مقالة منهجية

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

DOI:

10.3791/55236

⸱

يناير 26, 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology, The University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة جديدة وقوية وفعالة لتنقية التقارب الترادفي (TAP) للتعبير عن مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة وعزلها وتوصيفها. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوصيف الكيميائي الحيوي للمجمعات المنفصلة بالإضافة إلى تحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم وظيفتها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية نشط البروتين البروتين والمجمعات حمض البروتين النووي هو أمر حاسم لتوصيف الأنشطة الإنزيمية ودي نوفو تحديد الوحدات الفرعية الجديدة والتعديلات بعد متعدية. أنظمة بكتيرية تسمح للتعبير وتنقيتها من مجموعة واسعة من البروتينية واحدة والمجمعات البروتين. ومع ذلك، فإن هذا النظام لا يمكن تنقية مفارز البروتين التي تحتوي على التعديلات بعد متعدية (على سبيل المثال، الفسفرة وأستلة)، وتحديد مفارز التنظيمية الجديدة التي تكون موجودة فقط / أعرب في النظام حقيقية النواة. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا للرواية، وقوية، وطريقة فعالة لتنقية جنبا إلى جنب تقارب (وات) باستخدام STREP- والبروتينات الموسومة FLAG الذي يسهل عملية تنقية البروتين المجمعات مع عابر أو مستقر أعرب البروتينات الموسومة حاتمة من الخلايا حقيقية النواة. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على تميز بروتعين الوظائف المعقدة، لاكتشاف التعديلات بعد متعدية على مفارز معقدة، وتحديد مكونات معقدة تنظيمية جديدة من خلال قياس الطيف الكتلي. والجدير بالذكر، يمكن تطبيق هذه الطريقة التونسية لدراسة المجمعات البروتين يتكون من مكونات حقيقية النواة أو المسببة للأمراض (الفيروسية والبكتيرية)، وبالتالي مما أسفر عن مجموعة واسعة من الفرص التجريبية المصب. نقترح أن الباحثين العاملين مع المجمعات البروتين يمكن الاستفادة من هذا النهج في العديد من الطرق المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الحاسمة لتنظيم دقيق من العمليات البيولوجية 1، وإجراء المزيد من الدراسات حول هذه مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تبلغ عن وظيفتها 2. وقد وضعت عدة نهج لدراسة وتوصيف مثبطات مضخة البروتون وكذلك لدي نوفو تحديد مكونات البروتين التنظيمية الجديدة. في عام 1989، ذكرت ستانلي فيلدز وزملاؤه الخميرة اثنين الهجين (Y2H) فحص 3. يسمح هذا النهج لتحديد متحيز وشامل للinteractors (يفترس) لبروتين محددة من الفائدة (الطعم) في خميرة الخباز. وبالإضافة إلى فائدة ملحوظة من أجل اكتشاف مثبطات مضخة البروتون، وفحص Y2H يمكن استخدامها لوصف أزواج البروتين في خلايا الخميرة، وتحديد مجالات التفاعل الحد الأدنى، وتحديد الطفرات التي إلغاء مثل هذه التفاعلات. عن طريق تعديل فحص Y2H، مثبطات مضخة البروتون يمكن أيضا أن تدرس في خلايا الثديياتالطبقة = "XREF"> 4. ويمكن أيضا أن الاختلافات في فحص Y2H (على سبيل المثال، نظام الخميرة ثلاثة الهجين) يتم تطبيقها على دراسة البروتين RNA والتفاعلات يجند العضوية-بروتين صغير في الخلايا.

