مقالة منهجية

MitoCeption: نقل معزولة الإنسان MSC الميتوكوندريا إلى خلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

DOI:

10.3791/55245

⸱

فبراير 22, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يقدم بروتوكول (MitoCeption) لنقل الميتوكوندريا، معزولة عن الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (MSC)، إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSC)، بهدف دراسة التأثيرات البيولوجية على GSC الأيض ووظائف. ويمكن تكييف بروتوكول مماثل لنقل الميتوكوندريا بين أنواع الخلايا الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا تلعب دورا محوريا لاستقلاب الخلية، وإنتاج الطاقة والسيطرة على موت الخلايا المبرمج. وقد تم العثور على وظيفة الميتوكوندريا عدم كفاية مسؤولة عن أمراض متنوعة جدا، بدءا من الأمراض العصبية والسرطان. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت الميتوكوندريا مؤخرا لعرض القدرات على أن يتم تحويلها بين أنواع الخلايا، وخاصة من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (MSC) إلى الخلايا السرطانية في ظروف coculture، مع عواقب والتمثيل الغذائي والوظيفية للخلايا الميتوكوندريا المتلقي، ومواصلة تعزيز الاهتمام الحالي لالخصائص البيولوجية لهذه العضيات.

تقييم الآثار المترتبة على الميتوكوندريا MSC المنقولة في الخلايا المستهدفة هي من الأهمية بمكان لفهم نتائج البيولوجية لهذه التفاعلات خلية خلية. بروتوكول MitoCeption الموصوفة هنا يسمح بنقل الميتوكوندريا المعزولة مسبقا من الخلايا المانحة إلى الخلايا المستهدفة، وذلك باستخدام MSC الميتوكوندرياوالخلايا الجذعية ورم أرومي (GSC) كنظام نموذج. وقد سبق استخدام هذا البروتوكول لنقل الميتوكوندريا، معزولة عن اللجان الدائمة، لمتمسكا الخلايا السرطانية MDA-MB-231. ويتم تكييف هذا البروتوكول نقل الميتوكوندريا هنا لGSCs التي تقدم خصوصية محددة من تنامي كما neurospheres في المختبر. نقل الميتوكوندريا المعزولة يمكن اتباعها من قبل مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) والتصوير متحد البؤر باستخدام الميتوكوندريا الأصباغ الحيوية. استخدام الميتوكوندريا المانحة والهدف الخلايا مع النسخ المتنوعة مميزة (النيوكلوتايد) كما يتيح الكشف عن الميتوكوندريا نقل على أساس تركيز الحمض النووي التعميم الخاصة بهم (و mtDNA) في الخلايا المستهدفة. مرة واحدة وقد تم التحقق من صحة بروتوكول مع هذه المعايير، فإن خلايا إيواء الميتوكوندريا نقل يمكن تحليلها لتحديد الآثار المترتبة على الميتوكوندريا الخارجية على الخصائص البيولوجية مثل استقلاب الخلية، والمطاوعة، وانتشار واستجابة للعلاج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات توجد في الخلايا حقيقية النواة حيث أنها تلعب دورا رئيسيا في امتصاص المواد الغذائية وكذلك في إنتاج الطاقة والأيض. هذه العضيات تحتوي على الحمض النووي دائرية (و mtDNA)، 16.6 كيلوبايت طويل، الذي يشفر البروتينات المجمعات سلسلة نقل الإلكترون، tRNAs وrRNAs 1. وظيفة هذه العضيات هو أمر حاسم لارتبطت توازن الخلايا والعديد من الأمراض مع الميتوكوندريا اختلال وظيفي 1، 2، 3. وعلى سبيل المثال تم ربط مركز الميتوكوندريا إلى التهاب والأمراض المعدية والسرطان، في هذه الحالة الأخيرة مع عواقب للورم خبيث ومقاومة للعلاج 4، 5، 6، 7.

الميتوكوندريا عرض القدرة اللافتة ل الحصول على نقلها بين "المانحة" وخلايا "الهدف". وهذا يؤدي إلى تغييرات في عملية الأيض نشطة من الخلايا المستهدفة وكذلك في التعديلات الفنية الأخرى مثل إصلاح الأنسجة ومقاومة للعوامل العلاج الكيميائي، كما هو مبين في الآونة الأخيرة من قبل مختلف المختبرات 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15 16. الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) تعرض هذه القدرة على نقل الميتوكوندريا إلى مجموعة واسعة من الخلايا المستهدفة، بما في ذلك العضلية، والخلايا البطانية، الرئوية الخلايا الظهارية السنخية، والخلايا أنبوبي كلوي والخلايا السرطانية، مما أدى إلى إدخال تعديلات على الخصائص الوظيفية لهذه الخلايا 8،> 9، 10، 12، 17، 18.

