلك التي يتم فيها تصنيف الخلايا المناعية مثل العدلات ببروتينات الفلورسنت. تستغل البروتوكولات المفصلة هنا هذه المزايا ولديها القدرة على الكشف عن رؤى مهمة حول تفاعلات المضيف IAV التي قد تترجم في النهاية إلى العيادة.

المقدمة

ووفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO)، بفيروسات الأنفلونزا تصيب 10/05٪ من البالغين و20-30٪ من أطفال سنويا وتسبب 3-5٬000٬000 الحالات المرضية الوخيمة وما يصل إلى 500،000 الوفيات في جميع أنحاء العالم 1. لا تزال لقاحات السنوية ضد الانفلونزا الخيار الأفضل للوقاية من المرض. وقد زادت جهود مثل خطة العمل العالمية لمنظمة الصحة العالمية استخدام اللقاح الموسمي، والقدرة على إنتاج اللقاحات، والبحث والتطوير في استراتيجيات لقاح أكثر فعالية من أجل خفض معدلات المراضة والوفيات المرتبطة فاشيات الأنفلونزا الموسمية 2. هي الأدوية المضادة للفيروسات مثل مثبطات النورامينيداز (على سبيل المثال زاناميفير وأوسيلتاميفير) المتوفرة في بعض البلدان وأثبتت فعاليتها في تخفيف أعراض، عندما تدار داخل ساعة 48 الأولى من بداية 3، 4، 5. وعلى الرغم من الجهود العالمية، احتواء الانفلونزا الموسمية أوويبقى tbreaks تحديا هائلا في هذا الوقت، وفيروس الأنفلونزا الانجراف الأنتيجين غالبا ما يتجاوز قدرات الحالية للتكيف مع الجينوم المتغيرة للفيروس 6. ويجب وضع استراتيجيات لقاح يستهدف سلالات جديدة من الفيروس في وقت مبكر ويتم تقديمها في بعض الأحيان أقل من فعالة على النحو الأمثل بسبب التغيرات غير المتوقعة في أنواع السلالات التي تسود في نهاية المطاف في موسم الأنفلونزا. لهذه الأسباب، هناك حاجة واضحة لتطوير استراتيجيات علاجية بديلة لاحتواء العدوى والحد من الوفيات. طريق التوصل إلى فهم أفضل للتفاعل المضيفة للفيروسات، قد يكون من الممكن لتطوير الأدوية المضادة للانفلونزا الجديدة والعلاجات المساعدة 7 و 8.

والإنسان المضيف الأنفلونزا A التفاعل فيروس (IAV) معقد. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من العدوى IAV البشري من أجل الحصول على نظرة ثاقبة على التفاعل المضيفة للفيروسات، امبجي الفئران والخنازير الغينية والفئران القطن، الهامستر والقوارض، وقرود المكاك 9. في الوقت الذي توفر البيانات الهامة التي عززت فهم الديناميات في استضافة IAV، كل كائن نموذج يمتلك السلبيات الهامة التي يجب مراعاتها عند محاولة تحويل النتائج إلى الطب البشري. على سبيل المثال، والفئران، والتي هي النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع، لا تتطور بسهولة أعراض العدوى التي يسببها IAV-عند المصابين بالانفلونزا البشرية يعزل 9. وذلك لأن الفئران تفتقر إلى مع الأجسام الطبيعية للأنفلونزا البشرية يعزل منذ خلايا فأر الظهارية تعبر عن 2،3 ألفا الروابط حمض اللعابي بدلا من الروابط حمض اللعابي α-2،6 أعرب عن الخلايا الظهارية الإنسان 10. البروتينات راصة دموية موجودة في IAV البشري العزلات ربط بشكل إيجابي ودخول الخلايا المضيفة التي تحمل روابط الحامض اللعابي ألفا 2،6 من خلال مستقبلات بوساطة الإلتقام 9، 11، 12 و 13. ونتيجة لذلك، ومن المسلم به الآن أن في تطوير نماذج الماوس لالإنفلونزا البشرية، يجب توخي الحذر لإقران سلالة المناسب من الماوس مع الضغط المناسب للأنفلونزا من أجل تحقيق الظواهر المرض الذي ألخص جوانب الأمراض التي تصيب الإنسان. في المقابل، الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي العلوي للقوارض تمتلك 2،6 ألفا الروابط حمض اللعابي التي تشبه خلايا الإنسان 14. تشترك القوارض المصابة العديد من الميزات المرضية والسريرية التي لوحظت في الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك المرضية وعلى الانتقال من فيروسات الانفلونزا البشرية والطيور 14 و 15. بل هي أيضا قابلة للغاية لمحاكمات نجاعة اللقاح. ومع ذلك، فإن نموذج النمس للأنفلونزا البشري لديه عدة عيوب تتعلق أساسا حجمها وتكلفة تربية التي تجعل الحصول على signifi إحصائياالبيانات غير قادر على التحدي. وبالإضافة إلى ذلك، وفرت عرض سابقا الاختلافات في حركية الدواء، التوافر البيولوجي، وسمية التي تجعل اختبار فعالية صعوبة. على سبيل المثال، قوارض يحمل سمية إلى M2 القناة الايونية المانع الأمانتادين 16. وبالتالي، فمن الواضح أن في اختيار نموذج حيواني لدراسة الأسئلة حول التهابات IAV الإنسان، فمن المهم النظر في المزايا الكامنة والقيود، وجانب من جوانب التفاعل المضيفة للفيروسات التي هي قيد التحقيق.