أداة أخرى تستخدم عادة لدراسة مثبطات مضخة البروتون في نظام مثلي هي شارك في مناعي (شارك في IP) فحص 5. باستخدام أجسام مضادة لبروتين immunoprecipitate من الفائدة، وفحص المشارك IP يسمح للباحثين لمراقبة مثبطات مضخة البروتون في الخلايا للظروف البيئية المختلفة والحالات التجريبية. استخدام البروتينات الموسومة حاتمة (على سبيل المثال، FLAG، Myc على، بكتيريا، وHA، من بين أمور أخرى) في تنقية تقارب (ا ف ب) طرق سهلت عزل البروتينات من خليط من البروتين المعقدة لعدة فحوصات المصب، بما في ذلك وصمة عار الغربية، وصمة عار الفضة ، وتحليل الأنزيمي. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الطرق السابقة يمكن عزل كميات كبيرة من البروتين المجمعات لمزيد من التوصيف بما في ذلك في المختبر لssays، اكتشاف مفارز التنظيمية التي الطيف الكتلي، وتحديد التعديلات بعد متعدية. ويطلق نسخة محسنة من طريقة AP جنبا إلى جنب AP (وات)، وهي تقنية تنقية لدراسة مثبطات مضخة البروتون عن طريق إنشاء بروتين الانصهار مع اثنين من الحواتم التي يتم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول لاحقة 6 و 7. في هذه المقالة، نقدم الاختلاف في طريقة التونسية للمجمعات البروتين تنقية الذي يتم وضع علامة على وحدتين فرعيتين مع الحواتم مختلفة ثم تنقيته من خلال اثنين من نقاط وصول متسلسلة (بكتيريا AP تليها FLAG IP). علينا أولا تقديم لمحة أضيق الحدود من TAP (الشكل 1)، ثم وصفا مفصلا لجميع الخطوات التجريبية (الشكل 2)، بحيث يمكن للباحثين تطبيقها على بروتين معقد اهتمامهم.

للتدليل على تطبيق هذه الطريقة التونسية، اخترنا جيدا اتسم السيكلين-معلمين المعقدة (ويشار إلى PTكيناز EFB)، التي تتألف من السيكلين T1 فرعية التنظيمية (CycT1) وكيناز (CDK9)، ويشارك في تنظيم النسخ التي كتبها RNA بوليميريز الثاني (بول الثاني) 8 و 9 و 10. ف TEFb phosphorylates المجال سي محطة للبول الثاني وما يرتبط بها من عوامل لها استطالة السلبية، والذي يخفف التوقف النسخي في المروج، وبالتالي يسهل النسخ استطالة 11 و 12 و 13. مع هذا التفاعل المعروف في الاعتبار، بكتيريا الموسومة CycT1 وكانت CDK9 الموسومة FLAG خلال أعرب في الخلايا HEK293T. تم إجراء التجربة التونسية متبادلة مع CDK9 الموسومة بكتيريا والموسومة FLAG CycT1 لمزيد من التحقق من أن التفاعل البروتين مستقلة عن الحواتم المستخدمة. وقد تم جمع الخلايا و lysed 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تمت تنقية المحللة للذوبان التي كتبها TAP (بكتيريا AP تليها FLAGIP). وقد تم تحليل المدخلات وتنقية البروتينات لطخة الغربية وصمة عار الفضة (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلايا التصفيحات

  1. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، لوحة 3.5 × 10 6 خلايا HEK293T في 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ (ت / ت) البنسلين / الستربتوميسين (/ الأسهم مل 10،000 U) في صحن 100 ملم. لوحة 3-5 100 ملم أطباق في التجربة / حالة لضمان الانتعاش ما يكفي من البروتين.
    ملاحظة: عدد من لوحات لابد من تحديدها لكل تجربة / حالة، والتي سوف تعتمد على مستويات التعبير والذوبان في مجمع البروتين من الفائدة. بدلا من ذلك، إذا كانت هناك حاجة لتنقية نطاق أوسع، خطوط الخلايا يمكن تكييفها لتنمو في تعليق في قوارير الدوار 2، ولكن هذه الطريقة لا تعمل لتعداء عابر.