يبدو الصرف الميتوكوندريا الآن كآلية المستخدمة على نطاق واسع أن تسمح لعدد من أنواع مختلفة من الخلايا على التواصل مع بعضها البعض، وتعديل خصائصها البيولوجية. يمكن أن يحدث هذا التبادل الميتوكوندريا من خلال نفق الأنابيب النانوية (تي ان تي) تشكيل، التي تنطوي على connexin 43 التي تحتوي على تقاطعات الفجوة 8 أو M-ثانية / TNFaip2 وexocyst المعقدة 19. بدلا من ذلك، تم عرض نقل الميتوكوندريا أيضا أن بوساطة arrestin microvesicles التي تحتوي على نطاق البروتين 1 بوساطة (ARMMs) 20. ومن المثير للاهتمام، وارتبط فعالية نقل الميتوكوندريا إلى معدل تعبير عن رو GTPase 1 MIRO1 21، عاملا رئيسيا لتفسير الاختلافات في كفاءات نقل الميتوكوندريا بين iPSC-اللجان الدائمة والكبار BM-اللجان الدائمة 22.

وعلى الرغم من هذه الثروة من البيانات المتعلقة الصرف الميتوكوندريا خلية إلى خلية، لا يعرف إلا القليل نسبيا عن التمثيل الغذائي ونتائج البيولوجية لهذا النقل الميتوكوندريا. وبالتالي، فإنه يستحق تماما وضع الأدوات المناسبة لإجراء تقييم كامل للآثار البيولوجية من هذا النقل. على مر السنين، العديد من الطرق التقنية لنقل الميتوكوندريا من الجهات المانحة للخلايا متقبل وقد اقترحت. وهذا يشمل الحقن المباشر للالميتوكوندريا في البويضات 23، 24، 25، انصهار الخلية لتوليد cybrids transmitochondrial 26، 27 ومؤخرا، نقل الميتوكوندريا المعزولة باستخدام ضوئي؛ ضوحراري nanoblades 28.

نحن وآخرون أظهرت سابقا قدرة mitochond معزولةريا على أن يكون داخليا من قبل الخلايا الحية، كما لوحظ على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 29، 30، 31، من خلال الآليات المقترحة لإشراك macropinocytosis 32. نحن تطويرها وسيلة، ودعا MitoCeption، لنقل الكمية الميتوكوندريا المعزولة (من اللجان الدائمة) لاستهداف الخلايا، كما يتضح مع (ملتصقة) MDA-MB-231 سرطان الثدي خط الخلية 31. وقد تم تكييف هذا البروتوكول هنا لنقل معزولة الميتوكوندريا MSC الإنسان إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSCs).

ورم أرومي والأورام الخبيثة العدوانية من الدماغ الذي أصبح سريعا مقاومة للعلاج، ويرجع ذلك أساسا إلى خلايا ورم أرومي الجذعية (GSC) الموجودة داخل الورم 33. تنمو هذه GSCs كما neurospheres في المختبر، وتوليد أورام في نماذج طعم أجنبي. الخلايا السرطانية داخل ورم أرومي لديهاالقدرة على إجراء اتصالات خلية إلى خلية، كما هو مبين في الآونة الأخيرة لخلايا نجمي ورم في المخ المتصلة بعضها ببعض عبر microtubes الموسعة، التي من خلالها الميتوكوندريا (وكذلك الكالسيوم وخلية نوى) يمكن أن تهاجر، مما أدى إلى شبكات نجمي مقاومة للعلاج بالأشعة 34. ورم أرومي يمكن تجنيد العديد من الخلايا المختلفة داخل المكروية ورم، بما في ذلك اللجان الدائمة 35 و 36. أظهرنا أن اللجان الدائمة يمكن إجراء اتصالات خلية خلية مع GSCs في coculture ونقل الميتوكوندريا الخاصة بهم (لا تظهر البيانات)، التي من المتوقع أن تعديل الخصائص الفنية GSC. يصف هذا البروتوكول كيف تقنية MitoCeption يمكن استخدامها لنقل الميتوكوندريا، قبل معزول من اللجان الدائمة الإنسان، إلى GSCs البشرية بهدف تحديد نتائج البيولوجية الوظيفية. تم استخدام متعدد القدرات ومكون للأورام للغاية خط Gb4 GSC 37 في هذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اليوم 1