الزرد، دانيو rerio، هو نموذج الحيوان الذي يوفر فرصا فريدة للتحقيق العدوى الميكروبية، استضافة الاستجابة المناعية، والعلاجات المحتملة المخدرات 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، <الطبقة سوب = "XREF"> 24، 25، 26، 27، 28. وجود الأحماض اللعابي المرتبطة α-2،6 على سطح الخلايا في الزرد اقترح قابليته للIAV الذي تنعم به في دراسات العدوى وتصوير في الجسم الحي باستخدام سلالة مراسل فلوري من IAV 19. في الزرد المصابين IAV، أشارت زيادة التعبير عن فيروسات ifnphi1 وMXA النصوص أن الاستجابة المناعية الفطرية قد تعززت، وكان علم الأمراض المعروضة من قبل الزرد المصابين IAV، بما في ذلك وذمة وتدمير الأنسجة، على غرار تلك التي لوحظت في عدوى الإنفلونزا البشرية . وعلاوة على ذلك، فإن IAV المضادة للفيروسات النورامينيداز المانع زاناميفير فيات محدودة وانخفاض تكاثر الفيروس في الزرد 19.

في هذا التقرير، وبروتوكول لجهاز التفجيروصفت إصابات جيم IAV في الأجنة الزرد. باستخدام زاناميفير بجرعات ذات الصلة سريريا بمثابة إثبات صحة المبدأ، أثبتت فائدة هذا النموذج العدوى IAV الزرد لمركبات الكشف عن النشاط المضاد للفيروسات. وبالإضافة إلى ذلك، وبروتوكول لتوليد المحلية، والعدوى IAV الظهارية في الزرد السباحة المثانة، الجهاز الذي يعتبر تشريحيا ووظيفيا مماثلة لالرئة الثدييات 21، 29، 30، 31، يوصف. باستخدام هذا النموذج العدوى IAV المحلية، يمكن تتبع تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة، مما التحقيقات في دور البيولوجيا العدلات في العدوى IAV والالتهابات. هذه النماذج الزرد تكمل النماذج الحيوانية الموجودة الالتهابات IAV الإنسان ومفيدة بشكل خاص لاختبار الجزيئات الصغيرة واستجابات الخلايا المناعية بسبب إمكانية تعزيز الصورةالسلطة tatistical، والقدرة على moderate- لفحوصات عالية الإنتاجية، والقدرة على تتبع سلوك الخلايا المناعية وظيفة مع ضوء المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال باستخدام مستوى السلامة الحيوية 2 (أو BSL2) المعايير التي وصفها المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض (CDC) وفقا للتوجيهات التي وضعتها المؤسسات ورعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC). يرجى تشاور مع المسؤولين المعنيين لضمان السلامة والامتثال.