2. Transfecting خلايا أو التسبب خطوط الخلية مستقرة

  1. في اليوم التالي، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. يجب أن تكون خلايا 70-80٪ متموجة قبل صناعة تجeding.
  2. Transfect الخلايا مع خليط مجموع 7 ميكروغرام من البلازميد و 21 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في صحن 100 ملم. خلايا Transfect مع ناقلات معربا عن GFP (الجدول 1) وجهاز تحكم عن كفاءة ترنسفكأيشن.
    ملاحظة: إذا باستخدام HEK293-T-REX أو خط الخلية مستقرة مشابه الحث على التعبير من اثنين أو أكثر تعقيدا مفارز ردا على الدوكسيسيكلين 14، 15، ومحفز يجب أن تضاف إلى الخلايا والمحتضنة لمدة 48 ساعة. وبالمثل، خط خلية مستقر الحث على التعبير عن GFP على إضافة محفز ستكون هناك حاجة أيضا لأغراض التحقق من الصحة. انتقل إلى الخطوة 2.7.
  3. إعداد خليط ترنسفكأيشن في صحن 100 ملم. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، مزيج 500 ميكرولتر من DMEM unsupplemented مع 7 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد (المقابلة لاثنين أو أكثر من البلازميدات). في أنبوب microcentrifuge منفصل، مزيج 500 ميكرولتر من unsupplemented واي DMEMال 21 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن. كرر لكل رد فعل ترنسفكأيشن.
  4. ماصة الحل ترنسفكأيشن الكاشف في حل DNA البلازميد (لا تخلط بين الحلول بالترتيب العكسي). مزيج من قبل pipetting 4 مرات على الأقل.
  5. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة ل10-15 دقيقة، ولكن لم يعد من 15 دقيقة.
  6. إمالة لوحة لإنشاء خزان سائل الإعلام وبعناية ماصة الخليط ترنسفكأيشن قطرة من الحكمة على الجانب الداخلي من لوحة من دون إزعاج الخلايا. إعادة الإناء لموقفها ثابت الأصلي ودوامة بلطف لتوزيع الخليط.
  7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة خلية ترطيب مع 5٪ CO 2 (ويشار إلى هذه الحالة فيما يلي باسم "نسيج الثقافة الحاضنة"). استبدال وسائل الإعلام 5 ساعة بعد ترنسفكأيشن (اختياري).

3. ترنسفكأيشن فحص أو الحث الكفاءة

  1. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تصور الخلايا تحت انفلونزاالمجهر orescent للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن (أو تحريض السيطرة HEK293T-REX خط الخلية مستقرة التعبير عن GFP). احتضان لمدة 24 ساعة أخرى.

4. بكتيريا الانجذاب تنقية (بكتيريا ا ف ب)