1. وصفها من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) الميتوكوندريا (اختياري)

  1. قبل يومين من إعداد الميتوكوندريا، البذور اللجان الدائمة الإنسان في طبق ثقافة 100 ملم، في 10 مل αMEM / FBS 10٪، وذلك ليكون 4 × 10 5 اللجان الدائمة في الثقافة يوم 1.
  2. شطف اللجان الدائمة مع برنامج تلفزيوني (4 مل)، وإضافة 4 مل αMEM / FBS 1٪ (prewarmed إلى 37 درجة مئوية).
  3. إضافة المبلغ المطلوب من الميتوكوندريا صبغ حيوي واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  4. إزالة حل الميتوكوندريا صبغ، وشطف الخلايا مرتين مع 4 مل prewarmed (37 ° C) αMEM / FBS 1٪ وإضافة إلى الوراء 4 مل αMEM / FBS 10٪. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  5. تغيير مستنبت (10 مل αMEM / FBS 10٪) بعد 30 دقيقة، ومرة ​​أخرى في وقت لاحق 2 ساعة.

اليوم 1

2. وصفها من خلايا ورم أرومي دبقي الجذعية (GSC) (اختياري، انظر القسم مناقشة)

خلية ثقافة المتوسط تكوين
GSC المتوسطة القاعدية DMEM / F-12 تستكمل مع
الأنسولين 20 ملغ / مل
N2 1X ملحق
الجلوكوز 3 ز / L
L-الجلوتامين 2 مم
GSC المتوسطة الانتشار إضافة إلى الوسط القاعدي:
B27 1X ملحق
EGF 10 نانوغرام / مل
bFGF 10 نانوغرام / مل
Fungine 10 ملغ / مل
Fungizone 0.25 ملغ / مل
الهيبارين 2 ملغ / مل
سيبروفلوكساسين 2 ميكروغرام / مل
جنتاميسين 2 ميكروغرام / مل
MSC المتوسطة الانتشار & #تستكمل MEM مع، 945
L-الجلوتامين 2 مم
10٪ FBS
bFGF 2 نانوغرام / مل
r.within الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">

الجدول 1: الثقافة وسائل الإعلام.

  1. فصل GSCs (Gb4 خط الخلية 32 (10 × 10 6 خلايا) كما نمت neurospheres على بولي HEMA قوارير زراعة الخلايا المغلفة (انظر الخطوات 3،1 حتي 3،12).
  2. GSCs البذور في لوحة 48-جيدا في 10 5 خلايا جيدا / في GSC المتوسطة الانتشار (500 ميكرولتر) (انظر الجدول 1).
  3. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  4. إضافة العدد المطلوب من الخلايا الصبغة الحيوي واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من GSC المتوسطة القاعدية (الجدول 1) لكل بئر من لوحة 48-جيدا.
  6. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 270 x ج عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
  7. كرر الخطوات من 2،5-2،6.
  8. إضافة 500 ميكرولتر من GSC المتوسطة القاعدية واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  9. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 270 x ج عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
  10. إضافة 500 ميكرولتر من GSC المتوسطة الانتشار في بئر من لوحة 48-جيدا واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: مقدار GSCs أشار (10 × 10 6 خلايا) يسمح أداء مختلف التجارب الاستجابة للجرعة والضوابط نظام مراقبة الأصول الميدانية. مرة واحدة يتم تحديد الظروف التجريبية أكثر دقة هذا المبلغ يمكن زيادتها إلى أسفل.