1. العناية الزرد والصيانة

  1. تفرخ الزرد وجمع العدد المطلوب من الأجنة لهذه التجارب. عند الضرورة، وخزانات تربية الجماعية، مثل تلك التي وصفها Adatto وآخرون. 32، يمكن استخدامها لجمع أعداد كبيرة من الأجنة نظموا تنمويا.
  2. السماح للأجنة لتطوير حتى المرحلة المطلوبة التنموية (48 ساعة بعد الإخصاب لعدوى النظامية IAV [القسم 3] أو 5 أيام بعد الإخصاب ل، والسباحة عدوى المثانة محلي [القسم 4]) في أطباق بتري عميقة في كثافة منخفضة (< 100 الأجنة / طبق) عند 28 درجة مئوية في الماء البيض معقمة تحتوي على 60 ميكروغرام / مل ملح البحر (على سبيل المثال، المحيط الفوري) في الماء المقطر.
    1. إزالة الأجنة الميتة مع pipets نقل البلاستيكية وتغيير بيضة يوميا المياه لضمان صحة أفضل والتنمية.

2. إعداد المواد والكواشف

  1. إعداد 4 ملغ / مل حل الأسهم من تريكين-S (ضبط درجة الحموضة إلى 7،0-7،4) في الماء المقطر والأوتوكلاف. تخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. سحب الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط باستخدام مجتذب micropipette (على سبيل المثال Micropipette بولير مع الإعدادات التالية: وضع الضغط = 100، الحرارة = 550، سحب = [لا قيمة]، سرعة = 130، والوقت = 110).
    ملاحظة: قبل تقليم الإبرة، وطول من حيث تبدأ إبرة في الاضمحلال إلى رأس الإبرة سيكون ما يقرب من 12-15 ملم. هذا يمكن أن تختلف، ولكن، على أساس تفضيل والتطبيق. قد يكون، تفتق أكثر تدرجا أطول أكثر الأفضل بسبب زيادة القدرة على اختراق الجنين وانخفاض ريكورونا من الانحناء الإبرة أو كسر.
  3. تذوب 2 غرام من الاغاروز في الماء بيضة 100 مل باستخدام الميكروويف. جعل لوحات التي ليصطف وحقن الأجنة عن طريق صب agarose ذاب أطباق بتري عميقة والسماح لها لترسيخ.
  4. جعل 10 ملغ الأسهم / مل من زاناميفير في nuclease خالية من المياه. قسامة والتجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  5. تذوب 0.5 غرام الاغاروز في الماء البيض 50 مل باستخدام الميكروويف لجعل الجنين تصاعد الاغاروز. المحافظة في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام أثناء التصوير.

3. الجهازية IAV العدوى (48 ساعة بعد الإخصاب)

تنبيه: يجب على جميع أفراد البحث تتشاور مع رؤسائهم والأطباء بشأن التطعيم قبل بدء العمل مع IAV.