  1. جمع الخلايا
    1. في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام وإضافة 8 مل من المياه المالحة الفوسفات-1X الباردة (PBS). ماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا من لوحة.
    2. جمع ونقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وتدور الخلايا في أسفل 800 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية.
    3. إزالة طاف برنامج تلفزيوني. كرر تدور أسفل (800 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية) للقضاء على أي برنامج تلفزيوني المتبقية. تخزين بيليه خلية في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل أو اتبع الإجراء أدناه لمواصلة تنقية البروتين.
  2. الناشر الخلايا
    1. Resuspend والكريات الخلايا باستخدام 5 × حجم الخلية بيليه (~ 250 ميكرولتر لكل لوحة) من السلبي الاحتياطي تحلل(PLB: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم DTT، مثبط البروتياز كوكتيل لوحي، 5٪ ت / الجلسرين الخامس، و 1.0٪ NP-40) ونقل تعليق خلية ل 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
    2. لفترة وجيزة دوامة تعليق وnutate لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. تدور باستمرار تعليق خلية في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. نقل لست] القابلة للذوبان في أنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل وتجاهل الكريات الخلية. وفر 10٪ من الحجم النهائي للالمحللة للذوبان باسم "بكتيريا ا ف ب الإدخال". تخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. توازنه حبات بكتيريا
    ملاحظة: الخرز استخدام بكتيريا للخطوة AP الأولى! سحبت مجمعات أسفل مع حبات بكتيريا استرداد أكبر بكثير من البروتين من تلك التي سحبت إلى أسفل مع حبات FLAG.
    1. إخراج (ن × 40 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من 50٪ بكتيريا حبة الطين (ن = عدد العينات) وتدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدم على نطاق منصائح outhed إلى الخرز ماصة.
    2. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من PLB إلى الخرز. Nutate الخليط حبات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      1. تكرار لما مجموعه 3 يغسل. resuspend والخرز في PLB إلى الحجم النهائي من ن × 40 ميكرولتر.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من 50٪ بكتيريا حبة الطين لكل عينة الخلايا المحللة وnutate لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  4. بكتيريا AP
    1. تدور باستمرار الحل في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 ج.
    2. إزالة طاف ومخزن باسم "بكتيريا AP التدفق من خلال (FT)" في 4 درجات مئوية.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من بكتيريا AP الاحتياطي اغسل الأول (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 250 مم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي MgCl 2، 1 ملم DTT، 5٪ الجلسرين و 0.2٪ NP-40) إلى الخرز. Nutate الخليط حبات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
      1. تكرار لما مجموعه 4 يغسل.
        ملاحظة: قبل غسل الرابع، ونقل الحل الخرز لأنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل للحد من خلفية البروتين. هذه الخطوة ضرورية.
    4. إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة الثاني (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1 ملي EDTA) وتتوازن حبات من قلب الأنابيب. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
    5. أزل البروتين في المصالح مع 50 ميكرولتر من بكتيريا شطف العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 2.5 ملي Desthiobiotin). دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. تدور باستمرار حبات في 1500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف. هذا جزء يتوافق مع عينة "بكتيريا AP شطف".
    7. حفظ جزء حبات عند 4 درجة مئوية لمدة شطف الثاني، والتي يمكن أن تسفر عن ما يصل الى نصف كمية البروتين التي تم الحصول عليها مع شطف الأول. قسامة 10٪ من بكتيريا AP شطف لتلطيخ الفضة و / أو النشاف الغربي16.
  5. توازنه حبات FLAG
    1. إخراج (NX 16 ميكرولتر) + ن ميكرولتر من FLAG الخرز حل (ن = عدد العينات) وتدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدام نصائح واسعة الفم إلى الخرز ماصة.
    2. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة FLAG (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.1٪ NP-40) إلى الخرز. تدور باستمرار في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار لما مجموعه 3 يغسل.
    3. resuspend والخرز في غسل العازلة FLAG إلى الحجم النهائي من NX 16 ميكرولتر.
    4. إضافة 16 ميكرولتر من الطين FLAG حبة لشطف بكتيريا AP المتبقية وبين عشية وضحاها nutate في 4 درجات مئوية.

5. FLAG IP

  1. تدور باستمرار تعليق الخرز FLAG في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. حفظ طاف ومخزن باسم "FLAG IP تدفق من خلال" (FT) في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 50081؛ ل من غسل العازلة FLAG إلى الحل. Nutate لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار لما مجموعه 4 يغسل وإزالة طاف بعد كل غسل.
    ملاحظة: قبل غسل الرابع، ونقل حل الخرز البروتين لأنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل للحد من الخلفية. هذه الخطوة ضرورية.
  3. إزالة طاف من زيادة ونقصان النهائي وإضافة 30 ميكرولتر من غسل العازلة FLAG تحتوي على 200 نانوغرام / ميكرولتر من الببتيد FLAG في الخرز. دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  4. تدور باستمرار تعليق في 1500 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. حصاد طاف وتخزينها في 4 درجات مئوية باسم "FLAG IP شطف."
    ملاحظة: يمكن التأكد من العينات شطف بواسطة وصمة عار الفضة و / أو لطخة غربية باستخدام البروتوكولات القياسية 16، ونحن على استعداد لمزيد من المقايسات البروتين. عند إعداد وصمة عار الغربية، تشغيل جميع العينات التالية: (1) بكتيريا ا ف ب الإدخال، (2) بكتيريا ا ف ب FT، (3) بكتيريا AP Elutiعلى، (4) FLAG IP FT، و (5) FLAG IP شطف. فإن حجم تحميل يجب أن يحدد لكل تجربة. جميع العينات التي تم جمعها والخرز يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير وفي -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ويمكن تحليل عينات التونسية التي كتبها الطيف الكتلي للتحقق من هوية من مكوناتها، وتحديد رواية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، و / أو لاكتشاف أي تفاعل البروتين الرواية مع مجمع النقي 2 و 17. لهذا الغرض، بعد تشغيل هلام coomassie أو الفضة وصمة عار، والعصابات يمكن رفعه من الجل باستخدام مشرط نظيفة. العديد من الاستعراضات الممتازة التي مناقشة أساليب مطياف الكتلة نشرت سابقا 18 و 19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة التونسية للتميز جيدا CycT1-CDK9 معقدة (المعروف أيضا باسم P-TEFb كيناز).