يوم 2

3. البذر من الخلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

  1. جمع neurospheres GSC (10 × 10 6 خلايا) بواسطة الطرد المركزي في 270 x ج لمدة 5 دقائق، عند 20 درجة مئوية في أنبوب 50 مل.
  2. غسل الخلايا مع 5 مل من HBSS، وأجهزة الطرد المركزي في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  3. نضح طاف.
  4. resuspend بلطف بيليه GSC في 100 ميكرولتر التربسين-EDTA (0.25٪) (في 10 × 10 6 خلايا)
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  6. إضافة 10 ميكرولتر CaCl 2 (20 ملم) و 2 ميكرولتر الدناز الأول (10 ملغ / مل).
  7. تنأى neurospheres قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (30-50x) مع ماصة P200. تجنب الفقاعات. الاختيار تحت المجهر التي يتم فصلها عن GSCs.
  8. إضافة 10 مثبط التربسين ميكرولتر (5٪) و 10 مل HBSS.
  9. GSCs أجهزة الطرد المركزي في 270 x ج لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  10. تجاهل طاف وإضافة 10 مل GSC المتوسطة القاعدية (الجدول 1).
  11. عدد GSCs مع عد غرفة توما ثم الطرد المركزي الخلايا في 270 x ج لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  12. إضافة حجم مناسب من GSC المتوسطة الانتشار (الجدول 1) للوصول إلى تركيز الخلوية من 10 6 GSCs / مل.
  13. البذور 10 5 GSCs (100 ميكرولتر من تعليق خلية) لكل بئر من لوحة 96-جيدا.
  14. أجهزة الطرد المركزي لوحات في 270 x ج لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية للحصول على GSCs في بوتتوم الآبار.
  15. احتضان لوحة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية حتى القسم 5.

يوم 2

4. MSC الميتوكوندريا العزلة

  1. ضبط درجة الحرارة microtube أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  2. إعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب "A" و "C" الذي يحتوي على الكواشف لاستخراج الميتوكوندريا (200 ميكرولتر كاشف وو 400 ميكرولتر كاشف C، سواء التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA). إعداد 2 أنابيب أخرى، وصفت "MSC" و "ميتو". منع جميع أنابيب على الجليد. أيضا إعداد أنابيب للالتخفيفات المسلسل الميتوكوندريا.
  3. غسل اللجان الدائمة مع 10 مل prewarmed (37 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني.
  4. غسل اللجان الدائمة مع 2 مل التربسين (لا EDTA) لمدة 10 ثانية، وإضافة 1 مل التربسين (لا EDTA). احتضان الخلايا لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. استرداد اللجان الدائمة وذلك بإضافة 10 مل αMEM / FBS 10٪، ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  6. خلايا الطرد المركزي في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  7. تجاهل طاف وإضافة10 مل αMEM / FBS 10٪ لبيليه الخلية.
  8. عد اللجان الدائمة مع عد غرفة مالاسيه.
  9. الطرد المركزي اللجان الدائمة (4-5 × 10 5) في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  10. تجاهل طاف، إضافة 1 م المثلج αMEM / FBS 10٪ لبيليه الخلية ونقل الخلايا إلى "MSC" أنبوب -labeled (المعد في خطوة 4.2). الحفاظ على أنبوب على الجليد.
  11. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على اللجان الدائمة في 900 x ج لمدة 5 دقائق، في 4 درجات مئوية.
  12. إزالة كافة المتوسطة المتبقي من الأنبوب.
  13. إضافة 200 ميكرولتر من الميتوكوندريا عزل الكاشف ألف (التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA). دوامة على سرعة متوسطة لمدة 5 ثوانى وترك أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة بالضبط.
  14. إضافة 2.5 ميكرولتر من الميتوكوندريا عزل الكاشف ب دوامة في أقصى سرعة لمدة 10 ثانية، ثم ترك أنابيب على الجليد. كرر كل 30 ثانية لمدة 5 دقائق.
  15. إضافة 200 ميكرولتر من الميتوكوندريا عزل الكاشف C (التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA). مزيج من قبل إمالة أنبوب (ريال عمانيughly 30 مرة، لا الدوامة). أنبوب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  16. نقل طاف (التي تحتوي على الميتوكوندريا MSC) إلى "ميتو" أنبوب (المعد في خطوة 4.2).
  17. أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج، 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، للحصول على بيليه الميتوكوندريا. تجاهل طاف. بيليه يحتوي على الميتوكوندريا المعزولة.
  18. شطف بيليه الميتوكوندريا مع 200 ميكرولتر من الكاشف جيم ثم الطرد المركزي في 12000 x ج، 5 دقائق في 4 درجات مئوية، للحصول على بيليه الميتوكوندريا.