  1. dechorionate يدويا الأجنة في يوم التجربة باستخدام ملقط # 5. الحرص على إزالة والموت ببطء الأجنة التي أصيبوا في العملية 200 ميكروغرام / مل تريكين حل.
  2. إعداد سو IAV ل microinjection
    ملاحظة: سلالات التي ثبت أن تصيب الأجنة الزرد هي انفلونزا ايه / علاقات عامة / 8/34 (H1N1) (APR8)، الأنفلونزا A X-31 A / ايتشي / 68 (H3N2) (X-31)، ومراسل فلوري سلالة الانفلونزا NS1-GFP 33. تفاصيل حول APR8 وX-31، والسلالات الأخرى، ويمكن الاطلاع على قاعدة بيانات بحوث الأنفلونزا
    1. نشر سلالة NS1-GFP من IAV في بيض الدجاج المحتوي كما هو موضح سابقا 34 و 35. جمع وقسامة، وعيار السوائل السقاء تحتوي على IAV، ومخزن في -80 درجة مئوية. قبل titered APR8 وX-31 فيروسات يمكن شراؤها تجاريا.
      1. فقط قبل الإصابة، ذوبان الجليد بسرعة قسامة IAV في يد القفاز وبعد ذلك وضعت بسرعة على الجليد للحد من الخسائر من عيار.
    2. تخفيف الفيروسي
      1. في حالة استخدام APR8 أو X-31 الفيروسات، ويخفف إلى 3.3 × 10 6 بيضة الجرعة المعدية 50٪ (EID50) / مل في العقيمة، الجليد الباردة برنامج تلفزيوني supplemented مع 0.25٪ أحمر الفينول (للمساعدة في التصور) في غطاء تدفق الصفحي. وضع في وقت واحد يصل عنصر تحكم يحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة مع 0.25٪ الفينول الأحمر.
      2. في حالة استخدام NS1-GFP سلالة 33، ويخفف إلى ~ 1.5 × 10 2 وحدة لوحة تشكيل (PFU) في NL في العقيمة، الجليد الباردة برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ أحمر الفينول (للمساعدة في التصور) في غطاء تدفق الصفحي. وضع في وقت واحد حتى تحكم تحتوي على السوائل السقاء من بيض الدجاج غير مصاب المخفف مثل الفيروس في برنامج تلفزيوني العقيمة مع 0.25٪ الفينول الأحمر.
      3. الحفاظ على IAV على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
    3. حل فيروس الماصة إلى microinjection الإبر باستخدام نصائح microloader فقط قبل استخدامها. إدراج حقن مكروي إبرة في حامل المناسب للجهاز حقن (على سبيل المثال MPPI-3 ضغط نظام حقن).
    4. أثناء عرض تحت المجهر ستيريو، مقطع بلطف إبرة حقن مكروي مع حادة، تعقيم # 5 ملقط.
      ملاحظة: ومن recommenدائرة التنمية الاقتصادية أن الطرف حقن مكروي أن يثقب تدريجيا.
    5. خفض دواسة القدم من نظام حقن الضغط ويحقن في قطرة من زيت المجهر الغمر على شريحة معايرة ميكرومتر. قياس قطرها من الانخفاض. حساب حجم الانخفاض باستخدام المعادلة، V = 4/3 3πr، حيث V هو حجم في NL و r نصف قطر في ميكرون.
      ملاحظة: إذا كان قطره قطرة صغيرة جدا، والزجاج إضافي يمكن قص أو يمكن تعديل إعدادات الضغط وتوقيت. إذا كان قطرها انخفاض كبير جدا، ويمكن تعديل إعدادات الضغط وتوقيت.
    6. ضبط إعدادات الضغط وتوقيت على محقن الضغط و / أو reclip طرف الإبرة حتى يتم تحقيق حجم الحقن المطلوب (عادة 1-3 NL). ضبط الضغط بين 20 و 30 رطل ومدة النبضة الإعدادات بين 40 و 80 ميللي ثانية نموذجية. ضبط الضغط الى الوراء بحيث عدادات الضغط الشعرية ولكن لا تسرب IAV (صافي ضغط صفر).
  3. محاذاة الأجنة لحقن
    1. تخدير الأجنة dechorionated في 200 ميكروغرام / مل تريكين.
    2. بعد توقف الحركة، نقل 10-20 الأجنة إلى لوحة الاغاروز 2٪ (المعد في القسم 2.3) مع ماصة بلاستيكية. استخدام ماصة بلاستيكية لإزالة السائل الزائد.
    3. محاذاة بلطف الأجنة ل microinjection مع الشعرية مصقول إطلاق النار ومختومة الزجاج البورسليكات. باستخدام مجهر ستيريو والأجنة توجيه بلطف بحيث القناة كوفييه أو الوريد الخلفي الكاردينال يتماشى مع حقن مكروي إبرة (الشكل 1A).
  4. IAV حقن مكروي
    1. إدراج بلطف الإبرة microinjection في القناة كوفييه أو الوريد الخلفي الكاردينال. خفض دواسة القدم لحقن حجم المطلوب من IAV إلى الدورة الدموية للجنين (الشكل 1A). الأجنة يمكن حقن أكثر من مرة واحدة إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يجب أن اكتسح البلعة حقن ما يصل إلى الدورة الدموية وتوزيع الطاقuted في جميع أنحاء الجسم. إذا تجمع حجم الحقن في موقع الحقن، وإزالة الجنين من التجربة والموت ببطء.
    2. تكرار الحقن على الأجنة مختلفة مع حل التحكم مخصص للسلالة من فيروس الذي تم اختياره. لAPR8 وX-31، استخدام جهاز التحكم هو موضح في القسم 3.2.2.1. لNS1-GFP، استخدام جهاز التحكم هو موضح في القسم 3.2.2.2.
  5. نقل الأجنة إلى أطباق بتري وصفت تحتوي على الماء المعقم البيض ووضعه في الحاضنة عند 33 درجة مئوية.
    يجب أن تنمو المصابة الأجنة عند 33 درجة مئوية إلى دعم وتعزيز تكاثر الفيروس: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، الحضانة عند 33 درجة مئوية يقلد أوثق درجة حرارة الجهاز التنفسي العلوي البشري، الذي هو على اتصال وثيق مع انخفاض درجات الحرارة في البيئة الخارجية وحيث تحدث العدوى IAV. يمكن الأجنة يتأقلم على درجة حرارة تتراوح اسعة 34.