البلازميدات ترميز السيكلين T1-بكتيريا (CycT1: S) وCDK9-FLAG (CDK9: F)، أو CDK9-بكتيريا (CDK9: S) والسيكلين T1-FLAG (CycT1: F) (الجدول 1)، و transfected في الخلايا HEK293T . وتضمنت الضوابط السلبية تعداء مع ناقلات فارغة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول صفها هنا للتعبير عن وعزل بروتين المجمعات من الخلايا حقيقية النواة لا يقتصر على توصيف البيوكيميائية مثل هذه التجمعات الجزيئية، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد interactors الجديدة والتعديلات بعد متعدية التي يمكن أن تنظم وظيفتها. لا يقتصر استخدام علامات التقارب إلى ما ورد في هذا البروتوكول. ولكن تجربتنا تشير إلى أن استخدام بكتيريا كخطوة AP الأولى تعزز بشكل كبير من العائد من مجمع البروتين البروتين النهائي. كلا الخطوات الملزمة وشطف من وإلى حبات بكتيريا هي فعالة للغاية مقارنة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01AI114362 ومنحة مؤسسة ويلش I-1782 إلى Iván D'Orso.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GEHealthcare Life Sciences / HycloneSH3002.2FS
مصل الأبقار الجنينيGE Healthcare Life Sciences / HycloneSH30071
Penicillin / StreptomycinMP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
كوكتيل مثبط البروتياز Roche 11836153001
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag شطف المخزن المؤقتIBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichF2426
Corning 100 مم & 20 مم نمط ثقافة خلايا الطبق المعالجة البوليسترين غير الحراري 20 / كمCorning 430167
بروتين Lo-Bind EppendorfEppendorf022431081
خلاط دوامة رقميFisher Scientific   ؛02-215-370
48 حفرة الرف رغوة الأنبوب الصغيرفيشر Scientific02-215-386
Labquake شاكر المشواة  Thermo هاتف: 415110

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
  2. Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
  3. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  4. Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system. Biotechniques. 22, 350-352 (1997).
  5. Lee, C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  7. Jager, S., et al. Purification and characterization of HIV-human protein complexes. Methods. 53, 13-19 (2011).
  8. Price, D. H. P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).
  9. Peterlin, B. M., Price, D. H. Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Mol Cell. 23, 297-305 (2006).
  10. McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation. Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).
  11. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).
  12. D'Orso, I. 7SKiing on chromatin: move globally, act locally. RNA Biol. 13, 545-553 (2016).
  13. McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause. Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).
  14. Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).
  15. McNamara, R. P., et al. KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II. Mol Cell. 61, 39-53 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  17. Trudgian, D. C., et al. Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline. Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).
  18. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).
  19. Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. Mass spectrometry-based proteomics and network biology. Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).
  20. Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 234, 364-368 (1986).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tandem Affinity PurificationProtein Complex IsolationSTREP FLAG TaggingEukaryotic Cell LysisAffinity ChromatographyImmunoprecipitation TechniqueProtein Complex AnalysisPost translational Modification DetectionNovel Subunit IdentificationMass Spectrometry Application

مقالات ذات صلة