5. نقل المعزولة MSC الميتوكوندريا إلى GSCs (MitoCeption)

  1. إضافة 200 ميكرولتر من (0 درجة مئوية) GSC المتوسطة تبرد قبل انتشار لبيليه الميتوكوندريا المعزولة من اللجان الدائمة (4 × 10 5).
  2. تمييع إعداد الميتوكوندريا (في وسط انتشار GSC) لإضافة باستمرار 20 ميكرولتر من تعليق الميتوكوندريا إلى GSCs.
  3. إضافة حجم الميتوكوندريا المعزولة في الآبار للث 96لوحة الذراع التي تحتوي على GSCs (من الخطوة 3.15)، في التركيز المطلوب (0،1 حتي 10 ميكروغرام). إضافة الميتوكوندريا ببطء، على مقربة من قاع البئر، وتغطي كامل السطح مرة واحدة على الأقل.
  4. للسيطرة على MSC الميتوكوندريا صبغ حيوي تسرب، إضافة نفس كميات من إعداد الميتوكوندريا (0.1 إلى 10 ميكروغرام) إلى آبار لوحة 96 كذلك يحتوي GSC انتشار المتوسطة فقط (لا GSCs) (انظر الجزء 6.2 للكشف عن تسرب الصبغة الحيوي).
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 كذلك يحتوي على GSCs الميتوكوندريا المتلقي مع الميتوكوندريا MSC (الخطوة 5.3) ولوحة التحكم (خطوة 5.4) في 1500 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. وضع لوحات الثقافة في 37 ° C خلية حاضنة مباشرة بعد الطرد المركزي.
    ملاحظة: يعتمد بروتوكول نقل الميتوكوندريا على الطرد المركزي لتعليق الميتوكوندريا في الخلايا المستزرعة في قوة الطرد المركزي كافية، مع عدد من centrifugations التي يمكن تعديلها تبعا لنظم الم الميتوكوندريا الخلايا المانحة / المتلقي.

يوم 3

6. تحليل نقل الميتوكوندريا من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية ومتحد البؤر التصوير

  1. إعداد عينات GSC لتحليل FACS
    ملاحظة: إذا وصفت الميتوكوندريا MSC مع صبغة حيوي مسبقا (القسم 1)، ويمكن رصد الكفاءة من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية، 24 ساعة بعد نقل الميتوكوندريا.
    1. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا مع GSCs MitoCepted في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
    2. تجاهل طاف.
    3. إضافة 100 ميكرولتر التربسين (لا EDTA) في كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. الماصة صعودا وهبوطا لتنأى neurospheres شكلت في فترة زمنية 24 ساعة.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من GSC المتوسطة القاعدية.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 270 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية، وتجاهل طاف.
    6. و resuspend GSCs في 300 GSC ميكرولتر المتوسطة القاعدية ونقل إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية تكييف الأنابيب.
    7. أداء لنظام مراقبة الأصول الميدانيةalysis.
  2. السيطرة على تسرب الميتوكوندريا صبغ حيوي من الميتوكوندريا المعزولة (FACS)
    ملاحظة: إن الغرض من هذه الخطوة هو تحديد إشارة FACS الخلفية التي لن تعكس نقل MSC الميتوكوندريا حقيقية، ولكن بدلا من ذلك، فإن مجرد تسرب الصبغة الحيوي من الميتوكوندريا MSC المسمى تستخدم لMitoCeption (الخطوة 5.3).
    1. البذور خلايا GSC كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،15.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا تحتوي على الميتوكوندريا فقط (من الخطوة 5،4-5،6) في 1500 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية.
    4. نضح مستنبت من GSC 96-جيدا لوحة (الخطوة 6.2.2) والاستعاضة عنها المتوسطة حضنت مع الميتوكوندريا فقط (طاف من الخطوة 6.2.3).
    5. احتضان لوحة 96-جيدا تحتوي على GSCs عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    6. المضي قدما كما هو الحال في الخطوات 6.1.1 إلى 6.1.7 لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  3. إعداد GSC عصيدةليه التصوير متحد البؤر
    ملاحظة: إذا كان نقل MSC الميتوكوندريا إلى GSCs هو أن يتم تحليلها بواسطة التصوير مضان، سواء اللجان الدائمة وGSCs تحتاج إلى تصنيفها مسبقا، على التوالي مع الميتوكوندريا (الخطوة 1) وخلية (الخطوة 2) الأصباغ الحيوية.
    1. إعداد GSCs كما في الخطوات 6.1.1 إلى 6.1.5.
    2. و resuspend GSCs في 2 مل GSC المتوسطة الانتشار التي تحتوي على 2٪ FBS والبذور في أطباق ثقافة 35 ملم (أسفل الزجاج).
    3. أداء التصوير متحد البؤر على GSCs مع نقل الميتوكوندريا MSC الفلورسنت بعد 24 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر الخطوات الإجرائية تحدد عزل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) ونقلها إلى الخلايا الجذعية ورم أرومي المستهدفة (GSC) من خلال MitoCeption في الشكل 1. GSCs هي الخلايا الجذعية السرطانية كما نمت neurospheres للحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية الخاصة بهم. للبروتوكول، والمصنف GSCs كما الخلايا وحيدة بضع ساعات قبل نقل الميتوكوندريا (الخطوة 3) للسماح أعلى كفاءة نقل الميتوكوندريا (انظر بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر عددا متزايدا من الدراسات أن الخلايا يمكن تبادل الميتوكوندريا وأن هذه الميتوكوندريا يكون لها آثار عميقة على استقلاب الخلية المستهدفة وظائف. لذلك، لا بد من السيطرة على أدوات لنقل الكمية الميتوكوندريا من الخلايا المانحة لهذه الخلايا المستهدفة لتمكين دراسة دقيقة للآثار البيولوجية.