4. المترجمة، السباحة المثانة IAV العدوى في تيراغرام (MPX: mCherry) المعدلة وراثيا الزرد (5 أيام بعد الإخصاب)

  1. إعداد IAV ل microinjection
    1. تخفيف التوتر والسيطرة حل حقن NS1 GFP كما هو موضح في القسم 3.2.
    2. تعد الإبر كما هو موضح في القسم 2.2.
    3. محاذاة تيراغرام (MPX: mCherry) 35 اليرقات التي تحتوي على خزانات السباحة تضخم كما هو موضح في القسم 3.3 مع الاستثناء التالي. محاذاة اليرقات في مثل هذه الطريقة التي الإبرة يمكن أن تخترق المثانة السباحة ويمكن للفيروس أن تودع الخلفي للمثانة السباحة، كما هو موضح سابقا 36 (الشكل 2A).
  2. IAV حقن مكروي
    1. إدراج بلطف الإبرة microinjection في المثانة السباحة وحقن حجم المطلوب (مثلا 5 NL) نحو الخلفي من الهيكل (الشكل 2A).
      ملاحظة: إن البلعة حقن ينبغي أن تجمع نحو الخلفي وفقاعة الهواء المثانة السباحة يجب أن بالنازحين ه إلى الأمام. وينبغي أن يبدأ التعبير GFP التي يتعين مراعاتها في 3 ساعات بعد الحقن.
    2. كرر الحقن بمحلول تحكم مخصص للسلالة من فيروس المختار، كما هو موضح في القسم 3.4.2.
  3. نقل اليرقات إلى أطباق بتري تحتوي على الماء المعقم البيض ووضعه في الحاضنة عند 33 درجة مئوية.

5. المضادة للفيروسات العلاج من تعاطي المخدرات

ملاحظة: بروتوكول يصف أدناه علاج زاناميفير أظهرت في وقت سابق في غابور وآخرون. 19. هذا البروتوكول يمكن تعديلها لفحص الأدوية المضادة للفيروسات أخرى ولديه القدرة على أن يتم تعديل لفحص مركبات متعددة في 96 لوحة جيدا، شكل الإنتاجية العالية.

  1. في 3 ساعة بعد الإصابة، يحل محل المياه البيض من NS1-GFP- والأسماك المصابة السيطرة بالماء بيضة معقمة تحتوي على 0، 16.7، أو 33.3 نانوغرام / مل زاناميفير.
    ملاحظة: تم اختيار هذه التركيزات من أجل محاولة لتكرار المستويات الفسيولوجية التي تحققت FOإدارة النماذج التالية من زاناميفير في المرضى من البشر (100، 200، أو 600 ملغ، والرابع، مرتين يوميا أو 10 ملغ استنشاق مرتين يوميا). تراوحت تركيزات مصل في المرضى من البشر 9،83-45،3 نانوغرام / مل 36.
  2. على مدى 5 أيام، وتغيير الماء بيضة كل 12 ساعة واستبدالها بالماء بيضة معقمة تحتوي على كمية مناسبة من زاناميفير.
  3. تتبع دورة العدوى.
    1. تخدير الزرد في 200 ميكروغرام / مل تريكين. مراقبة التعبير GFP بواسطة المجهر ستيريو مضان لمراقبة بصريا الاختلافات في أنماط العدوى بين الأسماك المصابة IAV والسيطرة وبين الأسماك منغمسين في تركيزات مختلفة من المخدرات.
    2. تتبع معدلات الاعتلال والوفيات على مدى 5 أيام.
      1. ملاحظات حول سجل ديناميات العدوى المتعلقة علم الأمراض، بما في ذلك علامات الخمول ودليل على وذمة، والاختلافات في التصبغ، العين وتشوهات القحفي، وقعس. علم الأمراضوعادة ما يصبح واضحا في السيطرة على الأسماك المصابة في 24-48 ساعة بعد الحقن، وهذا يتوقف على كمية الفيروس حقن. جمع الصور 24 ساعة بعد الحقن.
      2. كل 24 ساعة لمدة 5 أيام بعد الإصابة، وتسجيل عدد من القتلى، المهووسين، وصحية اليرقات. ويعرف الموت لعدم وجود ضربات القلب ملحوظ. رسم البيانات كما تريد. على سبيل المثال، خططت البيانات مؤامرة كشريط الرسم البياني مكدسة مع وجود نسب من الأسماك صحية، المهووسين، أو الميت على المحور الصادي ومجموعة العلاج على محور س. 19
        ملاحظة: قد يكون وسجل النفوق وفقا للتقديرات بقاء كابلان ماير. اعتمادا على التطبيق، قد يكون من المناسب لتطوير النهج البديلة لاعتلال التهديف الأسماك، بما في ذلك مصفوفة النقاط التي قد قياس درجة الاعتلال على أساس الخصائص المرضية المذكورة أعلاه لاحظ.
      3. تشاور مع خبير احصائي لتطبيق التحليلات الإحصائية المناسبة.

6. هجرة العدلات

ملاحظة: يصف بروتوكول أدناه طريقة لتتبع هجرة العدلات إلى المثانة السباحة بعد الإصابة IAV محلي، الظهارية. الأساليب المذكورة يمكن تعديلها لاختبار آثار التلاعب الجيني والكيميائية. باستخدام هذه التقنية، سيكون من الممكن لوصف الآليات الكامنة وراء السلوك العدلات خلال عدوى IAV.

  1. تصاعد الزرد للتصوير
    1. تخدير اليرقات للتصوير في 200 ميكروغرام / مل تريكين.
    2. نقل والفردية تيراغرام (MPX: mCherry) يرقة التي تم المصابين NS1-GFP إلى بئر من 24 بئر، والزجاج لوحة أسفل في قطرات صغيرة من الماء البيض (~ 50-100 ميكرولتر). كرر مع غيرها من الأسماك IAV المصابة والسيطرة.
    3. ببطء إضافة 1٪ الجنين الاغاروز تصاعد وسائل الإعلام إلى كل (القسم 2.5) جيدا، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات كبيرة.
      1. ضبط بلطف موقف يرقة بحيث يتم تركيبه على جانبها.جودي وهنري 37 تصف كيفية جعل تحقيقات أن تعمل بشكل جيد في هذا التطبيق باستخدام دبابيس الحشرات التي يتم تحميلها في الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط وsuperglued في المكان.
    4. مرة واحدة يصلب الاغاروز، وملء بلطف الآبار الفردية بالماء بيضة تحتوي على 200 ميكروغرام / مل تريكين.
    5. مع المجهر متحد البؤر، والقبض على من الالف إلى الياء سلسلة كومة من brightfield ومضان الصور باستخدام الهدف 20X تركز على المثانة السباحة.
      1. تعيين الحدود العليا والدنيا، بحيث القبض على جميع مضان الأخضر والأحمر يمكن ملاحظتها بشكل واضح.
      2. التقاط الصور في 2.0 μsec / بكسل مع الخطوات التي ≤ 4 ميكرون. زيادة الوقت لكل بكسل وتقليل المسافة بين خطوات (على سبيل المثال 0،5-1،0 ميكرون) يزيد من دقة الصورة وجودتها.
      3. توليد صورة ثنائية الأبعاد عن طريق دمج الطبقات.
      4. مقارنة عدد العدلات MPX-mCherry إيجابية ط الحالين قربة السباحة من IAV المصابة وحقن السيطرة الزرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، يتم توفير البيانات التي تبين كيفية العدوى IAV النظامية في الزرد يمكن استخدامها لاختبار نجاعة الأدوية (الشكل 1A). يتم حقن أجنة في 48 ساعة بعد الإخصاب مع APR8 (أرقام 1C، 1F)، X-31 (أرقام 1D، 1G)، أو NS1-GFP (أرقام 1H-1I) عبر القناة كوفييه لبدء العدوى الفيروسية. تم حقن فوج آخر من أجنة في 48 ساعة بعد الإخصاب لتكون بمثابة الضوابط لعدوى فيروسية (أرقام 1B، 1E). قبل 4...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لتحقيق أقصى قدر من الفوائد المكتسبة من استخدام الحيوانات الصغيرة لنموذج التفاعلات المضيف الممرض الإنسان، فمن المهم لتأطير أسئلة البحث واختبار الفرضيات أن الاستفادة من المزايا الكامنة في النظام النموذجي. كنموذج للعدوى IAV الإنسان، والزرد لديها العديد من نقاط القوة، بما في ذلك الخصوبة العالية والوضوح البصري، قابليته لفحص المخدرات، وتوافر خطوط المعدلة وراثيا أن تسمية الخلايا المناعية مثل العدلات. وقد تم تطوير الزرد كبديل قوي على نحو متزايد إلى نظام نموذج الفأر لدراسة الالتهاب والمناع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا مارك نيلان على رعاية وصيانة أسماك الزرد وميغان بريتباخ وديبورا بوشار لنشر NS1-GFP وتحديد عيار IAV. تم دعم هذا البحث من قبل منحة NIGMS P20GM103534 NIH ومحطة التجارب الزراعية والغابات في مين (رقم المنشور 3493).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماركات طيفالمحيط الفوريSS15-10
100 مم × 25 مم أطباق بتري معقمة يمكن التخلص منها   ؛VWR89107-632
ماصات النقل Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)
الغربية مع خيوط   ؛أداة سوتر BF120-69-10
مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني أداة سوترP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont # 5 ملقط   ;علوم المجهر الإلكتروني72700-D
نصائح MicroloaderEppendorf930001007
زيت الغمر المجهرأوليمبوسIMMOIL-F30CC
معايرة المرحلة المجهرية  حاقن الضغط AmScopeMR095
MPPI-3  الأجهزة
التطبيقية مجهر ستيريوأوليمبوسSZ61
وحدة الضغط الخلفيالأجهزة العلمية التطبيقيةالدقيقة BPU
الأجهزة العلمية التطبيقيةMPIP
مفتاحالقدم الأجهزة العلمية التطبيقيةFSW
Micromanipulatorالأجهزة العلمية التطبيقيةMM33
القاعدة المغناطيسيةالأجهزة العلمية التطبيقيةقاعدة
الفينول الأحمر & nbsp ؛سيجما ألدريتش P-4758
حاضنة درجة حرارة منخفضةVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
مصدر الضوء الباردZeiss CL6000 LED
لوحة متعددة الآبار ذات القاع الزجاجي ، 24 بئرMattekP24G-0-13-F
مجهر متحد البؤرأوليمبوسIX-81 مع نظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر FV-1000
نهر تشارلز  490710
الإنفلونزا A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) نهر تشارلز  490715
الإنفلونزا NS1-GFPالمشار إليها في Manicassamy et al.< / em> 2010
Tg (mpx: mCherry)المشار إليها في Lam et al.< / em> 2013
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات الكيميائية شريحة العلمية طقم حامل الماصة مغناطيسية برنامج Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) فيروس   ؛

المراجع

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Tg mpx mCherry
باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.