كان بروتوكول صفها هنا عملت أصلا لنقل الميتوكوندريا معزولة عن الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان إلى خط الخلايا السرطانية ملتصقة MDA-MB-2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INSERM (المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال)، والتي CJ وML.V. تنتسب، وقدمت طلب براءة اختراع تقنية MitoCeption (EP14306154.7).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر اندريا Parmeggiani (L2C وDIMNP، مونبلييه) وبينوا CHARLOT (IES، مونبلييه) وكذلك أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة، كريستوف Duperray للمساعدة في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومونبلييه منشأة RIO التصوير (MRI) لتوفير بيئة ملائمة لنظام مراقبة الأصول الميدانية والفحص المجهري متحد البؤر. وأيد البنك المركزي الماليزي من خلال زمالة الدراسات العليا من LabEx Numev (اتفاقية وكالة الاستخبارات الوطنية-10-LABX 20). وأيد AB من قبل الزمالة الجامعية من جامعة وارسو والاتحاد الأوروبي (رقم POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV هو عالم موظفين من المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم عزل الميتوكوندريا للأنسجة   ؛فيشر العلمية 10579663
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Supplement W / O VIT A (50x)Fisher Scientific 11500446
HBSS بدون Ca 2 + < / sup> بدون Mg < sup>2 + < / sup>  ؛ سيجماH4385
بولي هيم  سيجما P3932
aMEM ث / س الجلوتامينOzymeBE12-169F
DMEM / F-12 بدون الجلوتامينفيشر العلمي   ؛11540566
L-Glutamine   ؛Invitrogen 25030-024 
الجلوكوز سيجما G7021
Insuline سيجما أنا 1882  
الإنسان  bFGF R & D Systems233-FB-025
Human EGF Peprotech AF-100-15 
HeparinSigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
مثبط التربسينسيجما T9003
DNase ISIGMA 10104159001
التربسين 0.25٪ / EDTA 1  mMInvitrogen 25200056
TrypsinGibco 15090-046
مثبطات البروتياز خالية من EDTAسيجما4693159001
سيبروفلوكساسين  سيجما17850-5G-F
الفطريات Invivogenant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamycinEuromedexEU0410
MitoTracker Green FMMolecular ProjectsM7514
MitoTracker Red CMXRosMolecular Probes  M7512
MitoTracker ديب ريد FMالمجسات الجزيئية  M22426 
CellTracker الأخضر CMFDAالمجسات الجزيئيةC7025
CellTracker الأزرق CMF2HCالمجسات الجزيئيةC12881
RIPAسانتا كروزsc-24948
طبق ثقافة معقم FluoroDishأدوات الدقة العالميةFD35-100
مقياس الدمفيشر Scientific267110
أنابيب FACSBeckman Coulter2,523,749
جهاز FACSGallios   3L 10C
LC بدء تشغيل سريع DNA ماستر PLUS   ؛روش3515885001

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34(2014).
  4. Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
  5. Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55(2016).
  6. LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
  7. Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
  8. Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
  9. Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94(2013).
  10. Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
  11. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  12. Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
  13. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  14. Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
  15. Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
  16. Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
  17. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
  18. Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
  19. Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
  20. Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472(2015).
  21. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
  23. Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
  24. Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
  25. Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
  26. Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
  27. Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
  28. Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
  29. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
  30. Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
  31. Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073(2015).
  32. Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057(2016).
  33. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  34. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  35. Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
  36. Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
  37. Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
  38. Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة